全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
分子标记技术在烟草种质资源研究中的应用进展
尚志强
(云南省烟草农业科学研究院,玉溪 653100)
摘 要: DNA分子标记作为新发展起来的一种遗传标记形式,凭借其可靠有效等优点, 在农业科学研究中的应用越来
越广泛。综述了几种分子标记技术 ( RAPD、AFLP、ISSR )在烟草种资源中的应用进展, 分析了分子标记技术在烟草种资源及遗
传多样性研究中存在的问题及今后发展方向。
关键词: 分子标记 烟草 种质资源
Progress of the Application ofM olecularM arkers in Tobacco
Research Related to Germplasm Resource
Shang Zhiqiang
( Yunnan A cademy of Tobacco A gricultural Sciences, Yux i 653100)
Abstrac:t DNA mo lecu larm arker is increasing1y has been used in ag ricu lrura l research. The app lication and deve lopm ent ofm o
lecu la rm arkers, including RAPD, RFLP, ISSR. In th is paper, the current advance of tobacco germ plasm research w as presented, and the
perspec tive and the question of m o lecularm arkers application in tobacco d iversity in the futurew ere discussed.
Key words: M olecu lar ma rker Tobacco Germ p lasm resource
收稿日期: 20091120
基金项目:云南省烟草专卖局 (公司 )资助项目 ( 04A10 )
作者简介:尚志强,男,助理研究员,主要从事烟草育种与栽培研究; Em ai:l zhqshang@ yn tst.i com
烟草 (N icotiana tabacum )为茄科属一年生或多
年生作物。经过多种生态环境条件的驯化和人工选
择培养,以及不断地从国外引进,已形成丰富多彩的
品种资源。但对烟草种质资源深度研究不够, 创造
利用较少,烟草育种面临亲本匮乏,品种遗传背景狭
窄,肓目性、重复性大等问题 [ 1]。遗传多样性是一
个需要用种、变种、亚种或品种的遗传变异来衡量其
内部变异性的概念, 遗传多样性为物种和个体的适
应及进化提供原料。DNA分子标记技术有肋于从
本质上揭示物种遗传变异及其变异规律。因此从发
子水平上揭示烟草遗传资源多样性及其亲缘关系,
建立分子标记辅助育种技术体系非常必要。
DNA分子标记是 DNA水平上上遗传多样性的
直接反映, DNA水平上遗传多样性表现为核苷酸序
列的任何差异。因而, DNA分子标记在数量上几乎
是无限的,其主要优点是无表型效应,不受环境影响
等。目前, DNA分子标记已广泛应用于作物种资源
源遗传图谱构建,基因定位, 和分子标记辅助选择等
方面 [ 2]。在烟草质资源研究应用的分子标记主要
有 RAPD、AFLP、ISSR。研究采用分子标记技术对不
同来源的烟草种质资源的遗传多样性和亲缘关系进
行研究,以期从分子水平为烟草品种鉴定、遗传分
类、品种布局及合理选配亲本等提供科学依据 [ 3]。
1 DNA分子标记的概念
遗传标记是指与目标性状紧密连锁, 同该性状
共同分离且易于识别的可遗传的等位基因变异, 是
基因型的特殊的易于识别的表现形式。目前遗传标
记主要有形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记
4种类型。前 3种标记是对基因的间接反映, 而
DNA分子标记是 DNA水平遗传变异的直接反映。
2 DNA分子标记的类型
DNA分子标记大多以 DNA片段的电泳谱带形
式表现,依其遗传特性可分为显性和共显性两种;依
其多态性检出所用的分子生物学技术,大致可分为
2010年第 3期 尚志强:分子标记技术在烟草种质资源研究中的应用进展
3类,包括以 Southern杂交技术为核心的分子标记
技术, 如 RFLP; 以 PCR技术为核心的分子标记技
术,如随机扩增多态性 DNA ( random amplif ied po ly
morph ic DNA, RAPD )、扩增片段长度多态性 ( amp li
fied fragment length po lymo rph ism, AFLP) ;以 DNA重
复序列的标记为核心的分子标记技术 。这 3类分
子标记的划分不是绝对的, 有的分子标记介于第一
和第二类之间,有的是两种技术的结合;有的把第三
类归于一、二类中。
