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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
α 1，2-岩藻糖基转移酶基因的克隆及在
大肠杆菌中的表达
贾红红 李玉 刘逸寒 王尧 梁晓梅 路福平
(天津科技大学生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室，天津 300457)
摘 要: 利用 PCR方法从幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，HP)基因组 DNA中获得 α 1，2-岩藻糖基转移酶(α 1，2-fuco-
syltransferase，α 1，2-fuct)基因，得到大小为 906 bp的目的基因，将其定向插入到原核表达载体 pET-22b(+)中，得到重组表达
载体 pET-fuct。将重组表达载体转化到大肠杆菌 BL21(DE3)中，25℃，0. 1 mmol /L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达 4 h，
并用 SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明，可表达出相对分子质量为 33 kD的蛋白，与预期分子量一致，说明 α 1，
2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌 BL21 中实现表达，应用 HPLC法进行酶活检验，酶活达到了 13. 21 pmol /(mgPr·h)。
关键词: α 1，2-岩藻糖基转移酶 基因克隆 原核表达 大肠杆菌
Cloning and Expression of alpha 1，2-fucosyltransferase in E. coli
Jia Honghong Li Yu Liu Yihan Wang Yao Liang Xiaomei Lu Fuping
(Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，
Tianjin University of Science ＆ Technology，Tianjin 300457)
Abstract: A prokaryotic expression vector pET-fuct containing the gene of alpha 1，2-fucosyltransferase was constructed and ex-
pressed in E． coli BL21(DE3)． The fuct gene was amplified from the extracted total DNA of Helicobacter pylori by PCR，and was in-
serted into the prokaryotic expression vector pET-22b(+)to construct a recombinant expression vector pET-fuct． The expression of
fuct gene was induced by 0. 1 mmol /L IPTG at 25℃ for 4 hours，and SDS-PAGE analysis showed that protein with molecular weight of
33 kD was expressed in E． coli BL21． This protein had a specific activity of 13. 21 pmol /(mgPr·h)which was detected by HPLC．
Key words: alpha 1，2-fucosyltransferase Gene cloning Prokaryotic expression E． coli
收稿日期:2010-08-11
基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(20806060) ，天津市教委项目(20080601) ，天津科技大学引进人才科研启动基金项目
(20080435)
作者简介:贾红红，女，硕士，研究方向:微生物与生化药学;E-mail:jiahonghong850@ 163． com
通讯作者:李玉，女，博士，副教授，E-mail:liyu@ tust． edu． cn
近年来，随着食品工业和生物科技的快速发展，
功能寡糖的开发已成为国际生物技术领域的重要课
题，寡糖产业现已成为一个应用于食品、饲料、医药
和化工等行业的新兴重要产业。人乳低聚糖具有抗
病毒感染、增强免疫力及减少炎症等生理作用［1］，
作为一类特殊结构的糖类物质，其可作为上皮细胞
的可溶性受体类似物，参与母乳喂养婴儿的非免疫
防御体系的增强［2］。人乳低聚糖及其类似物由于
功能独特，安全、有效，不产生抗药性，并且还能抵御
对抗生素产生抗性的变异病原菌，以人乳寡糖及类
