全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2008-01-14
基金项目:山西省自然基金项目(20001096)和山西省农业科学院高新项目(YGX0703)资助
作者简介:杜建中(1960-),男,硕士,副研究员,从事植物基因工程领域的研究
油菜属十字花科芸薹属植物,作为重要的食用油来源及工业原料,其发展和生产一直受到人们的重
视,2006年,我国油菜种植面积已达到 666.7万 hm2 [1]。但是由于国内油菜籽产量与食用油消耗量差口较
大,1999/2000年度我国油菜籽进口量一度创下 385.5万 t的历史最高纪录[2],2003/2004年度油菜籽进口量
也维持在 41.8万 t左右[3]。因此,扩大油菜种植面积,提高油菜单产已成为我国油菜生产的当务之急。目
前,影响油菜生产的因素除通过政策调整提高农民种植油菜的积极性外,病虫害对油菜生产发展的制约也
不容忽视。特别是虫害,常年的虫害发生面积都很大,全球每年因虫害对农业生产所造成的损失仍高达
20%～30%[4]。在我国油菜菜粉蝶[Artogeia(pieris)rapae(Linnaeus)]的发生面积就占油菜播种面积的20%以上[5]。
利用植物基因工程培育抗逆性油菜品种,已被证实是行之有效的油菜育种手段[6]。几丁质酶(chitinase)广泛
存在于昆虫、微生物和植物体内,它能够降解外侵生物的完整结构(如膜或昆虫表皮、卵壳或线虫的外壳),
转基因油菜后代的农艺性状表现及其抗虫性研究
杜建中 孙毅 曹秋芬 郝曜山 刘龙龙 贺健
(山西省农业生物技术研究中心,太原 030031)
摘 要: 以农杆菌介导法转几丁质酶基因和蝎毒蛋白基因的晋4和H165油菜种子为试材。采用PCR检测、农艺
性状调查、田间抗虫鉴定等技术,对转基因植株及其后代进行了选育研究。T1、T2和T3代材料的PCR检测结果显示目的
基因在转基因植株及其后代中可稳定遗传;抗虫鉴定结果证明转基因油菜植株的抗虫性得到提高,转基因株系的被害
率、被害程度明显小于相应对照,转基因株系中菜粉蝶幼虫的存活率低于对照,而且存活虫的发育进程比对照缓慢;农艺
性状调查结果证实,转基因手段对油菜植株的角果数、角粒数和千粒重等性状没有太大影响。根据上述结果,在T3代时,
筛选得到J5-1、J5-2、H5-1和H11-1四个纯合的转基因油菜株系。
关键词: 油菜 转基因 农艺性状 抗虫性 选育
PerformanceofAgronomicCharactersofTransgenicOilseedand
TheirInsectResistantActivity
DuJianzhong SunYiCaoQiufen HaoYaoshan LiuLonglong HeJian
(TheAgri-BiotechnologyResearchCenterofShanxiProvince,Taiyuan030031)
Abstract: Inthisstudy,thetransgenicseedsusedasmaterialwereobtainedfrom insect-resistanttransgenicoilseed
linesthattransformedbyAgrobacteria-mediatedapproachonJin4andH165(Brassicanapus).TheresultsofPCR
amplificationforT1,T2 andT3 progeniesshowedthatchitinasegeneandscorpiontoxingenecanstablelyinherited.
Biologicalasayforinsect-resistantconfirmedthattheinsect-resistanceoftransgenicplantsincreased,Thepercentageof
injuryandthelevelofdamageoftransgenicplantsweremuchlesthancontrolplants.Comparedwithcontrolplants,the
survivalnumberofDiamonbackmothlarvasintransgenicpalntswereles,too.Furthermore,thedevelopmentofsurvival
insectswere slowly.Investigation resultsoftransgenic plantson agronomic characters(pod number/plant,kernel
number/pod,thousandkernelsweight)indicated:noconsiderablediferenceexistedbetweentransgenicandcontrolplants.
Basedonaboveresults,4transgenicpurelines,J5-2,J5-2,H5-1,H11-1,wereobtainedfrom T3generationtransgenicline
byselectionbreeding.
