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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
烤烟 SNARE蛋白基因 T-NTGP2 全长
cDNA克隆与生物信息学分析
胡重怡 蔡刘体
(贵州烟草科学研究所，贵阳 550081)
摘 要: 从烤烟品种南江 3 号(Nicotiana tobacum cv． Nanjiang-3)均一化 cDNA文库中克隆获得一个 SNARE蛋白同源性
较高的 cDNA全长序列，命名为 T-NTGP2，GenBank中的登录号为 HO663897。利用 ORF finder和 ProtParam软件分析显示，它
包含一个长度为 597 bp的完整开放读码框，编码一个含有 199 个氨基酸、等电点为 6. 96、分子量为 22. 59 kD的蛋白。Blast搜
索结果及进化分析结果表明，烤烟 T-NTGP2 基因编码的蛋白与烤烟、杨树和蓖麻的 Ykt6 蛋白具有较高的同源性，其一致性分
别为 99%、91%和 91%。该基因编码的蛋白具有一个典型的 VAMP基元，同源分析表明该蛋白属于 SNAREs中特殊 longins中
的 Ykt6 蛋白。
关键词: 烤烟 SNARE 克隆 生物信息学分析
Cloning and Bioinformatics Analysis of a SNARE Protein
T-NTGP2 cDNA from Flue-cured Tobacco
Hu Zhongyi Cai Liuti
(Guizhou Tobacco Research Institute，Guiyang 550081)
Abstract: From the normalized DNA library of the flue-cured tobacco cultivar Nanjiang-3，the full length cDNA sequence of to-
bacco which is highly homologous to the gene SNAREs was isolated，(named as T-NTGP2)cloned and its sequence was analysed，with
GenBank accession number HO663897． Analysis by the software ORF finder and ProtParam showed that the T-NTGP2 with a 597 bp
open reading frame(ORF)which encode a protein of 199 amino acids，with a calculated molecular weight(Mw)of 22. 59 kD and a isoe-
lectric point(pI)value of 6. 96． The results of Blast and phylogenetic analysis showed that T-NTGP2 gene had homology with the
SNARE protein Ykt6 gene of some plants，and T-NTGP2 encoded protein had high identity with the Ykt6 protein of Nicotiana tabacum，
Populus trichocarpa and Ricinus communis，with identity of 99%，91%，91%，respectively． The result of the conserved domains analysis
indicated that T-NTGP2 has a signature motif for vesicle-associated membrane proteins(VAMP) ，which implied that T-NTGP2 would be
a YKT-like SNAREs longins．
Key words: Flue-cured tobacco SNARE Clone Bioinformatics
收稿日期:2010-12-27
基金项目:中国烟草总公司资助项目(110200701021) ，贵州省烟草专卖局资助项目(黔烟科 2009-15，黔烟科 2010-12)
作者简介:胡重怡，硕士，助理研究员，研究方向:烟草分子生物学;E-mail:rebeccahu0801@ 126． com
通讯作者:蔡刘体，E-mail:cailiuti01@ 163． com
高等植物中，膜泡运输对于完成细胞器及细胞
膜之间的蛋白运输功能至关重要，可溶性 N-乙基马
来亚酰胺敏感因子附着蛋白的受体(soluble-N-ethyl-
maleimide-sensitive fusion protein attachment protein
receptor，SNAREs)蛋白专一性介导真核生物囊泡的
定位与融合［1］。比较人和酵母的多个 SNARE 蛋白
序列，发现不同 SNARE 蛋白尽管在氨基酸长度和
结构上有所区别，但有一段序列(长度为 55 个氨基
酸)是高度保守的，称之为 SNARE结构域(SNARE-do-
main)，是 SNARE核心复合体(core complex)形成时各
个成分相互作用的部位，由 synaptobrevin /VAMP、syn-