似物为原料制备抗黏附药物成为当前药物开发的又
一大热点，其在预防和治疗细菌性疾病领域及婴儿
营养保健方面必将发挥巨大的作用。目前关于人
乳寡糖的功能与制备研究在我国仍未得到有效开
展。我国对功能寡糖类物质的开发主要集中在对
天然植物和微生物多糖采用酸、碱、酶及氧化等化
学方法进行降解制备低分子量的寡糖，如壳寡糖、
果寡糖等。通过化学合成法获得人乳低聚糖，由
于合成路线的复杂以及糖苷供体的昂贵，大多数
工艺仍无法达到规模生产，成为化学法合成寡糖
不易逾越的障碍［3］。随着越来越多的糖苷酶及其
基因的不断解析和微生物代谢调控路线的不断阐
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
明，以及基因工程技术的迅速发展，通过合成低聚
糖生产过程所需的多种酶来大量合成低聚糖已成
为可能［4］。
本研究主要是利用 PCR 方法从幽门螺旋杆菌
(Helicobacter pylori，HP)基因组 DNA 中获得 α 1，2-
岩藻糖基转移酶基因，拟利用大肠杆菌高效表达系
统 pET系列［5］，对此基因进行高效表达，为利用甘
露糖这个比较廉价的原料合成人乳低聚糖奠定
基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株和质粒 幽门螺旋杆菌(Helicobacter py-
lor，HP)来自天津医科大学;大肠杆菌 BL21(DE3)、
大肠杆菌 DH5α、克隆表达载体 pET-22b(+)均为本
实验室保存。
1. 1. 2 试剂 胰蛋白胨(Tryptone)和酵母提取物
(Yeast Extract)购自英国 OXOID 公司;异丙基硫代
半乳糖苷(IPTG) ，甲基乙二胺(TEMED)购自 Sig-
ma公司;Taq DNA聚合酶、dNTPs、T4DNA 连接酶、
限制性内切酶 BamH I和 Hind III购自大连宝生物
公司;DNA分子量标准和纯化 DNA 片段的琼脂糖
凝胶回收试剂盒、蛋白质分子量标准等均购自上海
生物工程有限公司;试验所用引物由上海 Invitrogen
生物公司合成。
1. 2 方法
1. 2. 1 幽门螺旋杆菌基因组 DNA的制备 按照高
纯基因组 DNA 快速抽提试剂盒要求提取幽门螺旋
杆菌总基因组 DNA。质粒的提取方法参考文献［6］
所述方法进行。
1. 2. 2 PCR 扩增 根据 GenBank 报道的 Helico-
bacter pylori中 α 1，2-岩藻糖基转移酶(fuct)基因全
序列，设计如下引物。
上游引物 P1:5-CATGCCATGGATCCGATGGC-
TTTTAAAAGTGTGCAA-3，划线部分为 BamH I酶切
位点。
下游引物 P2:5-CCCAAGCTTGAGCTCTTAAG-
CGTTATACTTTTGGGATTT-3，划线部分为 Hind III
酶切位点。
以提取的幽门螺旋杆菌的总基因组 DNA 为模
板，以 P1，P2 为引物，扩增 fuct 基因。反应体系:
DNA模板 1 μL;引物 P1(10 μmol /L)1 μL;引物 P2
(10 μmol /L)1 μL ;dNTPs(2. 5 mmol /L)2 μL;10 ×
buffer 2 μL;Taq 酶 0. 5 μL;dH2O 12. 5 μL;总体积
20 μL。
反应程序:95℃ 5 min;95℃ 45 s，55℃ 50 s，
72℃ 60 s，30 个循环;72℃ 10 min。
1. 2. 3 原核表达载体 pET-fuct 的构建 将 PCR 产
物以及提取的质粒 pET-22b(+)分别用 BamH I 和
Hind III双酶切，酶切产物经纯化回收后，用 T4 DNA
连接酶于 16℃连接过夜，利用电转化法转入大肠杆
菌 DH5α中，通过氨苄青霉素抗性平板筛选转化子，
然后对转化子质粒分别用 PCR 和双酶切法进行鉴
定，并挑取阳性转化子进行测序，构建好的质粒命名
为 pET-fuct。
1. 2. 4 目的蛋白的诱导表达和 SDS-PAGE 分析［7，8］
将重组质粒 pET-fuct转化入表达宿主菌 E． coli BL21，
同时用载体质粒 pET-22b(+)转化入表达宿主菌
E． coli BL21 作为对照。分别挑取单菌落接种到 5
mL LB培养基中(含有 100 μg /mL Amp) ，37℃水浴
振荡培养过夜，按 1%接种量转接于装有 30 mL 培
养基的 250 mL 三角瓶中继续培养至 OD600达0. 6 －
1. 0，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为
0. 1 mmol /L，20℃诱导振荡培养 4 h 后，冷冻离心收
集菌体，SDS-PAGE 分析重组蛋白的表达。分离胶
的浓度为 10%，浓缩胶的浓度为 5%，考马斯亮蓝
染色。
1. 2. 5 目的蛋白表达量的测定方法 将诱导后的
全菌进行 SDS-PAGE，而后用 Fluor Chem 5500 凝聚
成像系统进行扫描凝胶，通过成像系统自带软件分
析目的蛋白占菌体总蛋白的含量。
