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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
蔓地亚红豆杉 3
N
去苯甲酰
2
脱氧紫杉醇
苯甲酰转移酶基因的克隆与序列分析
黄仕杰 1, 2  程抒劼 1, 2  郭心悦 3  郭丽琼1, 2  林俊芳 1, 2
( 1华南农业大学食品学院,广州 510640; 2华南农业大学生物质能研究所,广州 510640; 3福建农林大学食品学院,福州 350002 )
  摘  要:  3
N
去苯甲酰
2
脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶 ( DBTNBT )是催化紫杉醇生物合成最后一步反应所需要的酶, 负责
将带有不完全侧链的紫杉醇前体催化形成紫杉醇。利用蔓地亚红豆杉的总 DNA和总 RNA为模板,采用 PCR和 RT
PCR技术
克隆出 DBTNBT基因的 DNA序列和 cDNA序列, 测序结果显示长度分别为 1 465 bp和 1 362 bp, 编码 438个氨基酸的多肽。
同源性比较分析结果表明,其碱基序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的 DBTNBT基因的一致性为 99% , 其氨基酸序列与已经报
道的蔓地亚红豆杉的 DBTNBT氨基酸序列的一致性为 96%。DNA序列和 cDNA序列比对发现该基因含有 1个内含子。利用
SW ISS
PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其蛋白序列进行了分析,为利用基因工程的方法生产紫杉醇或其前体物质提供
了分子基础。
关键词:  蔓地亚红豆杉  紫杉醇  3
N
去苯甲酰
2
脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶  基因克隆  序列分析
Cloning and Sequence Analysis of 3
N
debenzoyltaxol
N
benzoyltransferase Gene from Taxus xmedia
Huang Shijie
1, 2  Cheng Shujie1, 2  Guo X inyue3  Guo L iq iong1, 2  L in Junfang1, 2
(
1
College of Food Science, South China Agriculture University, Guangzhou 510640;
2
Institute of BiomassEnergy,
South China A griculture University, Guangzhou 510640; 3College of Food Science, Fujian Agriculture& Forestry University, Fuzhou 350002)
  Abstrac:t  3
N
debenzoy ltaxo lN
benzoy ltransfe rase ( DBTNBT ) is a k ind o f enzyme that can ca talyze the fina l acy lation step in
Taxo l b iosynthesis; it ca talyzes the 3
N
debenzoy ltax ol to form m ature Taxo.l In this study, DNA and RNA from Taxus xm edia w ere
used as the tem plate to c lone theDNA sequence and cDNA sequence o fDBTNBT gene. The resu lt o f sequencing show ed that the leng th
o f the DNA sequence and cDNA sequence is 1 465 bp and 1 362 bp, respectively. The gene contained an opening read ing fram e of
1 317 bp, wh ich coded for 438 am ino acid residues. The result o f alignm en t show ed that its cDNA sequence has 99% sim ilar ity to the
DBTNBT gene o fTaxus xm edia wh ich has been reported in NCB I, and its pro te in sequence has 96% sim ilar ity to DBTNBT o fTaxus x
m edia. The re is one intron in th is gene. B io info rma tics softw ares we re used to analysis the prote in sequence. Th is research w ou ld pro

v ide the mo lecu lar base fo r produc ing Taxo l and its prem ature m ater ia ls by genetic eng inee ring.
Key words:  Taxu s xm ed ia Taxol 3
N
debenzoy ltaxo l N
benzoyltransfe rase Gene clone Sequence ana lysis
收稿日期: 2010
05
06
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30671457, 30871768) ,国家 ! 863∀资助项目 ( 2006AA10Z301 )
作者简介:黄仕杰,男,硕士研究生,研究方向:功能基因挖掘与开发; E
m ai:l huangsh ijie1986@ 163 com
通讯作者:林俊芳,男,研究员,博士生导师, E
m ai:l lin j@f scau. edu. cn; E
m ai:l jun fanglin2003@ yah oo. com. cn
紫杉醇 ( Taxo l)是 20世纪 70年代发现的一种
具有独特抗肿瘤作用的二萜类天然产物, 目前已用
于治疗卵巢癌、乳腺癌、直肠癌等癌症, 由于其毒副
作用较小,因此一直是开发治疗癌症药物的研究热
点之一。
紫杉醇 ( C47H51NO14 )是一种结构复杂的二萜类
化合物,它是以三环二萜为基本骨架, 包含 11个手
性中心 [ 1]。紫杉醇作为抗癌药物的作用机制是同
细胞内的微管蛋白结合并将其冻结, 从而阻止了微
管蛋白的解聚, 进而使癌细胞停止分裂, 直到死
亡 [ 2 ]。其中 C
13位置的侧链被认为是整个紫杉醇
分子的活性必要基团,研究发现若将 C
13构位由

