全 文 ：健物杖术通报
技 术 与 方 法 丑了口2百C 升四刀乙口G Y 2以为 年增 刊
噬菌体展示技术及其在寄生虫研究中的应用
何金桃 ,2 金亚美 2 刘金明 2 蔡幼民 2 岳城
( 新组农业大学动物医学学院 ,乌鲁木齐83 0 52 ;中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放
实验室 ,上 海 2(X) 24 1)
摘 要: 噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肤的编码基因或D N A 序列擂入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位! ,使
外派基因随外壳蛋白的表达而表达 ,并随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术 在研究蛋白质识别或蛋白质与
核故相互作用的生物学过程 蛋白质定向改造 研制新型多肤药物 疫苗和杭体等多领城具有重要作用就噬菌体展示技术基
本原理及特点, 以及噬菌体展示技术在寄生虫研究中的应用做一简要综述
关扭词: 噬菌体展示 融合蛋白 抗原杭体作用 筛选
Pb a ge D isP la y T eeh n o lo gy a nd its A P P lica ti on
in Pa ra sitolo gy R esea rch
H e Jinta o,, Jin Y axn ei, Liu Junm 犷 C aiY ourun , Y ue C he飞,
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Pre P姗 tion of recomb inan t an tibodies In 面s 确 ele, th e basic Pn ciP leS , th e advan 召es and draw backs of di fre rent sy te!ns of thi s
tec俪 q ue w ere su mrna 二d , an d it s 叩p lieatio ns in th e p ~ to lo 孚面 resa ehs w ere 习so an 习yze d .
K ey wo rd s : p ha dis ph y Fus ion pro tein An ti 罗 n antib ody in te以 tio n sere eni n g
噬菌体展示技术是将外源肤或蛋白编码基因
插人到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置与其
融合 ,使外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬
菌体表面的生物技术 噬菌体展示技术起源于
19 85 年 Sm ith G P 等川的研究 ,他们首次证实丝状噬
菌体 fd 基因组能通过基因工程的手段进行改造 ,
第一次将外源基因与丝状噬菌体的 p ul 基因融合 ,
使目的基因编码的多肤展示在噬菌体表面 ,且获得
的重组噬菌体可在体外稳定增殖 ,从而创建了噬菌
体展示技术 198 年 P助耐ey 等12将已知抗原决定
族与 p ul 的 N 端融合呈现在表面 ,可特异性地被抗
体选择出来 ,并据此提出通过构建随机肚库以了解
抗体识别的抗原决定簇表位的设想.199() 年 M cCaf-
fe rty 等13报道了用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单
链抗体的方法 ,从而开始了这项技术广泛应用的新
时代
1 噬菌体展示技术的基本原理
由于每个噬菌体粒子的衣壳表面只含有以一
收稿 日期:2以拍一04 一7
作者简介 :何金桃(19 84 一) ,男 ,安徽集湖人 ,硕士研究生 ,研究方向为寄生虫分子生物学;E一m 山 :bejin t创鸿5胭 y曲o .Co m .c n
通讯作者 :金亚美 ,女 ,副研究员;E一耐 l:yam ej in @y ah o .com .cn