taxin及 SNAP-25 以1∶ 1∶ 1的比例聚合成 SNARE 核
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
心复合体［2］。根据位于 SNARE 结构域中间的氨基
酸残基是精氨酸或是谷氨酰胺，将 SNAREs 家族成
员分为 R-SNAREs 和 Q-SNAREs 两类。根据 longin
结构域序列的长短 R-SNAREs 被划分为 VAMPs(小
突触囊泡蛋白或称 brevins)和 longins(突触囊泡蛋
白或称 long VAMPs)两类，其中 Longins 又分为 T1-
VAMP［3］、Sec22［4］ 和 Ykt6［5］。迄 今 为 止，植 物
SNAREs 蛋白基因已被广泛报道［1］，本研究从烤烟
品种南江 3 号均一化全长 cDNA文库中克隆了 1 个
Ykt6 蛋白基因，与之前报道的烟草 Ykt6 蛋白 T-NT-
GP1(登录号:AAD00116)在编码蛋白上有两个氨基
酸差异，通过烟草 SNAREs蛋白基因的克隆，以期为
更深入地了解烟草 SNAREs蛋白家族基因功能和膜
泡运输的机制奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
从烤烟品种南江 3 号的均一化 cDNA 文库中筛
选克隆到 1个 SNARE蛋白基因，命名为(T-NTGP2) ，
其 GenBank登录号为 HO663897。其他植物的 SNARE
蛋白序列信息从 NCBI 数据库(www． ncbi． nlm． nih．
gov)中获取。
1. 2 方法
均一化 cDNA 文库的构建采用 SMART cDNA
Library Construction 试剂盒(QIANGEN 公司)完成，
序列测定由上海生工生物公司完成。
用网站 http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov 中提供
的 ORF finder软件找出基因的开放读码框，用 NCBI
提供的 BLASTp 程序搜索进行同源性分析;采用
MEGA4. 1 进行进化关系分析。利用瑞士生物信息
学研究所(http:/ / cn． expasy． org /)提供的 ProtParam
软件在线分析氨基酸残基数目、组成、蛋白质相对分
子质量、理论等电点及平均可塑性、疏水性等参数。
利用 ExPASy 提供的 HNN［6］软件等在线分析 α-螺
旋(alpha-helix)、β-转角(beta turn)、无规卷曲(ran-
dom coil)以及延伸链(extend strand)蛋白质一级结
构。利用 http:/ / swissmodel． expasy． org /workspace /
网站提供 Sequence Feature Scan［7］和 Modeling［8 － 10］
程序对蛋白质的二级和三级结构进行预测。利用
http:/ /www． cbs． dtu． dk /网站提供的软件进行跨膜
结构和信号肽［11］的预测，利用瑞士生物信息学研究
所(http:/ / cn． expasy． org /)提供的 Prosite 软件对蛋
白质功能位点进行预测［12］。
2 结果与分析
2. 1 烤烟 SNARE蛋白基因克隆
用 ORF finder软件分析烟草 SNARE 蛋白基因
(T-NTGP2)编码氨基酸序列，可得到完整的 ORF
框，其 5非编码区为 140 bp，编码区位于核苷酸序
列的 1 － 597 区域，编码蛋白包含 199 个氨基酸
(图 1)。
2. 2 T-NTGP2 同源性分析
SNAREs基因在多种植物中均存在，通过序列
比对 http:/ /www． expasy． org /cgi-bin /blast) ，烤烟 T-
NTGP2 基因编码的蛋白与烤烟(Nicotiana tabacum)
(登录号:AAD00116)Ykt6 蛋白高度同源，其一致性
为 99%，两者编码氨基酸序列相差两个氨基酸，与
杨树(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、
葡萄(Vitis vinifera) (登录号分别为 XP002309328、
XP002523504、CAN67944)Ykt6 编码序列同源性较
高，其一致性分别为 91%、91%和 90%。这说明该
基因在植物进化过程中具有保守性。
用 MEAG4. 1 软件对烟草 T-NTGP2 基因编码
氨基酸序列和其他植物的 Ykt6 蛋白进行进化分
析，结果(图 2)显示，烤烟 T-NTGP2 基因编码氨基
酸序列与烤烟、拟南芥、葡萄的 Ykt6 蛋白(登录号
分别为 AAD00116、AAD00112、CAN67944)的同源
性较高。
2. 3 蛋白质一级结构分析
通过 ProtParam 软件分析表明，T-NTGP2 蛋白
相对分子量为 22587. 6，理论等电点为 6. 96，酸性氨
基酸残基总数(Asp + Glu)为 25 个，碱性氨基酸残
基总数(Arg + Lys)25 个，原子总数是 3 163 个，分子
式为 C1005H1574 N272 O304 S8。烟草 T-NTGP2 蛋白平均
疏水性分析显示大致有 4 个峰值，分布于氨基酸
残基的 60 － 71，81 － 88，134 － 155，159 － 173 区域
(图 3) ;可塑性分析显示有 4 个峰值，分布于氨基