生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
型改为 型,则其活性下降将近 20倍 [ 3 ]。
紫杉醇主要从红豆杉的树皮中提取, 但由于其
只占红豆杉树皮干重的万分之几, 因此从红豆杉中
直接提取紫杉醇不能满足临床应用的需求。目前使
用较多还是化学半合成紫杉醇的方法, 即以 10
去
乙酰巴卡亭 III作为合成的起始物,从侧链合成开始
需要约 10个步骤合成紫杉醇 [ 4 ] , 但是化学半合成
法也存在明显的缺陷, 那就是起始化合物 10
去乙
酰巴卡亭 III虽然在部分红豆杉品种枝叶中的含量
是紫杉醇的 3倍以上, 但也是必须从红豆杉中进行
提取, 而随着紫杉醇需求量的不断增大,从天然红豆
杉中提取 10
去乙酰巴卡亭 III也将大量消耗自然界
中红豆杉的数量。近年, 通过构建紫杉醇代谢途径
关键酶基因的组合表达系统来生产紫杉烯等紫杉醇
前体物质的研究已有报道 [ 5- 7] , 利用微生物作为表
达宿主,通过代谢工程的方法来生产紫杉醇或其衍
生物的方法成为可能,因此,对紫杉醇代谢途径中的
各个关键酶基因的研究成为现阶段紫杉醇研究领域
的重点任务之一。
紫杉烷 3
N
去苯甲酰
2
脱氧紫杉醇苯甲酰转
移酶 ( DBTNBT)基因编码紫杉醇生物合成途径最后
一步所需要的酶, W alker等 [ 8 ]已经将该基因导入大
肠杆菌并进行了功能鉴定, 证明了其功能是催化紫
杉醇前体物质 3
N
debenzoy ltaxol形成紫杉醇。本
研究拟从蔓地亚红豆杉中克隆出 DBTNBT基因的
cDNA序列和 DNA序列,并对该基因的结构与推导
的蛋白质序列进行了分析, 为进一步利用该基因奠
定了基础。
1 材料与方法
11材料、菌株及主要试剂
蔓地亚红豆衫购自广东省韶关市金山地红豆杉
科技有限公司。大肠杆菌 ( E scherichia coli )菌株
DH5
,本实验室保存。克隆载体 pGEM
T E asy vec

to r购自广州莱德尔生物科技有限公司。Ex Taq酶、
dNTP、RT
PCR试剂盒 Prim eScript RT
PCR K it购自
大连宝生物工程有限公司。RNA提取试剂盒购自
天泽基因工程有限公司。胶回收和质粒小提试剂盒
购自天根生化科技有限公司。引物合成由上海生工
生物工程有限公司完成。测序由华大基因科技有限
公司完成。
12 总 DNA及总 RNA的提取
以幼嫩的蔓地亚红豆杉叶片为材料提取总 RNA
和基因组 DNA。总 RNA的提取采用天泽基因工程
有限公司的 RNA
ou t试剂盒; 总 DNA的提取采用
CTAB法,参照文献 [ 9]。
13 DBTNBT基因的克隆
131 引物的设计与合成  根据已报道的蔓地亚
红豆杉 DBTNBT基因序列 ( GenBank登录号: AY56

3629)设计 PCR引物。上游引物 12F : 5
ATTCT

CAGCCCATCGTTTCATC
3 ;下游引物 12R : 5
GCG

TTGGAGTTTCACACTTTAG
3 引物由上海生工生物
工程技术服务有限公司合成。
132 DBTNBT基因的 PCR扩增  以提取的总
RNA为模板, 根据 TaKaR a PrimeScript RT
PCR K it
的说明书进行反转录, 合成第一链的 cDNA。使用
12F /12R引物对, Ex Taq酶, 以合成的 cDNA以及提
取的总 DNA为模板进行 PCR扩增, 50 L的反应体
系中, 分别加入 dNTP 20 L, 10 # PCR Buffer
50 L, DNA模板 2 L, 12F和 12R引物各 20 L,
Ex Taq酶 05 L, ddH 2O 385 L。 PCR程序: 94∃
5m in, 94∃ 40 s, 52∃ 45 s, 72∃ 2 m in, 35个循环,
最后 72∃ 延伸 8m in。 PCR产物经 1%的琼脂糖凝
胶电泳检测。
133 TA克隆与序列测定  回收目的片段, 与
pGEM
T Easy载体连接, 连接产物转化 DH5
感受
态细胞,蓝白斑筛选获得单克隆, 酶切鉴定正确后送
到华大基因科技有限公司测序。
14 生物信息学分析
核酸序列比对在 NCBI BLAST( http: / /blas.t nc

