全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·研究报告·
收稿日期：2008-08-28
基金项目：天津科技大学科学研究基金项目（20080202），国家科技基础平台项目（2005DKA21204-10）
作者简介：张业尼（1984-），女，硕士研究生，从事微生物与生化药学研究；Tel：022-60601958，E-mail：zhangyeni@yahoo.com.cn
通讯作者：路福平，男，教授，博士生导师
磷脂酰丝氨酸合成酶 （PSS） 是磷脂酶 D 家族
成员之一 ，已发现其于细菌 [1，2]、酵母 [3]和哺乳动物
细胞 [4，5]中。 其中，源自大肠杆菌的磷脂酰丝氨酸合
成酶具有该家族明显的序列特征，即含有 2 个间隔
出现的 H（x）K（x）4D 保守序列 [6]，此外，该酶是合成
磷脂酰丝氨酸等稀有磷脂的良好工具酶，其催化反
应属于 ping-pong 反应机制， 在水相和底物积聚相
的界面处对底物进行“修饰”，反应速率不仅取决于
底物浓度，还与两性底物、催化剂、抑制剂的三维结
构有很大关系 [7，8]。 由于磷脂在结构上的相似性，用
一般的物理、化学方法难以制备高纯度 、多功能特
性的单一磷脂 ，而利用该酶的高度专一性 ，对现有
来源广泛的粗品磷脂进行转化和改性，可以制备一
些稀有磷脂，在医药及食品保健品领域具有很大的
应用潜力 [9]。
磷脂酰丝氨酸合成酶（PSS）在大肠杆菌中含量
低 （不到蛋白总含量的 0.1%），不利于直接工业化
发酵生产，而枯草芽孢杆菌表达系统是一种较为理
重组磷脂酰丝氨酸合成酶的分离纯化及酶学性质研究
张业尼 路福平 李玉 王建玲
（天津市工业微生物重点实验室 天津科技大学生物工程学院，天津 300457）
摘 要： 利对重组枯草芽孢杆菌（pBES-pss）表达的磷脂酰丝氨酸合成酶进行分离纯化及酶学性质研究。pBES-pss
发酵后的粗酶液经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、SP-Sepharose HP离子交换层析和 Sephadex G-75凝胶层析，基本
获得电泳纯的重组磷脂酰丝氨酸合成酶，比活力可达 13.62 U/mg，分子量约为 53 kD。酶学性质研究表明，该酶催化卵磷
脂水解反应的最适 pH8.0，最适温度为 35℃。稳定性研究表明：该酶在 pH 6.5~9.5区间和低于 45℃温度下稳定。表面活性
剂及金属离子对该酶水解活性的影响结果表明，SDS、Tween20、Tween80对该酶有抑制作用，Triton X-100对该酶有增强
作用；Mg2+、Zn2+、K+对该酶有抑制作用，Ca2+、Mn2+和 EDTA对该酶有增强作用。
关键词： 枯草芽孢杆菌 磷脂酰丝氨酸合成酶 纯化 性质
Purification and Biochemical Properties of Phosphatidylserine
Synthase Produced by Bacillus subtilis DB104（pBES-pss）
Zhang Yeni Lu Fuping Li Yu Wang Jianling
（Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology，The College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，
Tianjin 300457）
Abstract： Phosphatidylserine synthase excreted from Bacillus subtilis DB104（pBES-pss）which was reconstructed.
The phosphatidylserine synthase was purified by the procedures including amoninium sulfate precipitation，ultrafiltration，SP-
Sepharose HP chromatography and Sephadex G-75 chromatography. By multi-step purification，the phosphatidylserine
synthase was purified to 39.59 folds and the specific activity of the Phosphatidylserine synthase was up to 13.62 U/mg.
Analysed by SDS-PAGE，the molecular weight of purified phosphatidylserine synthase was showed as 53 kD. The optimum