2 (X 为 年 增 刊 何金桃等 :噬菌体展示技术及其在寄生虫研究中的应用 105
定的形式显露的唯一的核昔酸顺序编码寡肤 ,所以
通过插人不同核昔酸序列 ,则可以构建含大量信息
的噬菌体肤段文库 噬菌体展示就是使用分子克隆
方法将外源性肤段以融合蛋白形式表达于噬菌体
颗粒表面 , 且不影响和干扰噬菌体的生活周期 ,同
时保持外源基因的天然构象 ,也能被相应的抗体或
受体所识别 由此建立的展示文库可通过将靶分子
固定在固相支持物上 ,采用适当的淘洗(palm ing )方
法 ,洗去非特异结合的噬菌体 ,筛选出目的噬菌体 ,
通过测序获得与靶分子结合多肤的核昔酸序列
根据展示分子的不同 , 噬菌体展示库分为 :抗
原决定簇库 CD N A 库及抗体库 抗原决定簇库又
分为合成型抗原决定簇库及靶基因型抗原决定簇
库 CD N A 库是在噬菌体上插人从组织或细胞中抽
提的m R N A 的互补 D N A 片段 , 用于筛选与受体特
异结合的片段 抗体库是先从免疫或未免疫的机体
获取抗体的可变区基因,将这些基因以轻链或重链
的融合形式表达在噬菌体表面组成噬菌体抗体库 ,
库中每一个噬菌体在其表面可表达一种特异性抗
体
2 噬菌体展示系统
为了满足表达基因组的不同需要 ,噬菌体展示
系统已经从丝状噬菌体展示系统拓展到 入噬菌体
展示系统 , T4 噬菌体展示系统以及 T7 噬菌体展示
系统 下面就各展示系统的特点及优缺点作一简单
介绍
2.1 丝状噬菌体展示系统
丝状噬菌体是单链环状 D NA 病毒 ,包括 M 13 ,
fd ,fl 噬菌体 其基因组为 6.4 kb ,编码 10 种蛋白 ,
其中 5 种为结构蛋白 ,即主要衣壳蛋白 P皿和次要
衣壳蛋白 P ul PVI P Vl P lx [4, 5] ,其中 P ul 和 P恤与
噬菌体展示相关 P ul 蛋白位于噬菌体颗粒的一端 ,
其在结构上可分为 N l N Z 和 CT 3 个功能区域 ,有
2 个位点可供外源序列插人 ,可以容纳分子量高达
ro kD 的大小不同的外源肤段和蛋白 P ul 蛋 白展
示系统的拷贝数较少为 3一5 个 ,可用于筛选高亲和
力的配体 P扭蛋白位于丝状噬菌体的最尾端 ,呈线
状或球状 ,其 C 端与外壳相连 , N 端游离在外 ,可用
于融合外源肤段 ,如五肤一九肤 P姗不能融合太长
的肤链 , 因为较大的多肤或蛋白会造成空间障碍 ,
影响噬菌体装配 ,使其失去感染力 P姗的拷贝数可
多达 2 70 个左右 , 用于筛选亲和力较低的配体
此外 ,利用丝状噬菌体 P VI 蛋白展示的研究也有报
道l6] P VI 蛋白的 C 端暴露于噬菌体表面 ,可以作为
外源蛋白的融合位点 ,可用于研究外源蛋白 C 端结
构域的功能 ,从所掌握的文献来看 ,该系统主要用
于 D N A 表面展示文库的构建 ,并取得了不错的筛
选效果
丝状噬菌体展示系统是最早开发的展示系统 ,
技术最为成熟 ,但是该系统展示的多肤或蛋白需要
经过细胞膜分泌出来 ,不利于展示那些难以分泌的
肤或蛋白 , 并且其 N 端可以融合的外源多肤容量
有限
2. 2 入噬菌体展示系统
入噬菌体是最早使用的克隆载体 ,它在分子克
隆中始终起着重要的作用 入噬菌体为两端不闭合
的线性双链 D N A ,其末端为长 12 个核昔酸的互补
单链 ,基因组约为 50 kb 入噬菌体展示系统是将外
源序列插人噬菌体主要尾部蛋 白 PV 梭基端折叠
区 , 或噬菌体头部组装必需的 D 蛋白 N 端或 C 端
1, 81 ,实现外源蛋白的表面展示 入噬菌体是在宿主
细胞内完成装配 ,无需将外源肚或蛋白分泌到细菌
胞膜外 ,可展示有活性的 分子量在 10 kD 以上的
大分子蛋白及对宿主细胞有毒性的蛋白 与 M 13
噬菌体展示系统相比 ,入噬菌体缓解了 M 13 噬菌体
展示系统所遇到的有关翻译终止密码子和蛋白分
泌方面的两个难题 入噬菌体展示系统另一个很好
的特点是 : 噬菌体上融合蛋白和 D 蛋白的比例可
以由宿主抑制 tR NA 活性加以控制 , 这对于展示那
些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有