b.i n lm. n ih. gov )上进行, 氨基酸序列比对在 EBI

BLAST ( http: / /www. eb.i ac. uk)上进行, 序列分析
用 DNassist 20和 NCB I Sp idey完成, 核酸与氨基酸
序列绘制用 DNAMAN完成, 蛋白质结构与功能的预
测在 Sw isspro t( http: / /www. expasy. ch /sprot / )网站
提供链接的平台上进行。
2 结果与分析
21 DBTNBT基因的克隆及序列比对
蔓地亚红豆杉总 RNA反转录为 cDNA后, 以
12F和 12R为引物, cDNA为模板进行 PCR扩增, 获
得一条特异性扩增的条带, 大小约为 14 kb (图
192
2010年第 12期   黄仕杰等:蔓地亚红豆杉 3
N
去苯甲酰
2
脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶基因的克隆与序列分析
1
A ); 以蔓地亚红豆杉基因组 DNA为模板, 12F和
12R为引物, PCR扩增, 同样获得一条特异性扩增的
PCR产物, 大小约为 15 kb (图 1
B )。测序后的实
际长度分别为 1 362 bp和 1 465 bp。 cDNA序列命
名为 TmDBTNBT,在 NCB I上进行比对,与蔓地亚红
豆杉 DBTNBT基因序列相似性达到 99%, 有 16个
碱基的差异,氨基酸序列在 EB I
BLAST上进行比对
显示与蔓地亚红豆杉的 DBTNBT 相似性为 96% ,
DNA序列利用 DNassist 20进行序列比对和 BLAST
分析显示,它在外显子区与全长 cDNA序列完全一
致。这些结果表明,成功克隆了蔓地亚红豆杉 DBT

NBT基因, 序列结果和推导的氨基酸序列见图 2。
该基因 DNA序列与 cDNA序列的比对结果及 NCBI
Spidey分析表明,该基因具有 1个内含子, 位于 DNA
序列的 449- 552 bp处,外显子和内含子的连接具有
保守的 GT
AG组成,把整个基因分为 2个外显子。
A. cDNA扩增电泳图; B. DNA扩增电泳图;
1. DNA M arker 3 ; 2. PCR扩增目的带
图 1 PCR扩增电泳图
圆圈表示起始密码子和终止密码子,方框表示 N
糖基化位点,双线表示 N
酰基化作用位点,三角形表示微体 C
末端转运信号
图 2 TmDBTNBT cDNA序列和推导的氨基酸序列
22 DBTNBT基因的生物信息学分析
DBTNBT基因编码一个长为 438个氨基酸的
多肽, 利用 SW ISS
PROT网站的蛋白质初级结构
分析工具计算得其相对分子量为 482 kD, 等电
点为 603。利用在线网站 iPSORT p red ict ion预
测信号肽定位, 结果显示, 该氨基酸序列不含有
信号肽和叶绿体、线粒体转运肽, 说明 DBTNBT
为非分泌型蛋白, 催化的转酰基作用发生在细胞
质内。利用 Pred ict Protein[ 10 ]网站预测该氨基酸
序列含有 4个 N
糖基化位点, 3个蛋白激酶 C磷
酸化作用位点, 3个 N
酰基化作用位点, 1个微体
C
末端转运信号 (图 2) , 在酵母和大肠杆菌中的
半衰期分别为小于 20 h和小于 10 h。利用
pro tsca le在线预测蛋白的溶解性, 结果表明, 该氨
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 12期
基酸序列为疏水性蛋白 (图 3 )。通过 NCB I网站
的 conserve doma in寻找氨基酸序列的保守结构,
结果显示该序列具有转移酶超家族保守结构域。
将 TmDBTNBT氨基酸序列递交 EB I
BALST进行
序列比对, 只找到两条已报道的 DBTNBT 氨基
酸序列, 与蔓地亚红豆杉 DBTNBT 的相似性为
96% , 与加拿大红豆杉 DBTNBT的相似性为 59% ,
并未找到其它物种中报道的 DBTNBT序列, 说明
对 DBTNBT 的研究尚处于起步阶段, 还需继续
深入。
峰值大于零为疏水性峰,峰值小于零为亲水性峰
图 3 DBTNBT蛋白序列溶解性分析
  通过 SOMPA预测 DBTNBT的二级结构, 结果
显示 DBTNBT含有 3539%的

螺旋, 1895%的延
伸链, 320% 的 
转角和 4247% 的无规则卷曲。
可以看出, DBTNBT蛋白含有较多的

螺旋和无规
则卷曲, 而延伸链和 
转角则散布于整个蛋白中
(图 4)。


螺旋,延伸链, 
转角,无规则卷曲分别用高度依次降低的竖线表示
图 4 蛋白质二级结构预测图谱
  将 TmDBTNBT的氨基酸序列递交到 ExPASy网
站链接的 Sw iss
Mode ling进行蛋白质三维结构的同
源建模 [ 11 ] ,得到 TmDBTNBT氨基酸序列的预测三
级结构 (图 5), 可以更直观地看出, 结构中含有较多
的