3 分子标记在烟草种质遗传多样性研究中
的应用
31 烟草基因组 RAPD标记的遗传多样性研究
W illiams
[ 4]和W elsh等 [ 5]通过利用随机引物扩
增基因组 DNA来寻找具有多态性的 DNA片段,并
将这一方法命名为随机扩增多态性 DNA ( random
amplif ied polymorphism DNA, RAPD )。相对于传统
的酶学、RFLP等方法, RAPD具有最快速、简便, 无
需预知受试基因组 DNA序列等优点, 并且避免了
放射性同位素的污染。RAPD标记还可以对那些
RFLP难以区分的基因组区域作遗传连锁图。但
RAPD标记也存在某些不足,其中最主要的是其重
复性不太令人满意; 另外, RAPD标记难以区分开
杂合子和纯合子基因型。RAPD尽管比 RFLP、VN
TR等检测方法诞生的晚, 但由于其具有以上特
点, 而被广泛地应用于群体间遗传关系的确定以
及分析 RAPD标记和数量性状座位 ( QTL)的连锁
关系。
RAPD技术已成功地应用于鉴定一系列烟草基
因,以及这些基因在烟草育种中的调控。随着这些
新技术在农业研究中不断发掘利用, 将会大大加快
烟草育种速度与进程。肖炳光等 [ 6]利用 RAPD标
记研究了 29个烤烟品种的分子指纹和遗传关系。
100个随机引物经 10个品种筛选, 选 18个随机引
物,利用这些引物对 29个品种基因组 DNA扩增,得
到了 29个烤烟品种的分子指纹图谱, 参照这些图
谱,对不同烤烟品种进行真实性鉴定, 以扩增到的
79条多态性为基础, 计算 29个品种间遗传相似系
数,利用 UPGMA法作聚类图, 可将参试品种分为 3
个类型群, 其中云南省主栽烤烟品种 K326与近年
选育的 V2、云烟 87和云烟 317等归为一类;北方烟
区主栽品种 NC89、地方品种净叶黄及 G140归为一
类。汪志德等 [ 7]对 24个不同类型烟草核心种质进
行了 RAPD标记, 通过聚类分析, 将 24个种质分为
6大聚类群,类群 包括 K326、红花大金元、大白筋
599、TN90等 11个种质; 类群 !包括 NC82、B21、
Md609等 9个种质;类群 ∀、#分别包含晒烟、黄花
烟各一个; ∃、%为两个野生种。各类群遗传差异由
大到小顺序为 % > # > ∃> ∀ > ! > 。
32 烟草种质资源的 AFLP分析
扩增片段长度多态性 ALFP( amplif ied fragment
length po lymorph ism )是 1992由 Zabeau和 Vos发展
起来的新一代分子标记技术, 其本原理是对基因
DNA进行双酶切,酶切片段与含有与其共同粘性末
端相连接,分别选择在 3&末端分别添加 1- 3个选
择性碱基的不同引物,选择性的识别具有特异配对
顺序的酶切片段并与之结合,从而实现特异性扩增。
它结合了 RFLP和 RAPD的优点, 既具有前者的可
靠性又具有后者的方便性。杨友材等 [ 3 ]对 48份烟
草材料的基因组 DNA进行选择性扩增, 共获得 321
条扩增带, 其中 174条具有多态性。对 AFLP扩增
结果采用 UPGMA法进行聚类分析, 可以将 48份烟
草资源分为两大类群,即黄花烟草群和普通烟草群,
48份材料的遗传变幅为 141 - 110之间。杜传印
等 [ 8]利用 AFLP荧光标记技术, 采用 8对 E + 3和
M + 3引物组合对 39份来自不同国家的烤烟种质的
亲缘关系进行分析。 8对引物共产生 901条谱带,
其中 813条呈多态性, 多态性条带百分率达 90%;
39份材料之间的遗传相似系数在 051- 089,当相
似系数为 075时,可以将全部试材分为 6类。 8对
引物能将 39份烤烟种质完全分开;聚类结果表明烤
烟种质具有较近的亲缘关系, 供试材料间的聚类与
地理来源没有相关性。
33 ISSR标记在烟草种质遗传多样性与亲缘关系
中的研究
ISSR标记是 Zietkiew icz等 [ 9]提出的一种 DNA
分子标记,由于其在 SSR的 3&端或 5&端锚定 1- 4个
简并碱基,所用的引物序列比 RAPD的引物序列长,
退火温度较高,不但具有 RAPD技术的优点,又可克
服 SSR和 RAPD技术的缺点。祁建民等 [ 10, 11]采用
ISSR标记,对烟草属 4个种 30份材料的遗传多样
59
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
性进行了分析。从 70个 ISSR引物中共筛选取出
16个多态性明显、条带清晰、反应稳定的引物,对 30
个样品 DNA共扩增出 309条谱带,平均每个引物扩
增出 1931条带, 多态性条带比率 ( PPB ) 9320%。
种间遗传相似系数在 026- 096之间, 表现出丰富
的遗传多态性。
34 遗传连锁图谱的构建
遗传图谱是烟草品种资源、遗传育种及分子克
隆等许多应用研究的理论依据和基础, 遗传图谱的
构建是基因组研究中的重要环节, 可为基因定位与
克隆及基因组结构和功能的研究打下基础。与经典