pH and temperature for hydrolysis of phosphatidylcholine were 8.0 and 35℃ respectively. There were some factors that
can inhibit enzyme activities，induding SDS、Tween20、Tween80，while some ions such as Ca2+，Mn2+，EDTA and TritonX-
100 can improve its activity.
Key words： Bacillus subtilis Phosphatidylserine synthase Purification Properties
2009年第 3期
想的异源蛋白表达系统，可以高效地表达具有生物
活性的异源蛋白并将其分泌到培养基中，且具有较
高的生物安全性。 目前，已将磷脂酰丝氨酸合成酶
基因克隆入表达载体 pBES， 并在枯草芽孢杆菌中
进行了活性表达，本实验进一步对重组磷脂酰丝氨
酸合成酶进行分离纯化及酶学性质研究，为今后工
业化定向生产高纯度磷脂类物质奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌株
重组枯草芽孢杆菌 DB104（pBES-pss），本实验
室构建。
1.2 试剂
中空纤维膜，购自天津膜天膜工程技术有限公
司；卵磷脂、苯酚、4-氨基氨替比林及蛋白质分子量
标准品，购自上海生物工程有限公司；胆碱氧化酶
和过氧化物酶 ，购自 Sigma 公司 ；其余试剂均为国
产分析纯或化学纯。
1.3 酶的分离纯化
1.3.1 盐析 取 28 h 发酵液，4℃、8 000 r/min 离心
20 min，收集上清，分成 15 份，每份 50 ml，加硫酸铵
分 别 至 20% 、25% 、30% 、35% 、40% 、45% 、50% 、
55% 、60% 、65% 、70% 、75% 、80% 、85% 、90%饱和
度，4℃静置过夜。 次日，8 000 r/min 离心 20 min，蛋
白沉淀溶于适量 10 mM Tris-HCl 缓冲液中，分别测
定沉淀、上清酶活和沉淀蛋白含量，绘制硫酸铵盐
析曲线。
1.3.2 脱盐 将盐析沉淀溶解于 Tris-HCl 缓冲液
后，用截流分子量为 10~20 kD 的中空纤维膜超滤，
对样品进行脱盐浓缩 ， 除盐效果用 BaCl2 溶液检
测 ， 以滤出液滴入 BaCl2 溶液中无沉淀析出为终
点。
1.3.3 SP-Sepharose HP （2.4 cm×30 cm） 离子交换
层析 用 10 mM Tris-HCl 缓冲液（pH7.0）平衡层析
柱 ，将脱盐后的活性组分用同样的缓冲液溶解 ，
8 000 r/min 离心 20 min，上样（2 ml）后先用此缓冲
液洗脱未吸附的蛋白，再用含 0~1 mol/L NaCl 的该
缓冲液进行梯度洗脱，分步收集，测定 A280nm吸光值
和酶活力。
1.3.4 Sephadex G-75（1.6 cm×80 cm）凝胶层析 离
子交换层析得到的活性组分，先用 10 mM Tris-HCl
缓冲液（含 1.0%NaCl）溶解，8 000 r/min 离心 20 min，
上样 （2 ml）后用相同的缓冲液以 0.5 ml/min 的速
度洗脱，每管收集 2.0 ml，测定 A280nm 吸光值和酶活
力。
1.4 测定方法
1.4.1 蛋白含量测定 采用改良的 Bradford 蛋白
质定量检测方法完成 [10，11]。
1.4.2 酶活力测定 采用酶联比色法测定：磷脂酰
丝氨酸合成酶 （PSS）催化水解 L-α-卵磷脂生成胆
碱， 胆碱在胆碱氧化酶的作用下生成过氧化氢，过
氧化氢通过过氧化酶的作用与 4-氨基氨替比林和
苯酚生成醌亚胺显色物质， 在 500 nm 波长处下具
有吸光值。 反应体系参照文献[12]。 酶活定义为 pH
8.0、温度为 35℃时，磷脂酰丝氨酸合成酶 1 h 内催
化水解 L-α-卵磷脂释放 1.0 μmol 的胆碱所需要的
酶量。
1.4.3 分子量测定 采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电
泳 [13]。
2 结果
2.1 酶的分离纯化
2.1.1 硫酸铵盐析 由图 1 可知，当硫酸铵饱和度
小于 30%时，上清液中酶活几乎维持不变，沉淀中
酶活接近于零；大于 30%时 ，沉淀量随硫酸铵饱和
度的增加而增加，其酶活也随之增加；当达到 75%
时，其酶活接近最高值。 因此，采用 30%饱和度硫
酸铵沉淀去除杂蛋白，然后在上清液中补加硫酸铵
至 75%饱和度沉淀目的蛋白。
2.1.2 脱盐浓缩 中空纤维膜超滤过程中用 0.5
mol/L 的 BaCl2 溶液检测滤出液中是否含有 SO42-，
以滤出液滴入 BaCl2 溶液中无沉淀析出作为除盐的
图 1 磷脂酰丝氨酸合成酶盐析曲线







