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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
甜瓜乙烯信号转导途径关键因子基因 CTR1 的
克隆及表达特性分析
姚远 高峰 郝金凤 哈斯阿古拉
(内蒙古大学生命科学学院 内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，呼和浩特 010021)
摘 要: 在拟南芥中，CTR1 在乙烯信号转导途径中发挥重要的负调控作用。目前的研究表明，在拟南芥中只存在一个
CTR1 基因。利用 RT-PCR技术从甜瓜果实中克隆得到 CTR1 基因 cDNA(Cm-CTR1)。Cm-CTR1 cDNA全长 2 613 bp，编码 870
个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析表明，所克隆的甜瓜 CTR1 基因与拟南芥 CTR1 基因相似度为 53． 69%。Cm-CTR1
的 C-末端具有明显的类似于哺乳动物和果蝇中的 Raf(retro-viral protein，V-raf)蛋白激酶家族的丝 /苏氨酸蛋白激酶(Serine /
threonine protein kinase)的特征。该结构具有所有已知蛋白激酶所共有的 11 个亚结构域，其中包括 ATP 结合位点和丝 /苏氨
酸蛋白激酶位点结构域，说明 CmCTR1 与其他植物 CTR1 相似。实时荧光定量 PCR 分析结果表明，从授粉后第 15 天到第 20
天，甜瓜果实 Cm-CTR1 基因表达量显著增加，第 20 天的表达量是第 15 天的 2． 5 倍，之后表达水平趋于稳定，第 40 天到第 45
天表达量有所下降。
关键词: 甜瓜 CTR1 基因表达 果实成熟 实时荧光定量 PCR
Cloning and Expression Analysis of a Key Gene CTR1 in
Ethylene Signal Transduction in Cucumis melo
Yao Yuan Gao Feng Hao Jinfeng Hasi Agula
(Inner Mongolia Key Laboratory of Herbage ＆ Endemic Crop Biotechnology，College of Life Sciences，
Inner Mongolia University，Hohhot 010021)
Abstract: In Arabidopsis thaliana，the CTR1 acts as a key negative regulator of ethylene signal transduction． In resent research，
only one gene with CTR1 function apparently exists in Arabidopsis thaliana． Here，RT-PCR was used to clone the cDNA of Cm-CTR1．
The full-length cDNA of Cm-CTR1 is 2 613 bp which codes for a polypeptide of 870 amino acids． Based on amino acid alignments and
phylogenetic analysis，the Cm-CTR1 cDNA was 53． 69% identical in nucleotide sequence to the At-CTR1 gene． The C-terminal end of
Cm-CTR1 is similar to the catalytic domain Ser /Thr protein kinase of Raf family of protein kinases，and this structure has all the eleven
conserved motifs of Ser /Thr protein kinase domains，including ATP-binding signature and Ser /Thr protein kinase active site consensus
sequence，which suggests that Cm-CTR1 could has the same function as CTR1 in ethylene signaling． Quantitative real-time PCR analy-
sis showed that the expression of Cm-CTR1 was increased obviously from the 15th day to the 20th day after pollination，and the transcript
level in the 20th day was 2． 5 times as much as that of 15th day． Then，the amount of CmCTR1 transcript was tended to be stable． The
transcript level of CmCTR1 decreased from the 40th day to the 45th day．
Key words: Cucumis melo CTR1 Gene expression Fruit ripening Quantitative real-time PCR
收稿日期:2011-04-15
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30960159) ，高等学校博士学科点专项科研基金项目(200801260002)
作者简介:姚远，男，硕士，研究方向:植物分子生物学及基因工程;E-mail:zhjyq129@ 163． com
通讯作者:哈斯阿古拉，男，博士，教授，E-mail:hasind@ sina． com!
乙烯作为植物 5 大类激素之一，在植物生长发
育过程中发挥重要的作用，如种子萌发，花、果实和
叶子的衰老和脱落，以及果实的成熟［1］。乙烯调节
的过程是通过乙烯合成、乙烯信号的感知和信号转
导来完成的。在研究乙烯信号转导过程中，应用了
“三重反应”法，利用这种方法，研究者从拟南芥中
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分离得到了使乙烯合成和信号转导发生改变的突变
体，包括乙烯不敏感型突变体和组成型乙烯反应突
变体两大类［2］。通过对突变体的分析，已经在拟南
芥中确定了一条乙烯信号感知到转录调控的信号转
导模型，即乙烯→ETR 家族→CTR1→EIN2→EIN3