Keywords: Oilseed(Brassicanapus) Transgene AgronomicsInsect-resistance Selectionbreeding
2008年第3期
或释放出能诱导寄主产生其它防御反应的物质,从而对某些昆虫(尤其是同翅目昆虫)表现出一定抗性[7]。
蝎毒是一种富含生物活性的多肽物质,蝎毒中有一类神经毒素专一作用于昆虫而对哺乳动物无害或毒性
很小,因此可利用此类昆虫特异性的蝎神经毒素(insect-selectivescorpionneurotoxin)来研制新型生物杀虫
剂和抗虫害转基因植物 [8]。采用农杆菌介导法将双价质粒 pBI101-chi-Bmk质粒导入油菜,获得了转基因植
株的种子[9,10]及其后代,旨在通过对其进行分子检测、农艺性状筛选以及抗虫性鉴定等手段,选育到抗油菜
菜粉蝶虫且其它农艺性状优良的转基因油菜纯合株系。
1 材料和方法
1.1 植物材料和转化用质粒图谱
以质粒 pBI101-chi-Bmk导入甘蓝型油菜晋 4和 H165的转基因植株的种子(T0)及其后代植株作为试
验材料 (本研究室提供)。转化用质粒 pBI101-chi-Bmk的物理图谱
(图 1)。质粒携带有:几丁质酶因,蝎毒蛋白基因,标记基因为卡那
霉素基因。PCR扩增检测所用引物序列,几丁质酶基因扩增引物:-
ATGCGAGCGACACTGG-和-TTGACATTCGCGAGC-,产物片段长度为
1800bp;蝎毒蛋白基因扩增引物:-ATGAAATTTTCCTTATA-,-TTAAC
CAATTATTTGGAC-,产物片段长度为 280bp。
1.2 方法
1.2.1 取样及 DNA提取 将 T0代种子播种在沙土中,用卡那霉素(25mg/L)水溶液浇灌,30d后选择生长
健壮的苗(T1代植株)移栽到大田,选择 PCR检测阳性结果且抗虫的 T1代植株自交授粉收获种子,来年播
种得到 T2代株系。选择 T2代株系中 PCR检测结果阳性、抗虫性高、农艺性状优良的疑似纯合体株系自交
收获种子,来年播种得到 T3代株系。T1代取各植株幼嫩叶片、T2和 T3代每个株系随机取样若干个,按
CTAB方法[11]提取植物 DNA。
1.2.2 PCR扩增 扩增反应体系:总体积 15μl,模板 100ng;蝎毒蛋白基因扩增反应条件:94℃,5min;94℃,
30s;44℃,30s;72℃,45s;30个循环,72℃,10min;4℃,10min。几丁质酶基因扩增反应条件94℃,5min;94℃,60s;
56℃,60s;72℃,90s;30个循环,72℃,10min;4℃,10min。试验设阴性对照(非转化植株DNA)、空白对照(反应体
系同,但不加模板 DNA),Marker为鼎国生产的 DL-2000。扩增产物于 0.8%(几丁质酶基因扩增产物)或 1.2%
(蝎毒蛋白基因扩增产物)琼脂糖凝胶上电泳(稳压110U),于SYN凝胶成像系统观察电泳结果并照相记录。
1.2.3 农艺性状调查 农艺性状调查的主要指标为株果角数、果粒数,千粒重。
1.2.4 抗虫性鉴定 T1代抗虫鉴定在实验室进行,其试验方法和结果见[10]。T2和 T3代抗虫鉴定在大田进
行。田间按株系分类,每个品种选择 1个株系分别用纱窗覆盖搭蓬,对照同上处理。采集菜粉蝶成虫,实验
室培养产卵,卵于 25℃、相对湿度 76%的条件下孵化出幼虫,再于 6月 7日将幼虫接到蓬室内,每个蓬室
接幼虫 50头。其后定期(3d一次)调查植株的被害率、被害程度及虫子存活率。持续调查 15d。调查指标为:
虫存活头数,以植株上存在的虫头数为准;被害植株数量,以该植株被虫咬食为准;被害叶面率,指被虫咬
食叶面积占被咬食叶面积的百分率(估计值)。被害叶面积百分率按如下方式分类:0%~5%,高抗虫,5.1%~
15%,抗虫,15.1%~30%,中抗,30.1%~50%,轻度敏感,>50%为,重度敏感。
2 试验结果
2.1 T0代种子卡那霉素筛选结果
