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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
转基因表达 OPH提高番茄果实降解有机磷
农药能力的研究
赵杰宏 1  赵德刚 1  韩洁2
( 1贵州大学农业生物工程省重点实验室,贵阳 550025; 2贵阳中医学院基础部微生物教研室,贵阳 550002 )
  摘  要:  拟通过基因工程提高番茄果实降解有机磷农药残留的能力。构建了 E8启动子基因驱动有机磷降解基因
( OPD )的植物表达载体 pSE8OP, 经农杆菌介导遗传转化番茄子叶后, 进行 GUS染色、PCR和 Southe rn b lotting分析。证明 OPD
基因已整合进转基因植株基因组中,为 1个拷贝。H PLC比较分析发现, 转基因番茄果实能显著提高降解毒死蜱和对硫磷的
能力, 大大减少了番茄中的农药残留。
关键词:  遗传转化  有机磷水解酶 ( OPH ) 农药残留  毒死蜱  对硫磷
Transgenic Expressing OPH to Enhance the Detoxifying Activity of
Tomato Fruit on Organophosphorous Pesticides
Zhao J iehong
1  Zhao Degang1  Han J ie2
(
1
Guizhou K ey Lab of AgriculturalB ioengineering, Guizhou University, Guiyang 550025;
2
Lab of M icrob io logy, Guiyang College of T raditional ChineseM edicine, Guiyang 550002)
  Abstrac:t  In order to enhance the deg rading ab ility o f tom ato fru it on organophosphorous pestic ides, w e have constructed a plant
expression vecto r o f OPD genewh ich w ere dr iven by E8 prom oter g ene. Then the OPD genew as transformed into tom ato coty ledons. It
w as confirm ed pre lim inar ily that the OPD gene has been integ ra ted into the genom e of transform ed tom ato w ith one copy by GUS sta i

n ing, PCR and Southern blotting detection. The degrad ing capability o f transgen ic tom ato on parath ion and chlopyr ifos w as significant
im proved ana lyzed by HPLC. It would decrease the pestic ide residues in toma to fruit g rea tly.
Key words:  Gene tic transform ation Organophospho rus hydrolases ( OPH )  Pesticide res idue Chlopyr ifos Parath ion
收稿日期: 2010
05
14
基金项目:国家科技支撑计划 ( 2007BAD59B00 ) ,国际科技合作项目 ( 2007DFA31260 ),国家转基因新品种培育重大专项 ( 2008ZX08010
003)
作者简介:赵杰宏,男,博士,研究方向:植物基因工程; E
m a i:l zhao jiehong@ 126. com
通讯作者:赵德刚,男,博士,教授, E
m ai:l dgzh ao@ gzu. edu. cn
化学农药给农业生产带来巨大经济效益的同
时,由于施用不当或滥用农药也给环境造成多种污
染,其中使用量最大、毒性较强的有机磷类杀虫剂和
除草剂尤其如此。努力提高果蔬降解农药残留的能
力,将具有重要意义。X ia等 [ 1]通过油菜素内酯预
处理黄瓜苗,可以显著提高黄瓜植株降解多种农药
残留的能力。而通过基因工程改良果蔬, 减少其农
药残留的研究,目前尚未见报道。有机磷农药降解基
因 OPD编码的有机磷水解酶 OPH能广泛水解有机
磷农药成分 [ 2 ] ,已经被克隆和表达在多种微生物中,
包括大肠杆菌 E. coli[ 3 ]、摩氏杆菌Moraxella spp. [ 4 ]
和酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae[ 5 ]等, 并成功用
于环境农残修复的研究和应用。本研究试图利用有
机磷农药降解基因 OPD和果实特异性启动子构建
植物表达载体, 通过农杆菌介导遗传转化 M icro

TOM番茄,选育果实能重组表达有机磷水解酶 OPH
的番茄品系,改良其降解农药残留的能力,以减少番
茄中农药残留给人们的健康带来的不良影响。
1 材料与方法
11 材料和试剂
番茄种子 (Solanum lycopersicum cv. M icro
Tom )
购自 PanAm er ican公司。 pGEM
T Easy Vector购自
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
Promega公司。携带 OPD基因植物表达载体 pSOP
由本实验室保存。限制性内切酶、T4DNA连接酶、
ExTaq酶、质粒提取试剂盒和 DNA胶回收试剂盒
购自 TaKaRa公司。Hybond
N+尼龙膜购自 GE
Am

