全 文 ：生物杖术通报
· 研究报告 · 召了口百付 口工口 年增刊
基因启动子克隆及进化分析
刘建民‘, 李运涛‘, 甘露 , , 李红 ‘, 果茂腾‘, ‘
’华中科技大学生命科学与技术学院资源生物学与生物技术研究所 , 武汉
,分子生物物理教育部重点实验室 , 武汉
摘 要 是一个重要的种子贮藏蛋白 , 它以组织特异性方式表达形成 。 以甘蓝型油 菜为材料 , 克隆 了
基因启动子 , 测序结果表明 , 该启动子全长 ,含有启动子特有的 一 等调控元件 。 系统进化分析
显示 ,拟南芥 、萝 卜、 白菜型油菜和甘蓝型油菜 基因启动子之间既具有较高的同源性 , 又存在一定的差别 。 通过
进化分析 , 指导我们在油菜脂肪酸改良过程中 ,采用不同的启动子在脂肪酸改良方面可能起到不 同的效果 。
关键词 甘蓝型 油菜 基因启动子 基因克隆 进化分析
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油菜是我国继水稻 、小麦 、玉米和大豆之后的第
五大农作物 , 种植面积和产量均占世界第一位 ,是我
国最重要的食用植物油来源 。 油菜种子脂肪酸组成
的改良是目前油菜品质改良的重要 目标之一 , 而利
用基因工程手段改良油菜脂肪酸组成是 目前研究的
热点 。 na p in 是甘蓝型油菜的一个重要的种子贮藏
蛋白 , 占种子蛋白总量的 20 % 一 30 % , 具有组织特
异表达的特点川 。 研究表明甘蓝型油菜 、芥菜型油
菜、白菜型油菜和甘蓝等的种子中都有 na pin 蛋白
的存在 。 利用 na pin 种子特异表达启动子调控 目的
基因 , 可以使目的基因在种子中得到特异表达〔’一 6 〕,
因此 , na p in 种子特异表达启动子在油菜脂肪酸成分
改良方面有广泛的应用前景 。 在油菜脂肪酸改良过
程中 , 提高油菜中不饱和脂肪酸的含量和种类是世
界研究的重要方向之一 。 目前 , 在国家 “ 8 63 ”计划
的资助下正在通过分子设计育种的方法对现有的甘
蓝型油菜品种进行改良。 脂肪酸主要是在种子中合
成的 , 因此在转基因的过程中在要转移的基因前面
连接种子特异表达的启动子十分重要 。 我国种植的
油菜品种中 ,甘蓝型油菜因具有高产 、稳产和高含油
量的特点 ,种植面积占有绝对优势 。 为了实现在种
子中特异表达相关不饱和脂肪酸这一 目标 , 以甘蓝
型油菜秦油 7 号为材料 , 利用同源序列法克隆了
na pin 种 子特异 表达启动子 , G en B an k 登录号为
E U723261 , 通过 Blastn 比对分析 , 进一步构建 napin
种子特异表达启动子进化树 , 为研究其进化关系提
供理论支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料
两个甘蓝型油菜品种被用于 na pin 启动子的克
基金项目:国家高技术研究发展计划项 目(Zo 7 A 10 zl2 0)
作者简介:刘建民( 19 79一 ) , 男 , 河南都陵人 , 在读博士研究生 , 主要从事植物生物技术研究 , E 一 m ail : fei 石an 萝18 19 @ yah o .co m .cn
通讯作者:栗茂腾(19 72一 ) , 男 , 山东苍山人 ,博士 , 副教授 , 主要从事植物基因组学和植物生物技术研究 , E 一m ail : h m ao t en 舒26 @ 163 .co m
年增刊 刘建民等:n即in 基因启动子克隆及进化分析 189
隆 , 分别为为秦油 7 号和 功725 , 其中秦油 7 号种子
由国家油料改良中心陕西分中心李殿荣研究员惠
赠 , 功725 为本实验室保存。
K o D p l u s 高保真酶购于 Toy o B o 公司 , 引物由
上海生工生物工程技术服务有限公司合成 , D L5 0 0
m
ark
e : 购于天根生化(北京)科技有限公司 , 大肠杆
菌 D H S。 为本实验室保种 , p M D 1 8 一T S i m p l e V e e t o r
购于 TaK aR a 公司 , 各种限制性内切酶为 Ferm entas
产品 , 凝胶回收试剂盒购于上海申能博彩生物科技
有限公司;其他为进口试剂或者国产分析纯 。
1
.
2 方法
1.2. 1 油菜基因组总 D NA 提取 参考文献〔7] ,
以甘蓝型油菜秦油 7 号种子为材料 , 采用 SDS 法快
速抽提总 D N A , 利用 B ECK M A N75 0 型核酸蛋白紫
外分析仪对提取的 D NA 质量和含量进行测定 。
1
.
2
.