螺旋和无规则卷曲。
图 5 DBTNBT蛋白三级结构预测图
目前已证实紫杉醇合成途径中包含有 5个酰基
转移酶 [ 12 ] ,为了研究 5种酰基转移酶的进化关系,
将本研究克隆的 TmDBTNBT, 与从 EB I数据库中选
用了 11条 5种酰基转移酶的氨基酸序列,包括蔓地
亚红豆杉、加拿大红豆杉的 DBTNBT[ DBTNBT (T. x
med ia )、DBTNBT ( T. canadensis ) ] , 南方红豆杉、东
北红豆杉和蔓地亚红豆杉的紫杉二烯
5

醇
O
乙
酰转移酶 [ TAT (T. chinensis )、TAT ( T. cusp idata )、
TAT (T. xm edia ) ], 南方红豆杉的 10
去乙酰巴卡亭
%
10
O
乙酰转移酶 [ DBAT (T. chinensis) ] ,南方红
豆杉内生真菌 BT12所产的紫杉二烯乙酰转移酶
[ TAT (T. fungus BT2) ] ,蔓地亚红豆杉的苯基丙酰
转移酶 [ BAPT (T. xm edia ) ], 蔓地亚红豆杉的紫杉
烷
2

苯甲酰转移酶 [ TBT (T. xm ed ia) ],红豆杉内
生真菌亮白曲霉、枝状枝孢霉产的 10
去乙酰巴卡
亭%
10
O
乙酰转移酶 [ DBAT (A. cand idus)、DBAT
( C. cladosporioides) ] , 采用 Ne ighbor
joining 方 法
(M EGA4)构建了系统进化树。结果 (图 6)显示, 蔓
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去苯甲酰
2
脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶基因的克隆与序列分析
地亚红豆杉的 DBTNBT和红豆杉内生真菌亮白曲
霉、枝状枝孢霉产的 DBAT 以及南方红豆杉的
DBAT处于同一个进化小组内, 而蔓地亚红豆杉的
DBTNBT与加拿大红豆杉的 DBTNBT则不处于同一
个分支内,另外可以看到来源不同的 TAT均处于同
一个进化小分枝内,说明 TAT在不同物种中具有较
高的保守性,而 DBTNBT在不同的物种内保守性相
对较小,还需进行深入研究。
图 6 紫杉醇合成途径中 5种酰基转移酶的进化树
3 结论与讨论
紫杉醇是从红豆杉中提取出来的天然二萜化合
物,它在红豆杉中的代谢途径分为紫杉醇上游合成
途径和下游合成途径,根据目前的研究进展,紫杉醇
下游合成途径的 13个酶被认为是利用外源宿主进
行组合表达紫杉醇的关键酶。DBTNBT是紫杉醇合
成过程中 5个关键酰基转移酶的其中之一, 它将紫
杉醇前体物质 3
N
debenzoyltaxo l催化形成成熟的
紫杉醇。蔓地亚红豆杉中的 DBTNBT基因序列虽
然已经被报道,但并未见报道对其进行分析及研究。
本研究从蔓地亚红豆杉的总 RNA和总 DNA中
克隆出 DBTNBT基因的 cDNA和 DNA序列,与国外
克隆出的蔓地亚红豆杉 DBTNBT基因的相似性达
到 99%,氨基酸序列的相似性达到 98% ,因此确定
成功克隆出蔓地亚红豆杉的 DBTNBT基因, 分析得
出该基因含有一个内含子, 该基因编码的 DBTNBT
在相对分子量和等电点都与国外报道的相似。在
EB I数据库中检索发现迄今为止只有蔓地亚红豆杉
和加拿大红豆杉的 DBTNBT被报道过,两者的相似
性为 67%,说明对红豆杉中 DBTNBT基因的研究还
需进一步深入。从 EBI数据库中选取 11条 5种酰
基转移酶的氨基酸序列构建进化树进行分析, 表明
DBTNBT与 DBAT的保守性较高, 而 5种酰基转移
酶之间也具有一定的保守性, 说明他们在紫杉醇代
谢途径中可能有互相的联系。此外, 本研究利用生
物信息学软件及在线工具对蔓地亚红豆杉 DBTNBT
进行了分析,预测出它的功能位点, 蛋白质属性, 二
级结构以及三维结构模型, 为日后进行外源宿主组
合表达生产紫杉醇或其前体物质奠定了分子基础。
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