 









20 30 40 50 60 70 80 90
张业尼等：重组磷脂酰丝氨酸合成酶的分离纯化及酶学性质研究 107
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
终点，最终将样品浓缩 10 倍。
2.1.3 SP-Sepharose HP 离子交换层析 由图 2 可
知，先用 Tris-HCl 缓冲液（pH7.0）进行洗脱，至少有
2 种蛋白组分被洗脱下来，然后用含 0~1 mol/L NaCl
的该缓冲液进行梯度洗脱，在此期间只有 1 种蛋白
被洗脱下来，通过酶活检测，此洗脱峰为活性组分。
磷脂酰丝氨酸合成酶被 SP-Sepharose HP 离子交换
色谱介质吸附，从而与不带电荷的至少 2 种杂蛋白
彻底分离， 且目标蛋白活性组分峰与 280 nm 蛋白
质吸收峰完全重合，峰型比较对称，基线接近为 0，
说明这时目标蛋白已经达到了较高的纯度。
2.1.4 Sephadex G-75 凝胶层析 由图 3 可知 ，经
SP-Sepharose HP 离子交换后获得的活性组分经
Sephadex G-75 凝胶过滤后分成 4 个组分， 通过酶
活检测，第 2 洗脱峰为活性组分，其余洗脱峰没有
活性。活性组分洗脱峰峰形基本对称，基线接近零，
可与另外 3 种蛋白组分分开， 表明用其对 SP Sep-
harose HP 离子交换后样品进行最后的分离纯化 ，
效果很好。
2.2 酶的纯化回收
由表 1 可知，通过对重组磷脂酰丝氨酸合成酶
提纯工艺各纯化步骤指标的跟踪测定，纯化后酶活
力回收率为 60.38%，比活力可达 13.62 U/mg，是纯
化前的 39.59 倍。
2.3 分子量测定
由图 4 可知，纯化后重组磷脂酰丝氨酸合成酶
基本达到蛋白电泳纯，分子量约 53 kD。
2.4 酶学性质
2.4.1 酶作用的最适温度及温度稳定性 在 20~
70℃温度范围内，通过磷脂酰丝氨酸合成酶催化水
解卵磷脂来测定其最佳水解温度，以最适温度下测
定酶活设为 100%。 由图 5 可知，PSS 水解卵磷脂的
图 2 SP-Sepharose HP 离子交换层析洗脱曲线
0
10
20
30
40
50
60
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60




(U
/m
l)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10




(m
g/
m
l)

图 3 Sephadex 75 凝胶层析曲线

 
(mg)

(U)

(U/mg)

(%)


 4412 1518 0.344 100 1
 533.4 1396 2.617 91.96 7.61
SP-Sepharose HP 151.1 1187 7.856 78.19 22.84
Sephadex G-75 67.3 916.6 13.62 60.38 39.59


表 1 磷脂酰丝氨酸合成酶纯化表
MarkerkD
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
1 2 3 4
1.粗酶液 ;2.硫酸铵盐析液 ;3.SP-Sepharose HP
层析液 ;4.Sephadex G-75 层析液
图 4 蛋白纯化结果电泳图
图 5 最适反应温度
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2009年第 3期
最适温度为 35℃。 将酶在 25~ 65℃温度范围内保
温 2 h，研究其温度稳定性，以各自温度下初始酶活
定为 100%。由图 6 可知，PSS 在 35℃时保温 2 h，酶
活基本维持不变；其它温度下，随着时间的延长，酶
活逐渐丧失，25~ 45℃保温 60 min， 酶活力仍可维
持 80%以上，55℃保温 120 min 和 65℃保温 60 min
后即完全失去活性。
2.4.2 酶作用的最适 pH 和 pH 稳定性 在 pH 3.0~
12.0 范围内进行磷脂酰丝氨酸合成酶催化水解卵
磷脂的反应，考察该酶催化反应的最适 pH，以最适
pH 下测定酶活定为 100%。 结果如图 7，磷脂酰丝
氨酸合成酶水解卵磷脂的最适 pH 为 8.0。 取适量
纯化的酶液与 pH3.0~ 12.0 的缓冲体系相混合，4℃
放置 24 h，在 pH8.0 时测定酶活 ，以各自 pH 下初
始酶活定为 100%。 结果如图 8，该酶在 pH 为 6.5~
9.5 的范围内保持良好的稳定性，放置 24 h 酶活仍
可维持在 80%以上。
2.4.3 离子表面活性剂对 PSS 活性的影响 在
PSS 水解卵磷脂反应体系中，加入各种表面活性剂
与金属离子，测定它们对酶活力的影响。 结果如表
2，3 所示 ，SDS、Tween20、Tween80 对该酶有抑制作
用 ，Triton X-100 对该酶有增强作用 ；Mg2+、Zn2+、K+
对该酶有抑制作用，Ca2+、Mn2+和 EDTA 对该酶有增
强作用。
3 讨论
源自大肠杆菌的磷脂酰丝氨酸合成酶是一种
外膜蛋白，可以在胞内转化其他磷脂类化合物生成
大肠杆菌生存的必需物质——磷脂酰丝氨酸，但是
由于该酶在大肠杆菌中含量低（不到蛋白总含量的
0.1%），且表达量不高 ，严重影响其工业化生产及
应用。 因此，在前期工作中将磷脂酰丝氨酸合成酶
基因转入枯草芽孢杆菌进行了分泌表达，在提高其
表达量的基础上，采用硫酸铵盐析、离子交换层析、
凝胶层析等步骤对该酶进行分离纯化。纯化后的酶
图 6 温度稳定性
图 7 最适作用 pH
图 8 pH 稳定性