2 P e R 扩增 参考 Josefs son 等[8]提交序列
(G en Ban k 登录号为J0 2798 )设计引物 , 设计引物时
在两条引物的5 ’端分别引人 Hi nd l 和 Nc 。 I 位点 。
具体设计的引物序列如下 :
naP F S ‘一C G A A G C I , r r C 竹CATCGGT GAT GAT-3’ Hi nd nl
n a P R S
’一
G C C C A T G
GT GT
A T G I
’
l
’
l
’
l
’
l人A T C竹G-3’ J喻。 I
P C R 扩增程序为:95 ℃ 预变性 5m in , 94 ℃ 变性
15 5 , 5 0 ℃ 退火 15 5, 6 8 ℃延伸 lm in 10 5 , 共30 个循
环 , 扩增产物经 0.8% 的琼脂糖凝胶进行电泳分离 ,
用凝胶回收试剂盒回收目标片段 。
1
.
2
.
3 T
一
A 克隆及测序 把回收的 目标片段进行
加 A 反应 , 参考 pM D 18一T S i m p l e V e e t o r 说明书 , 反
应产物直接用于 T 一A 载体的构建 , 构建的重组载体
命名为 pM D1 8 一na p 转化感受态细胞 D H 5a , 挑取白
斑进行培养 , 用菌液做模板进行 PC R 扩增 , 同时抽
提质粒用 Hi nd l 和 Nc o l双酶切验证克隆子 , 阳性
克隆送北京三博远志生物有限责任公司测序 。
1
.
2
.
4 na p in 基因启动子进化分析 克隆到的 na p-
in 基 因启 动 子 序 列 提 交 Ge nBan k (序 列 号 为
EU 723261) ,通过 Blastn 找到已提交的 napin 基因启
动子序列 , 用 cl us 饮1 . 81 [0] 进行比对分析;再利用泊
松校正(Po ssion 。o re e t s o n ) 法 , 用 M EG A3 [’。〕软件将
最终比对结果进行临近连接(N eighbor一 J i o n i n g ) , 生
成 na pin 基因启动子序列的进化树 , 进化树分支上
的置信度通过 1 00 次自展重复计算获得 。
2 结果与分析
2.1 油菜基因组 D N A 提取
秦油 7 号和 ID 725 的种子 D N A 经过 SD S 方法
提取 , 总 D N A 经 0.8% 的琼脂糖凝胶电泳后进行了
检测 , 结果显示提取的 D NA 呈唯一条带 , 且无拖尾
现象 。 核酸蛋白紫外分析仪检测显示两种甘蓝型油
菜 DNA 的 0 D 2。/ O D 28 。均介于 1.82 一 1 . 94 之间 ,
D N A 浓度平均为 10林岁闪 , 说明提取的 D NA 质量和
含量都较好 。
图 1 甘蓝型油菜 nap in 基因启动子的克隆
及 pM D 18 一n a p 双酶切验证
注 :M :D巧以刃; C K :空白对照;na p :naP in 基因启动子 ;
: pM D1 8 一n 叩 双酶切
2 .2 P C R 扩增结果分析
利用从两种甘蓝型油菜 中提取的基因组 总
n NA 为模板 , 用引物 napF 和 napR 对 napin 基因启
动子进行了 PC R 扩增 , 在两种甘蓝型油菜中得到目
标条带的分子量大小相 同 , 均为 1 10 帅 左右 (图
IA ) 。
2
.
3 T
一
A 克隆及刚序
目标条带回收后 , 用加 A 反应液对 PCR 产物进
行加 A , 然后构建 T 一 A 克隆 , 转化后挑取白斑进行培
养 , 用菌液扩增和质粒酶切 (图 IB )的方法鉴定阳
城物杖术通稚 B iote chn ology 2008 年增干11
性克隆子 。 测序结果表明 ,两种甘蓝型油菜的 na pin
基因启动子片段的大小长度一致 , 均为 1 135帅 , 结
构分析显示克隆的启动子含有启动子特有的 TAT A -
bo x , C A A T 一 bo x , ( C A ) n 等调控元件。 本实验所选取
的两种甘蓝型油菜品种的启动子的序列只出现两个
碱基的差别 。
2
.