1. 2. 6 目的蛋白在 E. coli BL21 中 IPTG 诱导表达
条件的优化 最佳诱导浓度的确定:挑取单菌落接
种到含氨苄青霉素(100 μg /mL)的 LB 液体培养基
中，37℃，180 r /min振荡培养过夜，按 1%的接种量
转接到含氨苄青霉素(100 μg /mL)的新鲜 LB 培养
基中继续培养至 OD600 = 0. 6 － 1. 0 时，加入不同浓
度(0. 05、0. 1、0. 25、0. 5、1. 0 和 1. 5 mmol /L)的
IPTG诱导表达，20℃，120 r /min 诱导培养 4 h 后收
集菌体，同时以含空质粒的表达菌作对照，SDS-
PAGE电泳分析，确定 IPTG最佳诱导浓度。
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2011 年第 3 期 贾红红等:α1，2-岩藻糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
最佳诱导温度的确定:在最佳 IPTG 诱导浓度
下，分别于 20℃、25℃、28℃、30℃和 37℃下诱导 4 h
收集菌体，进行 SDS-PAGE 分析，确定 IPTG 最佳诱
导温度。
最佳诱导时间的确定:在最佳 IPTG 诱导浓度
和最佳诱导温度下，分别于诱导后 2、3、4、5、6、7 和
8 h收集菌体，进行 SDS-PAGE分析，确定 IPTG最佳
诱导时间。
1. 2. 7 目的蛋白的可溶性分析 参照 1. 2. 4 的方
法，在最佳诱导条件下表达重组蛋白，诱导后冷冻离
心收集菌体，将菌体悬于 pH 值 7. 2 的磷酸缓冲液
中，冰浴超声破碎细胞，超声波功率为 400 W，超声
4 s，间歇 5 s，共 10 min。超声破碎后，12 000 r /min，
4℃离心 10 min，分别取上清和沉淀用于 SDS-
PAGE，检测蛋白的可溶性。
1. 2. 8 岩藻糖基转移酶活性检测［9］ 岩藻糖基化
转移酶能够特异的催化 GDP-岩藻糖转化成岩藻糖
基化寡糖，以 GDP-岩藻糖为底物，以构建好的 pET-
fuct /BL21 诱导表达后的细胞匀浆上清作为酶源。
反应体系中包括:0. 37 μmol /L 底物、20 mmol /L
MnCl2、1% Triton X-100、50 mmol /L 甲次胂酸盐-盐
酸缓冲液(pH5. 8)、0. 38 nmol /L 苯-β-D-半乳糖及
酶(0. 4 mg) ，总体积为 100 μL，混合液在 37℃下孵
育 1 h 后，用 300 μL 氯仿 /甲醇(2 ∶ 1，V /V)终止反
应，混匀，2 000 r /min离心 2 min，取上清进行 HPLC
检测，通过 HPLC 检测反应体系中底物的减少量和
产物的生成量间接计算岩藻糖基转移酶的酶活。
2 结果
2. 1 目的基因 fuct扩增
提取幽门螺旋杆菌基因组 DNA，以提取的基因
组 DNA为模板，并利用合成的特异性引物进行基因
扩增，扩增出的目的条带如图 1 所示，目的片段出现
在 750 － 1 000 bp之间，与报道的 906 bp相符合。
2. 2 重组质粒 pET-22b-fuct的构建及鉴定
将所得 fuct基因片段克隆入表达载体 pET-22b
(+)中(图 2) ，重组质粒 pET-fuct 经 BamH I 和
Hind III双酶切鉴定，小片段为1 000 bp左右目的基
因，大片段为 5 400 bp 左右的 pET-22b(+)载体
(图 3) ，表明目的基因已插入到 pET-22b(+)载
体上。
M. 1 kb DNA ladder;1． PCR产物(fuct)
图 1 目的基因的扩增
图 2 重组质粒 pET-fuct的构建
2. 3 测序结果
对含岩藻糖基转移酶基因的重组质粒 pET-
fuct /DH5α 进行核苷酸序列测定，所得到的基因全
长为 906 bp，测序结果与 GenBank 上报道的序列
一致。
2. 4 目的蛋白的表达
将重组表达菌 pET-fuct /BL21 与对照菌 pET-
22b /BL21均在 IPTG浓度为0. 1 mmol /L，20℃，120 r /min
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
M. 1 kb DNA ladder;1． PCR 产物(fuct) ;2． pET-22b
(+)/BamH I /Hind III;3． pET-fuct /BamH I /Hind III;4．
pET-fuct /BamH I
图 3 重组质粒 pET-fuct的酶切鉴定
的条件下进行诱导培养，诱导培养 4 h 后，离心收
集菌体，菌体处理后经 SDS-PAGE 分析结果。由图
4 可知，在分子量大约为 33 kD的位置泳道3 － 6 比
泳道 2 明显多出一条带，表达出蛋白的大小与预
期的一致，说明 fuct 基因在大肠杆菌中获得了成
功表达。
1． Marker蛋白分子量标准;2． pET-22b /BL21 对照菌株;
3 － 6． pET-fuct /BL21 重组菌菌株