ersham公司。D ig探针标记试剂盒、D ig杂交检测试
剂盒和 H yb高效杂交液购自深圳伊诺金公司。甲
醇 (色谱纯, M erk) ;乙腈 (色谱纯, 天津科密欧 ) ,有
机溶剂滤膜 ( 045 mm, M illipore)。毒死蜱 (纯度
97% )和对硫磷 (纯度 99% )购自北京上立方联合化
工技术研究院。
12 果实特异性启动子 E8的克隆
参照已报道的基因序列 ( GenBank登录号:
X13437)设计引物,并添加H ind III和BamH I限制性
酶切位点, 引物序列为 PE1: 5
ccgggtaccaagcttag

gaatttcacgaaatcg
3 和 PE2: 5
gccgtcgacggatcctcttttgcact

gtgaatg
3 ,以 !中蔬 6号 ∀番茄基因组 DNA为模板,进
行 PCR扩增。扩增程序: 94# 预变性 5 m in后, 94#
1m in, 55# 15m in, 72# 1m in, 30个循环,然后 72#
8m in,扩增产物连入 pGEM
T形成 pT
E8,转化 E. coli
TG1感受态细胞,蓝白斑筛选出重组子后, 送北京三
博远志公司测序鉴定。
13 果实特异性表达载体的构建
用 H ind III和 BamH I双酶切质粒 pT
E8和
pSOP, 电泳后回收 E8启动子和 pSOP载体大片段,
用 T4连接酶连接, 连接产物 pSE8OP转化 E. coli
TG1感受态细胞, 通过菌落 PCR筛选出阳性克隆
后,使用H ind III/BamH I和 Nd e I/BamH I两组双
酶切验证表达载体 pSE8OP。最终获得果实特异性
E8启动子驱动的 OPD基因植物表达载体, 通过冻
融法转化 A. tumefaciens LBA4404。
14 番茄的遗传转化与再生
用手术刀切取 7 d龄番茄幼苗子叶,接种至预
培养基 (M S+ 6
BA 2 mg /L )上 2 d,将外植体放入
制备好的农杆菌 A. tumefaciens LBA4404重悬液
( OD600= 03- 06, 100 mmo l/L AS)中浸泡 10 m in,
在灭菌吸水纸上去掉多余菌液,然后把侵染好的外
植体转接到共培养基上 ( M S + 6
BA 2 mg /L +
AS 100
mol/L )于 25# 暗培养 2- 3 d。再把番茄
外植体进行 7 d脱菌培养 (M S + 6
BA 2 mg /L+ cef
300mg /L )和延迟筛选, 每天光照 16 h, 温度 25# 。
当外植体切口出现少许愈伤组织时转接到筛选培
养基 (M S+ 6
BA 2 mg /L+ cef 250 mg /L+ kan 100
mg /L )上培养, 每 14 d左右继代 1次。从基部切
下抗性芽进行生根培养 (M S+ IAA 02 mg /L+ ce f
250m g /L + kan 50 mg /L ) , 待根系发达后驯化
移栽。
15 GUS染色和分子检测
取抗性再生苗的叶片用 X
g luc染液染色 ,
37# 暗反应 2 h后, 用 75% 乙醇洗脱, 再用无水
乙醇脱色 2- 3次后拍照。提取抗性苗的基因组
DNA进行 PCR和 Southern blott ing检测, 引物序列
为: Pop1: agatccag tacggca tcgag; Pop2: g tcgttgg acacgag

gatc;t 扩增程序: 94# 5 m in, 94# 30 s, 55# 25 s,
72# 25 s, 30个循环, 72# 延伸 8 m in, 扩增产物
446 bp。
16 番茄果实和叶子中农药残留对比分析
将转基因和对照番茄的果实或叶子分别在 20
mg /mL对硫磷或毒死蜱中浸泡 24 h后取出晾干, 24
h后称取定量果实或叶子萃取农药残留, 参考文献
[ 6]进行农药提取。HPLC系统 (W aters 600, 717
p lus au tosampler, SunF ire
TM
C18 reverse phase co lumn
( 46 mm ∃ 250mm), 2487 UV detector, USA )检测
对硫磷的波长为 290 nm, 流动相为甲醇 %水= 8%2,
流速 1 mL /m in,上样量 20
L, 30# 恒温。检测毒死
蜱的波长为 230 nm, 流动相为甲醇 %水= 9%1, 流速
08 mL /m in,上样量 20
L, 30# 恒温。样品质量分
数的计算公式如下:
X =
A 2M 1P
A 1M 2
式中: X为待测样品的质量分数 (% ) , A 1为标
样峰面积的平均值, A 2为样品溶液中相应待测组
分峰面积的平均值, M 1为标样的质量 ( g ) ,M 2为相
应待测样品的质量 ( g ) , P 为标样的百分含
量 (% )。
2 结果与分析
21 果实特异性表达载体的构建
以番茄基因组 DNA为模板扩增,电泳结果表明
扩增条带与目的片段大小基本一致, 约 11 kb (图
1
A )。随后将 pT
E8上的序列送测序, 同 GenBank
登录号: X13437 序列比较, 碱基序列相似性为
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2010年第 12期     赵杰宏等:转基因表达 OPH提高番茄果实降解有机磷农药能力的研究
99%,只有第 117位的碱基不同 ( C /T ) ,证实所扩增
的条带为 E8启动子。通过 H ind III /E coR I和
BamH I/Nde I两组双酶切 pSE8OP,可以正确获得 2
kb的 OPD基因片段、430 bp的正向 OPD基因片段
和 11 kb的 E8基因片段 (图 1
B, 1
C ) , 证明载体
构建正确。
图 1 E8启动子基因的克隆和双酶切 pSE8OP
图 2 psE8OP的 T
DNA区
22 GUS染色、PCR和 Southern blotting检测
转化抗性苗生长良好 (图 2
A ), 将获得的 K an
抗性苗进行 GUS染色 (图 2
B )和 PCR扩增 (图 2

