全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究
李瑞芳 薛雯雯 黄亮 熊前程 王彬
(河南工业大学生物工程学院,郑州 450001)
摘 要: 为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用, 对 Spizizen创立的枯草芽孢杆菌 DNA转化方法进行改进。用 GM I和
GM II溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株 BS501a、营养缺陷型突变株 DB1342和非营养缺陷型突变株W B800,用改进的方法制
备感受态细胞, 用 7 5 kb质粒 pSBPTQ进行转化,并研究 RNA、酵母粉、水解酪蛋白、培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影
响。结果表明, 该方法适用于不同基因型枯草芽孢杆菌的质粒转化, 营养缺陷型突变株 DB1342的转化率为 750 CFU /g
DNA,非营养缺陷型突变株WB800转化率为 1 070 CFU /g DNA,野生型菌株 BS501a转化率为 270 CFU /g DNA。根据影响
转化效率的因素, 推测在该方法中,枯草芽孢杆菌质粒转化原理:一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作
用下, 细胞壁和细胞膜形成缺陷, 使外源 DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内。
关键词: 枯草芽孢杆菌 感受态细胞 质粒转化方法
Competent Preparation and Plasm id Transformation ofBacillus subtilis
L iRuifang XueW enw en H uang L iang X iong Q iancheng W ang Bin
(College of B ioengineering,H enan University of Technology, Zhengzhou 450001)
Abstrac:t In order to fac ilita te the usage o fB. sub tilis in industr ia l production, the DNA transform ation m ethod founded by Spiz
izen w as m od ified. W ildtype strain BS501a, nutrient defic iency mu tant DB1342 and nutr ient nondeficiency m utan tWB800 w ere in
duced to be competent by GM I and GM II so lutions using mod ified transform ation m ethod, wh ich a 75 kb p lasm id pSBPTQ w as trans
form ed in to. The e ffects of RNA, yeast extrac t, hydrolyzed case in and cu lture me thod on the transfo rm ation effic iency w ere stud ied. The
resu lts show ed that them odified transform ation m ethod was su itab le forB. subtilis strains o f all kinds of gene type, the transform ation ef
fic iency of nutrient defic iency mutant DB1342 was 750 CFU /g DNA, the transform ation effic iency of nutr ient nondeficiency m utant
W B800 was 1 070 CFU /g DNA, and the transfo rm ation e fficiency of w ildtype strain BS501a was 270 CFU /g DNA. Accord ing to the
resu lts o f the affecting factors on the transforma tion e fficiency, the transfo rm ation m echanism w ere speculated: the form ingdefects o f the
ce ll wa ll and ce llmembrane ofB. subtilis gave chance o f heterogeneous DNA to enter the ce lls ofB. subtilis under the e ffects o f ex terna l
nutritiona l cond itions, Ca lc ium ions andM agnesium ions.