遗传作图相比,分子标记技术是构建遗传图谱的一
种较为简便快捷的理想方法。L in等 [ 12]利用来自烟
草野生种间杂交 (N. p lumbag inifo lia /N. Long if lora )
所获得的 99个 F2植株进行遗传连锁分析,采用 69
个 RFLP标记和 102个 RAPD标记构建了包括 9个
主要连锁群、总长度为 1 062 cM的第一张烟草种间
杂交分子标记遗传连锁图谱。N ish i等 [ 13]利用 125
个白肋烟 DH 系所组成的 DH 群体, 采用 117个
AFLP分子标记构建了包含 10个连锁群的第一张白
肋烟 AFLP遗传图谱, 其总长为 383 cM,标记间平均
遗传距离为 33 cM。 Julio等 [ 14]利用 114个烤烟重
组自交系采用 ISSR、AFLP和 SSAP等标记构建了一
张烤烟分子遗传连锁图谱, 该图谱共 18个连锁群,
包括 138个分子标记, 总长 7076 cM。 B indler
等 [ 15]利用烟草草基因组计划中的基因组序列所开
发的 SSR标记基于 186个 F2植株构建了一张烤烟
的分子遗传连锁图谱, 该图谱共 24个连锁群, 293
个 SSR标记, 总长为 1 920 cM。 2006年, 肖炳光
等 [ 16]利用由 137个烤烟 DH系组成的作图群体,采
用 10个 ISSR标记和 147个 RAPD标记构建了国内
第一张烤烟分子遗传锁图谱, 包括 27个连锁群,总
长度 1 8382 cM, 标记平均遗传距离为 141 cM。
马红勃等 [ 17]利用由烤烟和白肋烟杂交而来的 187
个 F2单株组成的作图群体采用 SRAP标记和 ISSR
标记构建了一张包含 26个连锁群、112个标记、总
长度为 1 5602 cM的遗传图谱。蔡长春等 [ 18]利用
DH群体采用 AFLP和 SRAP标记构建了国内第一
张白肋烟分子遗传连锁图谱, 包括 22个连锁群,总
遗传长度为 1 9536 cM。
4 问题和展望
41 问题及解决途径
目前在烟草中应用的分子标记大部分为 RAPD
标记,而近年来发展起来的新型分子标记在烟草中
的应用较少。现有的烟草育种使用的亲本主要是
K326、红花大金元、G28、NC82、NC89净叶黄等品种
的血缘,导致了中国育成的烤烟品种的遗传基础日
益狭窄,因此要进一步收集种质资源,有待于开发新
型分子标记,大力开展分子标记在烟草中的应用研
究, 建立并优化相应的分子标记应用体系,为烟草研
究提供更为精确的遗传标记。
在烟草有益基因已有分子标记中, 标记和目的
基因间的遗传距离普遍较大, 难以有效应用于育种
实践,且与目的基因完全连锁的标记少,影响基因检
测的准确性。因此,应进一步筛选紧密连锁或分离
的标记,以准确地检测有益基因, 提高育种的选择
效率。
目前各种分子标记技术均有不同程度的缺点,
这使得大规模应用分子标记技术辅助选择育种受到
一定限制,所以今后应开发共显性、多态性高、重复
性稳定性好、简单易用、自动化程度高的新型理想分
子标记技术,为普及应用分子标记辅助选择 (MAS)
提供技术支持。分子标记技术在烟草品种选育中没
有得到充分运用, 比如一些重要性状, 如抗病性、高
香气等品质性状遗传规律的研究鉴定尚不够全面系
统, 在功能基因定位、基因工程等方面的研究尚未有
突破性进展。
42 展望
目前, 我国收集保存的烟草种质资源中蕴含了
大量的有益基因, 如何将这些基因有效地利用于育
种实践中,发挥它们在优质抗病育种中的作用是一
个亟待解决的问题。如果能够大量筛选与目标基因
紧密连锁的分子标记,并将这些标记运用于遗传育
种的早期辅助选择中,就可以大大提高目标基因的
转移选择效率,同时也可为目的基因的分离、克隆奠
定基础。烟草野生近缘种是一个巨大的基因宝库,
通过野生近缘种的远缘杂交进行种质创新, 是育种
工作取得突破的途径之一。在远缘杂交中, 分子标
记不仅可以精确检测外源染色体, 而且可以广泛地
揭示外源染色体与栽培物种染色体的部分同源关
60
2010年第 3期 尚志强:分子标记技术在烟草种质资源研究中的应用进展
系,这对有效转移外源基因具有十分重要的意义。
烟草的大多数重要农艺性状均表现为数量性状,如
产量、成熟期及品质等。分子标记技术的发展使得
人们能够将数量性状分解成易为遗传育种者操作的
单个位点即 QTL进行研究。所以应尽快开展烟草
重要农艺性状的 QTL定位研究,建立 QTL和分子标
记之间的连锁关系, 以便育种者们能利用分子标记
对数量性状进行选择,提高育种选择的效率。
遗传连锁图谱既是遗传学研究的重要内容,又
是种质资源、育种及基因克隆等许多应用研究的依
据和基础。烟草中可用于作图的形态标记少之又
少,所以,分子标记技术就成为构建烟草遗传连锁图
不可或缺的强有力工具。迄今为止, 国内外尚未有
烟草遗传连锁图谱的报道。因此, 构建烟草高饱和
度遗传连锁图谱是国内烟草研究者的当务之急。
参 考 文 献
[ 1] 艾树理.我国烤烟育种进展与问题的探讨.中国烟草科学, 1999
( 1) : 4446.