用 但是该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均
1 个分子/ 噬菌体, 这表明外源蛋白质或多肤可能
干扰了入噬菌体的尾部装配
2. 3 T4 噬菌体展示系统
T4 噬菌体展示系统是 20 世纪 90 年代中期建
立起来的一种新的展示系统 T4 噬菌体的基因组
为双链线性 D N A ,约 16O kb T4 是双股 D N A 噬菌
体中唯一能够在体内产生空衣壳的噬菌体 ,它能够
将两种性质完全不同的外源肤或蛋白, 分别与 T4
衣壳表面上的外壳蛋白 SO C(9 ku)和 H o C (40 ku)融
106 位物杖术通稚丑勿. h肋云恻 2X为 年 增 刊
合而直接展示于 T4 噬菌体的表面, 因此它表达的
蛋白不需要复杂的蛋白纯化 ,避免了因纯化而引起
的蛋白质变性和丢失 目前使用较多的是外壳蛋白
SO C 展示系统l9] SO C 是 T4 衣壳组装非必需的 ,且
不论是在体内还是体外 ,它都具有与成熟的衣壳表
面特定位点高亲和力的专一结合的能力 T4 噬菌
体是在宿主细胞内装配,不需通过分泌途径,因而可
展示各种大小的多肤或蛋白质 ,很少受到限制 T4
噬菌体拷贝数高 , 展示的容量大 (35 ku 以上 ) ,在
分析抗原表位 受体 细胞因子等方面有非常大的
应用潜力 此外 ,它还可以同时在两个位点展示性
质完全不同的两种蛋白 ,构建成双重展示系统 但
T4 噬菌体展示系统也存在一定的缺点 , 如高价的
展示 ,不适于高亲和力配体的筛选
2. 4 竹 噬菌体展示系统
竹 噬菌体由双链线性 D N A 组成 ,基因组为 39
93 6 bp ,其中有 160 如 的突出末端 噬菌体衣壳
蛋白通常有 2 种形式 , 10A (334 氨基酸 ) 和 ro B
(397 氨基酸 ) 10 B 是在 10A 341 氨基酸的翻译框中
产生的 , 大约占衣壳蛋白的 10 % 功能性衣壳由
10 A 或者 10B 或者由 1以 和 10 B 以一定的比例
构成 ,这表明 ,竹 衣壳蛋白能够容纳变异体 在 竹
噬菌体上 ,被展示的蛋白或多肤的编码序列被克隆
到 10B 的第 34 8 个氨基酸后的多克隆位点上 110
蛋白与 C 端融合表达的 ,而非与 N 端融合 ,因此插
入的基因片段中含有终止密码子也不影响融合蛋
白的完整表达
竹 噬菌体在 E. co h 胞浆内组装 ,成熟的噬菌体
无需通过细胞膜分泌 , 而是经细胞裂解进行释放 ,
其展示多肤和蛋白的范围更为广泛
竹 噬菌体可以容纳插人基因片段约在 30
bp一3 戊旧娜 之间 , 和噬菌体衣壳蛋白融合展示的
蛋白或多肤大小可为 50一1200 个氨基酸 ,能够拷贝
展示高 中 低不同分子量的蛋白或多肚 另外 ,竹
噬菌体生长迅速 ,复制速度快 ,克隆效率高以及稳
定的特性 , 使之成为替代其他传统系统的更好选
择
3 噬菌体展示技术在寄生虫研究中的应用
噬菌体展示技术发展至今 ,在研究抗原抗体作
用 蛋白质相互作用 蛋白质与药物作用 ,甚至蛋白
质与核酸作用等方面均提供了有力的分析手段 ,在
寄生虫病研究及防治中也有了广泛的应用并取得
进展 ,尤其是在候选疫苗和免疫诊断候选分子的筛
选及分子间相互作用等方面的研究中起到了重要
的作用
R铭et等Il] 利用噬菌体展示技术得到了库容量
约为sxlo乍fo , 富含阿米巴种属特异性识别的噬菌
体抗体文库和富含致病性阿米巴种属特异性识别
的噬菌体抗体文库 H oe 等l川用岗地弓形虫全虫免
疫小鼠 , 构建了噬菌体展示的单链可变区抗体文
库 , 用虫体人侵宿主有关的重组蛋白筛选文库 ,获
得 2 个单克隆抗体 ,进一步实验结果表明获得的单
克隆抗体具有较高的抗寄生虫抗性 姚龙泉等 l3]为
筛选微小隐抱子虫保护性抗原基因 ,成功构建了微
小隐抱子虫 竹 噬菌体展示文库 噬菌体文库的构
建 , 有助于快速筛选和生成高亲和力的特异性抗
体 ,为寄生虫病诊断和治疗奠定了重要的基础
R oble 等 [,4] 采用基 于 M 13p 恤衣壳蛋 白的
pG 8sA ET 载体构建肥头绦虫的 DN A 展示文库 ,在
用免疫血清生物淘洗后 ,筛选出了表达肥头绦虫抗