Key words: Bacillus subtilis Com petent ce ll P lasm id transfo rm ation m ethod
收稿日期: 20101103
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 31071922) ,河南省重点科技攻关项目 ( 0623030300)
作者简介:李瑞芳,女,博士,副教授,硕士生导师,研究方向:生物技术; Em ai:l lr@f haut. edu. cn
枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属中具有应用价值的
菌种之一。建立简便、有效的 DNA转化方法,对枯
草芽孢杆菌的基因改造、提高其生产性能具有重要
意义。枯草芽孢杆菌质粒转化方法主要有原生质体
转化 [ 1]、电击转化 [ 2]和 CaC l2转化 [ 3]。与电击转化
方法相比,原生质体转化条件温和,不需相应的转化
设备, 但转化效率低; C aC l2转化耗时长,转化效率也
不高。 1958年, Sp izizen[ 4]建立了一种枯草芽孢杆菌
营养缺陷型突变株染色体 DNA转化方法。李瑞芳
等 [ 5]根据 Spizizen建立的枯草芽孢杆菌营养缺陷型
突变株转化方法进行了质粒 DNA转化, 但该方法在
非突变型枯草芽孢杆菌质粒转化中应用未见报道。
本研究对 Spizizen创立的枯草芽孢杆菌营养缺
陷型突变株染色体 DNA转化方法进行改进, 使其适
用于枯草芽孢杆菌工业生产过程中的基因改造。工
业生产用枯草芽孢杆菌通常是野生菌株或突变菌
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
株。在本研究中, 选用营养缺陷型突变株 DB1342、
非营养缺陷型突变株 WB800和从土壤中分离的野
生型枯草芽孢杆菌 BS501a为模式菌株。由于质粒
大小与转化频率成反比,分子量小的质粒易于转化,
转化效率高;而分子量大的质粒相对来说转化效率
低。本研究选用 75 kb的大质粒进行转化, 可为分
子量较大的质粒转化提供参考。
1 材料和方法
11 菌株和质粒
B. sub tilis BS501a由本实验室从土壤中分离获
得 [ 6] ; B. subtilisWB800 ( nprE aprE epr bpr mprble
np rBbsr vpr wprAhyg)由加拿大 Dr. W ong惠
赠; B. subtilis DB1342( his np rR2 nprE18 ap rAS epr )
由中山大学罗进贤教授惠赠; pSBPTQ ( 75 kb)由本
实验室构建 [ 5] ,是一种大肠杆菌 -枯草芽孢杆菌穿
梭型表达载体,在大肠杆菌中表现氨苄青霉素抗性,
在枯草芽孢杆菌中表现卡那霉素抗性。
12 培养基
121 枯草芽孢杆菌感受态制备用贮存液 10
Spizizen sa lts母液: 15% K2HPO43H2O, 6% KH2PO4,
2% (NH 4 ) 2 SO4, 02% MgSO4, 1% 柠檬酸钠,溶于蒸
馏水中, 66 104 Pa高压灭菌,室温贮存。
10%酵母粉、1% 水解酪蛋白和 25 mmo l /L
M gC l2, 66 104 Pa高压灭菌, 酵母粉溶液最好现用
现配, 水解酪蛋白和 MgC l2溶液可室温贮存; 20%葡
萄糖、025% 所需氨基酸和 01 mo l/L CaC l2, 用
022 m的微孔滤膜过滤除菌,葡萄糖溶液和 CaC l2
溶液室温贮存,氨基酸溶液 - 20 贮存。
122 枯草芽孢杆菌感受态制备用培养基 10mL
GM I: 1mL 10 Sp izizen salts, 01 mL 10%酵母粉,
025mL 20%葡萄糖, 02 mL 1% 水解酪蛋白, 02
mL 025%所需氨基酸, 补充灭菌蒸馏水至总体积
10 mL。
10 mL GM II: 1 mL 10 Spizizen salts, 005 mL
10%酵母粉, 025 mL 20%葡萄糖, 004 mL 1%水
解酪蛋白, 02 mL 025%所需氨基酸, 005 mL 01
mo l/L CaC l2, 1 mL 25 mmo l/L M gC l2,补充灭菌蒸馏
水至总体积 10mL。