按 1.2.1方法将 T0代种子播种在沙土中,浇灌卡那霉素水溶液,种子萌发结果见表 1。
对表 1调查结果进行 X2分析,结果见表 2。晋 4X2实际值为:0.0952,H165X2实际值为:0.2223,均小
于查 X2表 X20.05,1=3.841的值,证明目的基因是以单拷贝、单位点整合到转基因植株的基因组个。符合孟德
尔单显性基因的遗传分离比例 3:1。
图 1 质粒 pBI101-chi-Bmk的物理图谱
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2.2 PCR检测结果
PCR检测结果见表 3。
T1代植株全部取样,PCR检测结果阳性率约为 70%,T2代每个株系取样 3个,PCR检测结果阳性率约
为 80%,其中晋 4的 7个株系中有两个株系(J2、J5)
的 3个样品 PCR结果均为阳性,H165的 11个株系
中有 4个株系(H4、H5、H9、H11)的 3个样品 PCR检
测结果均为阳性。对这 6个株系 2次取样(全部植株
都分别取样),PCR检测结果阳性率达到 95%以上,
故将这 6个株系看作转基因的疑似纯合系。T3代为
上述 6个疑视纯合系各种植 3个株系,每个株系都
全部取样,PCR检测为 J5-1、J5-1、H5-1和 H11-1 4
个株系的植株全部呈阳性结果,其它株系有部分植株的结果呈阴性。在所有 PCR检测过程中,阴性及空白
对照的 PCR产物皆为阴性,证明上述 PCR检测结果是可靠的。图 2是部分 T3代株系 PCR检测结果。
上述结果,一方面证明了目的基因在转
因植株中能够稳定遗传,另一方面说明 PCR
检测结果可作为转基因纯合系选育指标之
一。此外,在对 T3代的 PCR检测中,发现有
个别样品检测结果为阴性,可能与基因在世
代交替过程中的丢失关。
2.3农艺性状调查结果
转基因油菜各代植株的农艺性状调查
结果见表 4,表 5和表 6。T1代数据为所有单株实测值的平均值,对照数据为 5株数据平均值;T2代数据皆
为各株系 5株数据平均值;T3代数据 T2代疑似纯合
系各种植 3个株系的调查数据,为 5株平均值。
从表 4、表 5和表 6中可以看出,各代转基因植株
或株系的农艺性状调查值与其对照间无明显差异,所
存在的微小差异不大于品种内或株系内各株间的差
异。从而证明转基因手段对油菜育种没有不良影响。
表 1 T0代种子卡那霉素筛选结果
表 2 表 1数据的 X2分析结果
注:*该方差呈显著值
表 3 转基因油菜及其后代植株的 PCR检测结果
图 2 T3代部分材料的 PCR扩增结果
M:Marker P:阳性对照 -:阴性对照 1~6:转基因材料
左图:几丁质酶基因扩增产物 右图:蝎毒蛋白基因扩增产物
表 4 T1代转基因油菜植株农艺性状调查结果
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2.4 抗虫鉴定结果
田间抗虫鉴定的调查结果见表 7。可以看出,转基因株系的虫存活头数明显低于对照株系,并且对照
株系中存活虫生长比对照株系存活虫要快。接虫 15d时,对照的被害率为 100%,而转基因株系被害率最高
只有 42%,另外从植株的被害程度看,转基因株系叶片被害程度最高为 25%,为抗虫系列;而对照叶片被
表 6 T3代转基因油菜植株农艺性状调查结果表 5 T2代转基因油菜植株农艺性状调查结果
表 7 田间接虫抗虫鉴定调查结果
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
害程度最低为 15%,最高达到 80%,皆达到重度染虫。进而转基因株系单株被害叶片数量也比对照低(表
中未给出相应数据)。总之,转基因植株的抗虫性明显高于对照植株,证明转几丁质酶基因和蝎毒蛋白基因
可提高油菜植株的抗虫性,通过植物基因工程技术培育抗虫油菜新品种是一种快速而可行的方法。根据