酸残基的 14 － 17，50 － 60，146 － 149，161 － 163 区
域(图 4)。
2. 4 蛋白质二级结构分析
图 5 表明 T-NTGP2 蛋白富含 α-螺旋(alpha he-
lix)和无规则卷曲(random coil) ，分别是 32. 66%和
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2011 年第 7 期 胡重怡等:烤烟 SNARE蛋白基因 T-NTGP2全长 cDNA克隆与生物信息学分析
下划线标注起始密码子，斜体标注终止密码子，* 标注翻译终止
图 1 T-NTGP2 cDNA全长序列及其推导的氨基酸序列
Populus trichocarpa． 杨树;Glycine max．大豆;Gossypium bar-
badense．海岛棉;Ricinus communis． 蓖麻;Arabidopsis thali-
ana．拟南芥;Nicotiana tobacum． 烟草;Vitis vinifera． 葡萄;
Hevea brasiliensis．橡胶;Triticum aestivum．小麦;Oryza sativa．
水稻;Selaginella moellendorffii．卷柏
图 2 NTGP-2与部分植物 SNARE蛋白Kyt6进化关系分析
47. 74%，分布于氨基酸序列的多个区域。延伸链
(extended strand)主要分布于氨基酸残基的 2 － 10、
41 － 46、151 － 156 相对集中的 3 个区域，占氨基酸
残基总数的 19. 60%;无 β-转角分布区域。
图 3 T-NTGP2 基因推导的编码蛋白疏水性分析
图 4 T-NTGP2基因推导的编码蛋白可塑性分析
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
序列全长含 199 个氨基酸;竖线由长及短分别为 α-螺旋(32． 66%) ，延伸链(19． 60%) ，无规则卷曲(47． 74%) ，无 β-转角
图 5 T-NTGP2 蛋白的二级结构分析
2. 5 蛋白质三级结构分析
登录 http:/ / swissmodel． expasy． org /workspace /
中的 MODELING，对 T-NTGP2 蛋白进行三级结构预
测分析，结果(图 6)表明其与 SNARE蛋白家族中的
Ykt6 的三级结构非常相似。
A． T-NTGP2 三级结构预测;B． Ykt6 三级结构
图 6 T-NTGP2 蛋白质三级结构预测
2. 6 蛋白质跨膜结构和信号肽的预测分析
登录 http:/ /www. cbs. dtu. dk /services /TMHMM/，
对 T-NTGP2 蛋白进行蛋白质跨膜结构预测，结果表
明该蛋白不具有跨膜结构域。登录 http:/ /www. cbs.
dtu. dk /services /SignalP /，运用神经网络(neural net-
works，NN)分析模型对 T-NTGP2 蛋白进行信号肽结
构分析，结果表明 T-NTGP2 不具有信号肽。登录
http:/ /www. expasy. org /cgi-bin /prosite /PSScan. cgi，
对 T-NTGP2 蛋白进行功能位点预测，该基因编码的
氨基酸序列中包含 3 个功能位点，1 个 Longin 结构
域(7 － 123 bp) ，1 个 v-SNARE 结构域(139 － 199
bp) ，1 个小突触囊泡蛋白(VAMP)典型基元(157 －
176 bp)。虽然 T-NTGP2 不含跨膜区，但其羧基端
有一个异戊烯基结合位点，可以把法尼基或牻牛儿
牻牛儿基加到该位点的半胱氨酸残基上进行转录后
修饰，从而将其锚于胞膜上。
3 讨论
从烤烟品种南江 3 号均一化 cDNA文库中筛选
到一条烤烟 SNAREs 蛋白基因的 cDNA，通过 Blast
比对，其与其他植物的 SNAREs 蛋白 Ykt6 高度同
源，并于以前报道的烤烟 Ykt6 编码氨基酸序列只相
差两个氨基酸，基于生物信息学方法，基本可以认定
其编码烤烟 SNAREs 蛋白 Ykt6 蛋白，属于烤烟
SNAREs蛋白家族。
植物 SNAREs蛋白除了参与囊泡运输的基本功
能，还可以促进植物细胞板形成，与离子通道蛋白相
互作用，提高植物的抗病性及参与植物的向重力性
作用。植物 SNAREs蛋白不仅对植物生长发育起作
用，在抵御生物与非生物胁迫过程中也起重要的作
用［1］。虽然蛋白序列基本性质分析发现，T-NTGP2
基因编码的蛋白没有疏水区域、不含跨膜区，但其
羧基端有一个异戊烯基结合位点，可以把法尼基
或牻牛儿牻牛儿基加到该位点的半胱氨酸残基上
进行转录后修饰，从而将其锚于胞膜上。从功能
位点及 motif 分析，T-NTGP2 与 Ykt6 很相似，属于
一种特殊的 Longins。本研究通过烟草 SNAREs 蛋
白基因的克隆，对更深入地了解烟草 SNAREs蛋白
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2011 年第 7 期 胡重怡等:烤烟 SNARE蛋白基因 T-NTGP2全长 cDNA克隆与生物信息学分析
家族基因功能和膜泡运输的机制奠定了基础。
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(责任编辑 李楠)
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