图 4 重组表达产物的 SDS-PAGE分析
2. 5 最佳诱导条件的优化
2. 5. 1 IPTG 诱导量的分析 如图 5 所示，随着
IPTG的终浓度从 0. 05 mmol /L增加到 0. 1 mmol /L，
目的蛋白的产量显著增加，在 0. 1 mmol /L取得最大
值。但是随着 IPTG 浓度的进一步加大，蛋白的表
达量又很快的降低了，这是因为 IPTG 虽调控目的
蛋白的表达，但其是一种细胞毒性物质，高浓度的
IPTG会严重抑制菌体的正常生长，势必会影响目的
蛋白的生产。因此，最终选取 0. 1 mmol /L 为 IPTG
诱导目的蛋白表达的终浓度。
图 5 IPTG浓度对表达的影响
2. 5. 2 诱导温度的选择 大肠杆菌最适宜生长的
温度是 37℃，但菌体会生长太快，而表达的蛋白经
常会形成包涵体，在实际应用中，大量表达可溶性的
活性蛋白是优化的最终目的。因此，在确定了重组
菌在 IPTG 最佳诱导浓度 0. 1 mmol /L 的条件下，分
别于 20、25、28、30 和 37℃诱导 4 h 后取样，进行分
析，以确定最佳的诱导时间。菌体蛋白经分析表明，
在 25℃下诱导的目的蛋白的表达量最高(图 6) ，因
此确定最佳诱导温度为 25℃。
图 6 温度对蛋白表达的影响
2. 5. 3 诱导时间的选择 经过上述优化后，对菌
体的诱导时间进行进一步的确定。如图 7 所示，
在上述已确定条件下诱导 4 h后，重组蛋白的表达
量已接近峰值，虽然随着诱导时间的延长，表达量
有所增加，但是幅度明显变小，因此把诱导时间确
定为 4 h。
2. 6 蛋白的可溶性分析
构建的工程菌在 IPTG为 0. 1 mmol /L条件下，于
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2011 年第 3 期 贾红红等:α1，2-岩藻糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
图 7 诱导时间对蛋白表达量的影响
25℃培养诱导 4 h 后的可溶性情况如图 8 所示。在
以上诱导条件下，细胞裂解上清液中仅有少量蛋白，
细胞裂解沉淀物中则含量较高。这说明重组菌所表
达的蛋白主要以包涵体形式存在，且有一小部分以
可溶性形式存在。
M． Marker蛋白分子量标准;1．超声破碎后的沉淀;2．破碎后的
上清
图 8 目的基因的可溶性分析
2. 7 Fuct酶活力的测定
HPLC 法进行酶活分析表明，pET-fuct /BL21
作为酶源在整个发酵体系中可以与底物 GDP-岩藻
糖反应，生成 Phenyl-β-D-Gal-岩藻糖。说明 α1，2-
岩藻糖基转移酶对底物 GDP-岩藻糖有一定的活
性，且酶活达到了约 13. 21 pmol /(mgPr·h) ，而对
照反应体系中通过 HPLC 法进行酶活分析表明，反
应体系中底物的量几乎没有变化，且没有预期产
物的生成。
3 结论
人乳低聚糖作为一类特殊结构的糖类物质，
成为当今研究的一个热点，以人乳寡糖及类似物
为原料制备抗黏附药物成为当前药物开发的又一
大热点，其在预防和治疗细菌性疾病领域及婴儿
营养保健方面必将发挥巨大的作用。然而，目前
报道的化学合成法由于底物成本较高，合成条件
比较复杂等的限制，无法实现大规模的生产。随
着基因工程技术的迅猛发展和大肠杆菌、枯草芽
孢杆菌、酿酒酵母等高效外源基因表达系统的不
断完善，寡糖合成途径中的多种酶，如己糖激酶、
磷酸甘露糖变位酶、葡萄糖激酶、GDP-甘露糖 4，6-
脱水、以及 GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖 3，5-变旋酶 /4-
还原酶，α1，2-岩藻糖基转移酶等已获得高效表
达，这些酶可有效控制人乳寡糖合成的代谢过程，
大量合成各种所需的人乳寡糖。其中，以甘露糖
为出发点，经过磷酸化、异构化等作用最终合成人
乳低聚糖共需要 6 步反应 6 种酶，反应的最后一步
是 α1，2-岩藻糖基转移酶催化 GDP-岩藻糖最终转
变成岩藻糖基化寡糖，这使得人乳寡糖大量合成
成为可能［10］。
大肠杆菌是最早被用来生产重组蛋白药物的工
程菌，且其大规模发酵培养工艺比较成熟。以大肠
杆菌作为表达系统与其他表达系统相比，有着遗传
背景明确、安全性高、生长周期短和易于进行工业化
批量生产等优越性。本研究利用基因工程技术成功
地将来源于幽门螺旋杆菌的编码岩藻糖基转移酶的
fuct 基因克隆到大肠杆菌高效表达载体 pET-22b
(+ )上，构建重组表达质粒 pET-fuct，以 BL21
(DE3)为表达宿主菌，在 25℃，120 r /min，IPTG 的
终浓度为 0. 1 mmol /L的条件下进行诱导表达，SDS-
PAGE分析结果表明，已经实现了目的基因的表达，
对酶活性进行了检测，活力达到了 13. 21 pmol /(mg-
Pr·h)。
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(责任编辑 马鑫)
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