(0.45%)  (%)

 100
Triton X-100 
 120
Tween20 
 30
Tween80 
 50
SDS 
 12


表 2 表面活性剂对 PSS 水解活性的影响

 (mM) (%)
100
CaCl 2 115
MgSO 2 93
MnSO 2 116
ZnSO 2 87
KCl 2 79
EDTA 2 104


表 3 金属离子对 PSS 的水解活性的影响
张业尼等：重组磷脂酰丝氨酸合成酶的分离纯化及酶学性质研究 109
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蛋白基本达到电泳纯， 酶比活力可达 13.62 U/mg，
是纯化前的 39.59 倍 。 试验结果表明 ， 粗酶液经
30%~75%（NH4）2SO4 盐析可以去除大量蛋白质，这
在粗分离阶段很重要 。 经 ExPASy 数据库分析，该
酶成熟肽的等电点为 9.06， 因此选择 SP-Sepharose
HP 强阳离子交换色谱进行分离纯化， 并选用比磷
脂酰丝氨酸合成酶的 pI 低于一个单位以上、pH 为
7、 含有 0~1 mol/L NaCl 的 Tris-HCl 缓冲液进行梯
度洗脱，使目的蛋白与未被吸附的部分杂蛋白彻底
分离。 经 Sephadex G-75 凝胶过滤后基本达到电泳
纯， 表明用其对 SP-Sepharose HP 离子交换后样品
进行最后的分离纯化，效果很好。 对其水解卵磷脂
的酶学性质的研究结果表明，该酶最适作用温度为
35℃，对高温较为敏感，55℃保温 120 min 或 65℃保
温 60 min 后即完全失去活性； 该酶在弱碱环境下
发挥水解功能，其最适作用 pH 为 8.0，酸碱稳定范
围为 pH6.5~9.5，耐酸碱的性能较差。
磷脂酰丝氨酸是惟一能够调控细胞膜关键蛋
白功能状态的磷脂，有着独特的理化性质和营养价
值，如能够提高认知能力、改善阿尔茨默氏症（Alz-
heimerS Disease）、治疗抑郁症、缓解精神压力和身
体疲劳、对改善儿童多动症也有一定疗效。目前，主
要是利用有机溶剂直接从大豆或豆渣中进行萃取
生产磷脂酰丝氨酸，但由于大豆中含有多种结构相
近的磷脂， 使该法无法获得纯的磷脂酰丝氨酸，与
此同时消耗了大量有机溶剂，易造成环境破坏。 磷
脂酰丝氨酸合成酶具有高度专一性，在高浓度丝氨
酸、乙醇胺等亲核物质存在下，能够催化转酯生成
具有不同极性头部的稀有磷脂，有望改变目前在生
产磷脂酰丝氨酸上存在的问题。对于磷脂酰丝氨酸
合成酶来说，目前国内有关用其进行生物合成磷脂
酰丝氨酸的文献报道甚少，本研究组将对该酶定向
催化卵磷脂和丝氨酸合成磷脂酰丝氨酸的反应体
系及利用 HPLC 检测磷脂酰丝氨酸的转化率做进
一步的研究。
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