DB1342为组氨酸合成缺陷型突变株,所需氨基
酸为组氨酸; BS501a为野生型, WB800为非营养缺
陷型,因此,将 GM I和 GM II培养基中的所需氨基酸
改用无菌蒸馏水代替。
13 转化用质粒的制备
采用文献 [ 7]介绍的碱裂解法分别从 Ecoli
DH5( pSBPTQ )中提取质粒 pSBPTQ, 用适量 TE溶
解, - 20 存放备用。
14 改进的枯草芽孢杆菌感受态细胞制备方法
挑取一新鲜培养的枯草芽孢杆菌单菌落接种于
25mL GM I培养基中, 30 130- 150 r/m in振荡培
养过夜;将过夜培养物按 10%接种量接种于 25mL
新鲜的 GM I中, 37 200- 230 r /m in振荡培养 35
h;再将培养物进行第二次传代, 接种于 5 mL GM II
培养基中,突变型菌株 DB1342和 WB800以 10%接
种量进行第二次传代,野生型菌株 BS501a按 5%接
种量进行第二次传代, 37 200- 230 r/m in振荡培
养 90 m in; 取 1mL培养物, 5 000 r/m in室温离心 5
m in, 用 1 /10体积上清液重新悬浮细菌沉淀, 即为枯
草芽孢杆菌感受态细胞。
15 质粒转化
取质粒 pSBPTQ加至 3种枯草芽孢杆菌感受态
细胞悬液中,至终浓度 1 g /mL,质粒体积不超过感
受态细胞悬液体积的 1 /20, 混匀。 37 水浴中静置
30- 60m in, 37 200 r/m in振荡培养 2- 4 h, 涂含
有卡那霉素 ( 10 g /mL )的 LB固体培养基上, 每
100 L转化体系涂 1个平板, 每一种枯草芽孢杆菌
的转化体系涂 5个平板, 37 倒置培养过夜。计算
平均转化率 (转化子个数 /g DNA)。
2 结果
21 不同基因型枯草芽孢杆菌转化效率
将 pSBPTQ 转化 Bsubtilis DB1342、WB800和
BS501a感受态细胞, 过夜培养后,在含 10 g /mL卡
那霉素的 LB平板上生长的枯草芽孢杆菌克隆即为阳
性转化子,转化结果如表 1所示。由结果可知, 该转
化方法适用于 3种不同基因型枯草芽孢杆菌转化。
表 1 质粒 pSBPTQ转化枯草芽孢杆菌结果
受体菌株 转化率 ( CFU /g DNA)
DB1342 750 10
WB800 1070 18
BS501a 270 5
228
2011年第 5期 李瑞芳等:枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究
试验结果表明,不同基因型枯草芽孢杆菌菌株用
同一种 DNA转化方法,所得转化效率不同, 突变株转
化率高,这可能是因为突变型枯草芽孢杆菌由于基因
突变, 细胞壁和细胞膜结构形成和细菌生长受到影
响,使其更易处于感受态,而野生型菌株由于生长迅
速,细胞壁、细胞膜结构完整,不利于感受态的形成。
22 RNA对转化结果的影响
用纯化质粒 DNA、加终浓度 05 g /L RNA的
质粒 DNA,及提取质粒时 RNA未被 RNase消化的
质粒 DNA /RNA混合物,分别转化 B. sub tilis BS501a
感受态细胞, 发现 RNA可提高质粒转化效率, 大约
提高 5倍左右 (表 2) ,可能是 RNA具有保护 DNA、
防止核酸酶水解的作用。
表 2 RNA对枯草芽孢杆菌质粒 pSBPTQ转化的影响
RNA 转化效率 ( CFU /g DNA)
质粒 DNA /RNA混合物 270 10
加 RNA至终浓度 05 g/L的质粒 DNA 250 15
纯化的质粒 DNA 50 8
23 酵母粉和水解酪蛋白对转化效率的影响
为判断酵母粉在质粒转化中的作用, 在配置
GM I、GM II时,用无菌蒸馏水代替酵母粉,按 14介
绍的方法制备 B. subtilis BS501a感受态细胞, 用质
粒 pSBPTQ转化,结果转化效率大大降低, 说明酵母
粉有利于枯草芽孢杆菌感受态的形成。
用无菌蒸馏水代替 GM I、GM II中的酵母粉和水
解酪蛋白, 将得到的培养基制备 B. subtilis BS501a
感受态细胞,用质粒 pSBPTQ转化, 没有得到转化子
(表 3) ,说明在枯草芽孢杆菌感受态形成的起始阶
段需要外界环境提供一定的营养。
表 3 酵母粉和水解酪蛋白对枯草