PCR检测、农艺性状调查及抗虫性鉴定结果,在 T3代时,筛选得到 J5-1、J5-2、H5-1和 H11-14个纯合的转
基因油菜株系。
3 分析和讨论
3.1 转基因与农艺性状
外源基因导入会对受体植物内源基因的表达调控产生一系列影响,导致表型变异,如株高降低[12]、推
迟开花[13]、产量性状和育性明显降低[14]、单株有效穗数增加等[15]。转基因植物的性状变异可能是由于无性变
异和外源基因导入共同引起的[16]。外源基因的表达打破受体内原有的能量供给和消耗平衡,造成一些性状
表达所需能量的相对不足,影响生理代谢,并促进表型的变化,导致转基因杂交后代农艺性状的变化。而在
组织培养过程中,细胞可以发生染色体数目变异,结构变异(包括染色体的断裂、易位、倒位、缺失、重组
等),核基因的扩增、丢失、突变重组等变化,进而造成转基因植物农艺性状上的变异[17]。根据本研究结果,
转基因油菜农艺性状与对照比较变化不大,这与官春云[6]等的结果一致。可见通过转基因方法与传统育种
方法密切结合来改良现有油菜品种性状,选育出非目标农艺性状、经济性状基本保持不变,从而最终产量
基本保持不变,甚至更优的油菜新品种是完全可能的。进而在确保转基因油菜产量的基础上,增加了油菜
的抗虫性,还可减少由于虫害发生而大量的人力、物力投入,有助于环境保护。
3.2 转基因与油菜育种
自 1986年 V.H.Mathew等首先将 NPT-Ⅱ基因利用农杆菌介导法转入芥菜型油菜以来,转基因油菜
研究有了长足的发展,2005年,转基因油菜种植面积已达到 360万 hm2。我国于 1995年开始进行 Bt毒蛋
白基因[18]、TA29核酸酶基因[19]、反义 FAD2基因[20]转化甘蓝型油菜的研究;浙江省农科院陈锦清博士等[21]
进行了利用反义 PEP转化甘蓝型油菜提高种子含油量的研究。2000年,我国首个转基因抗虫油菜诞生[22]。
采用农杆菌介导法将几丁质酶基因和蝎毒蛋白基因同时导入油菜,获得了抗虫油菜株系。总之,植物基因
工程技术应用于油菜育种,在提高油菜品种的抗逆性、改良品质等方面取得了很大成功,加之转基因油菜
种植面积的不断扩大,均显示了转基因技术在油菜育种领域应用的巨大潜力。
参考 文献
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3 讨论
在 PCR反应体系中,dNTP、引物、Mg2+和 Taq酶是 4个主要的影响因子,它们之间的相互作用会影响扩
增结果。对于不同物种或在不同试验条件下,需要对这些因子的最佳组合浓度进行优化。在本试验当中,不
同处理间确实存在明显差异。dNTP、primer和 Mg2+分别在 150μmol/L、1.5μmol/L和 1.0mmol/L时,扩增效
果最差,说明小桐子 ISSR-PCR扩增体系中,当 dNTP、Mg2+和 primer的浓度分别达到某个阀值时,即使调节
其它因子的浓度也不能得到理想的扩增结果,因子之间的相互作用只在一定的浓度范围内起作用。而 Taq
酶的用量在 0.5~2.0的 3个梯度都可以扩增出比较好的结果,可能与酶本身的性质有关。
模板 DNA浓度主要影响扩增条带的明暗度,因此在实验当中,可根据每个引物的具体扩增效果适当
调节模板浓度,以便于得到清晰可辨的条带。另外,退火温度和循环次数也是 PCR反应中的重要因子,它
们的变化通常会对扩增结果产生影响。但在实验中,退火温度和循环次数并没有明显影响扩增结果,可能
与引物的特异性较强有关;也可能是所建的小桐子 ISSR-PCR扩增体系比较稳定,因此对反应条件的变化
具有较强的承受能力。
虽然 ISSR标记具有比较好的稳定性和重复性,由于 PCR反应制约因素比较多,因此尽量在相同的条
件下进行扩增反应是实验成功的关键。
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王桂娟等:小桐子ISSR-PCR体系的优化 165