4 na p in 基因启动子进化分析
通过 bl as tn 分析 , 在 NCBI 数据库中 , 与芸苔属
植物 na pin 基因启动子具有同源性的拟南芥相关序
列片段共有 4 条 , 序列分析显示 ,这 4 条序列的同源
性达 100% 。 为了对拟南芥该片段和甘蓝型油菜及
其原始亲本进行 比较 , 我们对甘蓝型油菜 、白菜 、甘
蓝的 na pin 基因启动子以及拟南芥中的对应片段进
行了 Clus tX 分析(图 2) 。 结果显示在甘蓝型油菜 、
白菜 、甘蓝以及拟南芥对应的同源区段内同源性分
别达到 8 % 、 80 . 6 % 和 8 .3% 。 这和拟南芥基因组
和甘蓝型油菜 、白菜和甘蓝的基因组同源性基本相
同。
为了充分地研究芸苔属中不同物种 na p in 基因
启动子同源性关系 , 对 NC BI 上可 以搜索到的所有
的 nap in 基因启动子进行了聚类分析 , 共搜索到甘
蓝型油菜 na pin 基因启动子序列 7 条 ,芥菜性油菜 1
条 , 白菜型油菜和甘蓝分别为2 条和 1 条 。 加上克
隆的 2 条 ,共对 13 条序列进行了分析 。 由于甘蓝型
油菜 、芥菜型油菜 、白菜型油菜和甘蓝均为芸墓属作
物 , 且白菜和甘蓝是甘蓝型油菜的原始亲本 , 因此它
们之间的遗传距离比较短 。 临近连接算法是应用最
广泛的基于距离的算法 , 尤其在进化距离很短的时
候 , 它能产生合理的进化树(图 3) 。 有图 3 可 以看
出 , 13 条序列可以分为分为两大类群 , 其中甘蓝 、多
数的甘蓝型和油菜芥菜型油菜其它聚为一个类群 ,
可以看出几个甘蓝型油菜品种的 nap in 基因启动子
(J0 2798 , E U 7 2 3 2 6 1 , B n x , E U 4 1 6 2 7 9 , E F 6 2 7 5 2 3 )
的同源性很高 , 均达到 9 % 以上的同源性 ;芥菜型
油菜(X6 7833) 和甘蓝型油菜之间同源性为 98 % 以
上的同源性 ;甘蓝 (X7 0333) 相对稍远 , 但其和甘蓝
型油菜之间的同源性也达到 90 % 左右 。 甘蓝型油
菜的 napB 启动子 (X5 8142 )与其它的 napin 启动子
之 间 的进 化 距 离 相 对 较 远 , 而 na pB 启 动 子
(x 1449 2) 与其它的启动子的距离就很短 , 说明不同
的 na pB 启动子之间也存在一定的差别 。 白菜型油
菜的 napin 启动子(Y 131OS 和 M 64 632 )与甘蓝型油
菜的 Bc NAI (AF3 02 26 1)启动子聚集为另一类群 , 说
明在物种进化过程中 ,甘蓝型油菜的 BcN A I 启动子
可能是由甘蓝型油菜的 na pin 启动子与白菜型油菜
的 na pin 启动子发生交换而形成的 , 从进化分支上
还可以看出 , 不同白菜型油菜品种的 na pin 启动子
之间的同源性也存在一定的差别 。 从整个的进化图
来看 , 可以明确的认为甘蓝型油菜是由白菜和甘蓝
形成的。
3 讨论nap in 启动子在作物脂肪酸代谢的基因工程应
用中有重要的理论和实际意义 , 但启动子关键部位
的改变可能会导致转录因子结合部位的改变 , 甚至
转录因子不能结合到启动子上 面 , 导致基因不能转
录川 。 不同的启动子结合转录因子的效率和引起
转录的效率也不相同 。 油菜遗传转化上应用较多的
启动子大部分属于组成型启动子 , 其缺点是由于组
成型表达 ,会对油菜的正常生长造成不良影响 , 使改
造后的油菜农艺性状较差 。 用 na pin 启动子连接外
源基因进行转化时 , 不会对油菜的正常生长造成影
响 , 而且可以使产物在种子中特异性表达 。 秦油七
号由陕西省杂交油菜研究中心育成 , 是高产 、双低优
质杂交油菜品种 , 含油量达 43 % , 在我国黄淮 、长江
流域有广泛的种植 〔’‘马。 以秦油七号为材料 , 克隆了
其 na pin 基因启动子 , 为将该启动子连接其它脂肪
酸合成相关基因导人油菜中使基因在油菜种子中特
异表达奠定了基础 。 同时 , 首次对 na pin 基因启动
子进行了系统进化分析 , 甘蓝 、芥菜型油菜 、 白菜型
油菜与甘蓝型油菜中的 na pin 基因启动子存在较高
的同源性 , 同一物种之间的同源性更高 ,但不同品种
之间的 nap in 基因启动子仍有差别 。 因此 , 不同的
na pin 基因启动子在种子脂肪酸合成过程中起到的
作用大小也会有所不同。 通过进化分析 , 可 以指导
我们在通过基因工程手段进行油菜脂肪酸改良时 ,
根据用不同的 na pin 基因启动子在促进外源基因表
达方面表达量的不同 , 筛选转录能力强的启动子 , 进
一步使通过基因工程技术改良油菜脂肪酸的组成具
有实际应用的潜能和价值 。
盆物技术通稚 B 勿te chn 。勿盯 B “le 血 2008年增刊
物多样性影响很小或没有影响 。 转基因油菜 “超油
1号 ” , 转入的an ti 一 p eP 基因 , 以之通过底物抑制来
提高油菜油含量和芥酸含量 , 不改变油菜基本的生
长发育和生存特性 , 属改良品质一类转基因植物;对
农田生态系统的生物多样性(包括昆虫)的影响很
小或没有影响 。
参 考 文 献
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B r M 6 4 6 3 2
0 .0 8 0 .0 6 0 .04 0
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不同芸苔属的 nap in 基因启动子的系统进化分析
参 考 文 献
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