[ 2] Ju lio E, Verrier JL, Dorlhac de Borne F. Developm en t of SCAR m ark
ers l inked to th ree d isease res is tan ces based on AFLP w ith inN icoti
ana tabacum L. . Th eoretical and App lied Gen et ics, 2006, 112:
335346.
[ 3] 杨友才,周清明,尹晗琪,朱列书.烟草种质资源的遗传多样性及亲
缘关系的 ALFP分析.中国农业科学, 2006, 39( 11): 21942199.
[ 4] W ill iam s JGK, Kubelick AR, L ivak K J et a.l DNA polymorph ism s
am p lified gy arb itrary prim ers are u sefu l as geneticm arkers. Nucleic
A cid Res, 1990, 18: 65316535.
[ 5] W elsh J, M cC lellandM. F ingerprin t ing genom es us ing PCR w ith ar
b itrary prim ers. Nucleic A cid Res, 1990, 18: 72137218.
[ 6] 肖炳光,卢江平, 卢秀萍. 烤烟品种的 RAPD分析. 中国烟草学
报, 2000, 6( 2 ) : 1015.
[ 7] 汪志德,牟建民,戴培刚, 等.部分烟草核心种质 RAPD分析.中
国烟草学报, 2003, 9( 4 ): 2026.
[ 8] 杜传印,王玉军,李斯深,等. 39个烤烟种质亲缘关系的 AFLP分
析.中国农业科学, 2008, 41 ( 9) : 27412747.
[ 9] Z ietk iew icz E, Rafalsk iA, Labud a D. Gen om e f ingerp rint ing by sim
p le sequence rep eat( SSR ) an chored polym erase cha in react ion am
p lif icat ion. Genom ics, 1994, 20: 176183.
[ 10] 祁建民,王涛,陈顺辉,等.部分烟草种遗传多样性与亲缘关系
的 ISSR标记分析.作物学报, 2006, 32( 3 ): 373378.
[ 11] 梁景霞,祁建民,方平平,等.烟草种质资源遗传多样性与亲缘
关系的 ISSR聚类分析.中国农业科学, 2008, 41( 1) : 286294.
[ 12] L inTY, Kao YY, L in S, et a.l A genetic linkage map ofN. p lumb ag
in ifolia/N. Longif lora based on RFLP and RAPD m arkers. Theor
A pp lG enet, 2001, 103: 905911.
[ 13] N ish i T, Taj ima T, Noguch i S, et a.l Iden tif icat ion of DNA markers
of tob acco linked to bacterial w ilt resistance. Theor App l Gen et,
2003, 106: 765770.
[ 14] Ju lio E, DenoyesRoth an B, V errier JL, D orlh ac de Borne F. Detec
tion ofQTLs linked to leaf and sm ok e p ropert ies inN icotiana taba
cum b ased on a s tudy of 114 recom b inant inbred lin es. M ol Breed,
2006, 18: 6991.
[ 15] B ind ler G, Ru tger van derH oeven, Cunduz I, et a.l A m icrosatellite
m arker based link age m ap of tobacco. Theor App l G enet, 2007,
114: 341349.
[ 16] 肖炳光,徐照丽, 朱军,等.利用 DH 群体构建分子标记记遗传
连锁图.中国烟草学报, 2006, 4: 3540.
[ 17] 马红勃,祁建民,李延坤,等.烟草 SRAP和 ISSR分子遗传连锁
图谱构建.作物学报, 2008, 41( 1 ) : 286294.
[ 18] 蔡长春,柴利广,王毅,等.白肋烟分子标记遗传图谱的构建及
部分性状的遗传剖析.作物学报, 2009, 35( 9) : 16461654.
61