C ),结果呈阳性。选取 T1、T2、T5三个株系提取叶
片总 DNA,用 BamH &完全酶切后做 Southern杂交,
用 BamH&单酶切的质粒做阳性对照。三个株系均
检测到了 1条杂交带 (图 2
D ), 表明 OPD基因已整
合到目标基因组中,为 1个拷贝。
23 HPLC检测精密度和回收率
用甲醇溶解对硫磷和毒死蜱, 制成 2 mg /mL标
准品, 上样 20 mL连续监测 8次, 计算检测精密度。
定量添加对硫磷于 10 g番茄中达到 20mg /mL,再用
15 mL乙腈萃取制样, 重复 3次, HPLC分析后计算
回收率和相对标准偏差 ( RSD) (表 1)。对硫磷和毒
死蜱的保留时间分别为 10067 m in和 12075 m in
(图 3)。
24 有机磷农残降解能力
比较 20mg /mL对硫磷或毒死蜱中浸泡 24 h后
番茄的农药残留,结果表明,转基因番茄叶子中对硫
磷残留比对照少 81% , 果实中对硫磷和毒死蜱残
留分别比对照少 400%和 406% (图 4) ,可见转基
因番茄果实能明显提高其有机磷农药残留的降解
能力。
A.转化苗再生; B.番茄叶片 GUS染色; C. PCR检测;
D. Sou thern blotting检测; M. M arker DL2000; T1- T6.
不同转基因番茄; CK.非转基因番茄; P. pSE8OP
图 3 转基因番茄的 GU S染色、PCR和
Sou thern blotting检测
3 讨论
目前已从多种生物中分离出能够降解有机磷组
分的酶,如哺乳动物血清对氧磷酶 ( PON )、鱿鱼二
异丙基氟磷酸酯水解酶 ( DFPase)、微生物有机磷酸
酯脱水酶 ( OPAA )和有机磷水解酶 ( OPH )等, 这些
酶不存在序列一致性 [ 7- 10]。除了 OPH能够自发代谢
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
图 4 HPLC分析番茄中对硫磷和毒死蜱的残留
表 1 番茄中对硫磷和毒死蜱分析方法的精密度及回收率
农药 精密度
(% )
回收率
样品本底
值 (mg /mL)
加入量
( mg /mL)
测得值
( mg /mL)
平均回收
率 (% )
RSD
(% )
对硫磷 648 未检出 200 1664 8320 153
毒死蜱 505 未检出 200 1972 9861 366
CK1.叶对照中对硫磷; L.叶中对硫磷; CK2.果对照中对
硫磷; F1.果中对硫磷; CK3.果对照中毒死蜱; F2.果中
毒死蜱; ( t检验, P < 001)
图 5 转基因番茄降解对硫磷和毒死蜱残留的能力
有机磷外, 其它酶在降解有机磷时只起辅助功
能 [ 11]。OPH通过水解 P
O、P
S、P
F和 P
CN键, 能
够广泛降解有机磷酸酯类组分 [ 1 2 ]。番茄果实的农
药污染主要来自田间农药喷施, 本试验首次通过转
基因研究, 把 E8驱动的 OPD基因在番茄果实中特
异表达,显著提高了果实对毒死蜱和对硫磷的降解
能力。这将为既减少果实农药残留, 同时也不消减
枝叶上农药的防效提供策略。相比喷施油菜素内
酯, 省时省力, 为食品安全研究提供借鉴。
参 考 文 献
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