原的 3 个克隆分子 经脑成像确诊的神经性囊尾坳
病患者 ,其脑脊髓液及血清标本中的抗体能被这 3
个分子识别 这为神经性囊尾坳病的诊断提供了新
的方法 钱曼等阅用日本血吸虫虫卵单克隆抗体
6B 12 筛选咙菌体随机 巧 肚库 , 获得 13 株外源多
肚完全相同的噬菌体克隆 ,经过分析表明噬菌体多
肤模拟抗原具有替代天然抗原用于诊断血吸虫病
的可能性 U uteth ac h 等 l6] 构建基于竹 噬菌体的恶
性疟原虫 DN A 展示文库 ,筛选出 7 个能与人类血
影细胞及带 4.1 蛋白特异结合的恶性疟原虫蛋白 ,
从而为研究寄生虫和宿主红细胞膜之间的相互作
用提供了一个新方法
噬菌体展示技术也取得了长足的进展 早在
1985 年 , Sm ith G P 提出噬菌体展示技术时就指出
丝状噬菌体有免疫原性 ,用融合噬菌体来免疫可以
引发针对被展示肚的免疫反应 ,他认为这可能是获
取抗体或制造疫苗的有效方式 198 年 , Cruz VF
等阴把疟原虫的环抱蛋白基因克隆进丝状噬菌体 p
皿基因后在噬菌体表面展示了重组蛋白 ,并用重组
曦菌体免疫兔子证实了展示肤的抗原性和免疫原
2 X为 年 增 刊 何金桃等 :噬菌体展示技术及其在寄生虫研究中的应用 10 7
性 自此之后 ,许多研究者应用噬菌体作为载体 ,展
示不同疾病的抗原特异表位 ,都能引发强的免疫反
应 ,诱发高水平的特异抗体 ,并且无需使用佐剂 ,证
实噬菌体展示载体是一个高效的疫苗载体
G nanas ek ar 等 l8]构建了基于 竹 噬菌体载体的
马来丝虫感染期幼虫 cD NA 展示文库 ,并利用患者
血清筛选得到了优势抗原 A LT 一2 的重组体 rA LT 一
2 ,对其进行疫苗效能评估 ,在沙鼠及小鼠模型中均
获得了超过 73% 和 64 % 的较高保护力 Gre e~ d
等 19将编码 NA N PN AN PN AN P1 2 个氨基酸的基因序
列插入丝状噬菌体 fd 的主要衣壳蛋白 gP 恤区 (gP
恤为丝状噬菌体的主要衣壳蛋白 , 拷贝数约为 2
70 , 较 gP In 多得多) 成功构建的杂合噬菌体 fd /
fd M A L一1 中约 113 拷贝的衣壳蛋白 gP 恤中融合
(N AN P) 3 , 因 gP 他的拷贝数多 ,故 NA N P 重复片段
呈现在 gP 恤表面后免疫原性大大地增强 且实验
证明 : 在不加佐剂的情况下 , 杂合噬菌体 fd /fd
M A L一l 能使多个品系小鼠产生较强的免疫应答 ,
有望用来制备廉价而高效的疫苗 周东明等侧用感
染旋毛虫的鼠血清 IgG 筛选噬菌体 7 肤文库 ,用获
得的混合阳性噬菌体免疫小鼠 ,观察其抗血吸虫的
保护效果 , 减虫率和减 卵率分别达到 42 .8 % 和
6 .3% 陈新华等l2] 从噬菌体 7 肤文库中筛选细粒
棘球勤头节抗原的模拟表位 ,获得具有良好免疫活
性和特异性的段肤 ,可作为细粒棘球勤病疫苗的候
选免疫原 吴海威等 网 用纯化的抗 日本血吸虫
Sj 3 8 的多克隆抗体免疫筛选噬菌体 12 肤库 ,随机
挑选的 30 个克隆均能被抗 Sj 338 抗体识别 对 1
个具有生物学活性的阳性克隆进行测序 ,共获得 4
种抗原表位 , 将这 4 种表位混合或单独免疫小鼠 ,
结果表明混合免疫组抗体滴度明显高于单独免疫
组 ,佐剂并不影响其抗体滴度 混合免疫诱导产生
的减虫率和减卵率均高于单独免疫组 王欣之等
[2 31 用日本血吸虫 SSj l4 单抗筛选噬菌体随机肤库
获得的 3 个阳性噬菌体克隆混合免疫小鼠 ,所获得
的减虫率和减卵率均高于单个噬菌体克隆
4 结语
综上所述 ,噬菌体展示技术是一种简便 有效
易于控制的用于表达外源基因的操作系统 ,在诸多
研究领域都展示了其独特的优势 , 有巨大应用潜
力 但是这项技术仍存在着 自身的局限性 ,如密码
子的偏爱性 ,库容量的有限性,氨基酸的修饰受宿主
菌限制等等 随着噬菌体展示技术本身的不断发展
和完善 ,相信不久的将来,该技术在诸多领域中将有
更广泛的应用,产生更深远的影响
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