芽孢杆菌质粒转化的影响
培养基 转化效率 ( CFU /g DNA)
GM I和 GM II 270 10
不含酵母提取物的 GM I和 GM II 30 3
不含酵母提取物和水解酪蛋白的 GM I
和 GM II 0
24 培养方法对质粒转化的影响
将枯草芽孢杆菌 BS501a接种于 GM I中, 分别
以 130- 150 r/m im和 200- 230 r /m in的转速振荡
培养过夜,按 14介绍的方法制备感受态细胞,发现
200- 230 r/m in快摇过夜试验组转化效率低 (表
4)。BS501a的 GM I培养物由 GM I第二次传代到
GM II时,分别按 5%和 10%接种量接种, 将得到的
感受态细胞进行 DNA转化, 发现 10%接种量的试
验组转化效率也降低了 (表 4)。
表 4 培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影响
培养方法 转化效率 ( CFU /g DNA)
130- 150 r/m im 慢摇过夜准备种子
液,第二次传代时以 5%接种量接种 270 10
200- 230 r/m in快摇过夜准备种子
液,第二次传代时以 5%接种量接种 100 10
130- 150 r/m im 慢摇过夜准备种子
液,第二次传代时以 10%接种量接种 100 8
3 讨论
W ang等 [ 8 ]研究发现, 枯草芽孢杆菌自然转化
时,感受态高峰出现在对数生长期。从我们的研究
结果可以看出,枯草芽孢杆菌在感受态形成的前期
需要营养丰富的培养基培养, 以使其迅速达到对数
生长期。因而, GM I中的酵母粉和水解酪蛋白对感
受态的形成具有重要作用。Wang等 [ 8]的研究还发
现 20 mmo l/L镁离子可提高自然转化效率。Ausub
e l等 [ 9 ]根据大肠杆菌质粒转化原理, 采用 01mo l/L
冰冷 CaC l2处理环状芽孢杆菌, 实现质粒转化。可
见镁离子、钙离子对枯草芽孢杆菌感受态的形成均
有促进作用。在本研究中, 我们通过控制接种到
GM II中枯草芽孢杆菌生物量来实现钙镁离子对受
体细胞的充分作用。因此,在本转化方法中,枯草芽
孢杆菌感受态形成的原理可能是处于增殖分裂旺盛
期的枯草芽孢杆菌突然转入营养贫瘠的培养基中,
由于营养限制,饥饿诱导枯草芽孢杆菌细胞内发生
一系列生理变化,细胞壁和细胞膜形成缺陷,细胞通
透性增加, 利于外源 DNA的进入, 同时在钙离子和
镁离子充分作用下,提高了其感受态形成率;在钙离
子作用下,转化体系中的 DNA形成抗 DNA酶的羟
基 -钙磷酸复合物, 黏附于细胞表面, 提高了外源
DNA的转化效率。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
枯草芽孢杆菌在自然条件下即可吸纳外源 DNA,
以适应外环境变化, 但感受态的形成受 群体感应
(Q uorumsensing ) [ 10]和 情景选择 ( Ep isodic Se lec
t ion) [ 11]的限制,一般转化率较低。由于自然转化
要求活性 DNA,对分离纯化的 DNA ( cellfree DNA )
的转化需要在转化体系中加入大肠杆菌培养物,因
而无法保证枯草芽孢杆菌吸纳 DNA的专一性。枯
草芽孢杆菌原生质体转化方法中, 原生质体的形成
对使用溶菌酶的量、溶菌酶的破壁时间和破壁温度
等条件均有严格要求, 试验步骤繁琐, 转化效率低。
电击转化法对试验技能有较高的要求, 电场强度是
电击转化中最敏感的参数,直接影响转化效率;外加
电场引起细胞部分原生质化,在没有特殊再生条件
的情况下,部分转化子将会死亡,降低了转化子获得
率。本实验室比较了电击转化法和本研究所使用的
化学转化法对枯草芽孢杆菌分泌表达的影响, 发现
电击转化法对细胞分泌表达的损伤大于化学转化
法。本研究建立的化学转化方法,试验操作简便,营
养要求低,仪器设备无特殊要求, 耗时短, 适用于各
种基因型枯草芽孢杆菌的转化,对枯草芽孢杆菌工
业化生产过程中的基因分子改造具有重要应用
价值。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠 )
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