(EILs)→ERF(EREBPs)→乙烯生理反应［3］。
CTR1 是乙烯受体下游的一个负调控组分，也
是第一个被克隆得到的乙烯信号转导途径基因［4］。
遗传和生化研究发现，无跨膜功能域或膜附着结构
的 CTR1 的氨基端可与内质网上的乙烯受体羧基端
相互作用，从而间接结合到内质网上形成 ETR1 /
CTR1 复合体进而负调控乙烯反应［5］。研究表明，
CTR1(由 ctr1 － 8 编码)氨基端错义突变破坏了与受
体 ETR1 的相互作用，但未影响到 CTR1 的激酶活
性，仍表现组成型乙烯反应表型。过量表达错义突
变的 CTR1 氨基端，由于不能与受体相互作用，则不
能产生组成型的乙烯反应表型，这表明 CTR1 与内
质网上的受体结合是实现 CTR1 负调控功能所必需
的［6］。另外，有几个现象表明乙烯的信号转导并非
完全依赖于 CTR1，ctr1 功能缺失突变体对乙烯反应
的能力很微弱［5］，另一个是乙烯受体的双重突变体
有着比 ctr1 功能缺失突变体更加明显的表型［3］。
但是总体来说，植物体内的大部分乙烯反应是通过
CTR1 转导的［7］。
目前许多文献报道了 CTR1 基因的克隆与功能
研究。研究者从猕猴桃果实中克隆得到一个 CTR1
基因，试验证明该基因在果实呼吸跃变时期表达量
增高［8］。月季中，伴随着花的衰老，CTR1 表达量增
高［9］;西葫芦中，在花的发育期间，CTR1 在雄花中
表达明显增强，而在雌花中却没有表达［10］;李子果
实成熟期间，CTR1 表达量增加［11］。
本研究从甜瓜(Cucumis melo)果实中克隆到一
个 CTR1 基因的全长 cDNA 序列(Cm-CTR1) ，利用
实时荧光定量 PCR 技术对其在授粉后不同发育阶
段的甜瓜果实中的表达进行了分析。
1 材料与方法
1． 1 材料
1. 1. 1 菌株 供试植物材料为甜瓜品种河套蜜瓜
高代自交系，由本实验室保存。在大田种植，取授粉
后第 15 天、第 20 天、第 25 天、第 30 天、第 35 天、第
40 天及第 45 天的中果肉样品，于液氮中速冻，
－ 80℃保存备用。
1. 1. 2 主要试剂 DNA Marker，rTaq plus DNA 聚
合酶，dNTPs，UniQ-10 柱式胶回收试剂盒均购自上
海生物工程技术有限公司，反转录试剂盒购自 In-
vitrogen公司，SYBR Green Supermix购自 Bio-Rad公
司。大肠杆菌菌株 JM109，本实验室保存。其他试
剂均为国产分析纯。
1． 2 方法
1． 2． 1 总 RNA提取 采用异硫氰酸胍法结合 KAc
沉淀多糖法［12］提取甜瓜果实总 RNA。采用 1. 0%
的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA。
1． 2． 2 cDNA合成 按照 Invitrogen 公司的 M-MLV
Reverse Transcriptase 试剂盒操作说明，以 5 μL(1
μg /μL)总 RNA为模板反转录合成 cDNA，反转录引
物采用 Oligo(dT)20。
1． 2． 3 PCR 扩增 利用 Fgenesh2． 6 软件(http:/ /
linux1． softberry． com/)对专利数据库中的甜瓜CTR1基
因组 DNA序列(登录号:AR494803)进行 mRNA预测，
根据预测得到的 mRNA序列设计特异性引物，由上海
生物工程技术有限公司合成。上游引物 CTR1-P1:5-
ATGGAAATGCCTGGACGGAGGTC-3;下游引物 CTR1-
P2:5-TGTCACATAACCGAGAGGGTGTCTG-3。PCR 反
应体系为 25 μL 体系:10 × PCR 缓冲液 2. 5 μL，dNTP
(2. 5 mmol /L)2. 0 μL，引物(5 μmol /L)各 2. 5 μL，rTaq
plus DNA聚合酶(250 U/μL)0. 2 μL，模板 cDNA 1 μL，
去离子水 14. 3 μL。反应程序:94℃预变性 5 min;94℃
变性 30 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 30 min，40个循环;
72℃延伸补平 10 min。
PCR产物经 PCR 产物纯化试剂盒纯化后与
pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌 JM109，在 LB/Amp/
IPTG/X-gal平板上筛选阳性克隆，选取菌落 PCR为阳
性的重组质粒，用 Hind III酶切鉴定。
1． 2． 4 目的片段测序 随机挑选重组质粒 3 个独
立克隆，送上海生物工程技术有限公司进行测序。
测定的序列用 NCBI(http:/ / www． ncbi． nlm． nih．
gov /)在线分析软件 BLAST进行同源性比对和保守
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2011 年第 11 期 姚远等:甜瓜乙烯信号转导途径关键因子基因 CTR1 的克隆及表达特性分析
区分析。
1． 2． 5 生物信息学分析 分子进化树的构建使用
软件 MEGA4. 1 软件完成，氨基酸序列使用 DNA-
MAN6. 0 软件分析，用 Protparam 软件(http:/ / au．
expasy． org / tool /prot-params)分析 Cm-CTR1 蛋白的
相对分子质量等理化性质。
1． 2． 6 实时荧光定量 PCR分析基因表达特性 根
据 Cm-CTR1 的 cDNA 序列设计定量 PCR 引物:上
游引物 5-CACCAACAGAAGCAACCAAATG-3;下游
引物 5-GAATCCTCAACCACGCCAGT-3，产物大小
为 168 bp。以甜瓜甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)
基因片段作为内参，上游引物:5-ATCATTCCTAG-
CAGCACTGG-3;下游引物:5-TTGGCATCAAATAT-
GCTTGACCTG-3。反应体系为:2 × SYBR Green
Premix ExTaq 12. 5 μL，上下游引物(5 μmol /L)各 1
μL，模板 cDNA 1 μL，去离子水 9. 5 μL。反应程序:
95℃ 10 s;95℃ 10 s，60℃ 20 s，共 40 个循环;最后
从 65℃开始，每 10 s升高 1℃直至 95℃结束。基因
表达相关变化采用 2 －△△Ct公式计算。
1． 2． 7 甜瓜果实内源乙烯含量的测定 分别采集
授粉后第 15 天、第 20 天、第 25 天、第 30 天、第 35
天、第 40 天和第 45 天的果实各 3 颗，立即采集果腔
中气体样品，水封法保存于青霉素瓶，用气相色谱仪
测定乙烯含量。
2 结果
2． 1 总 RNA的分析
用紫外分光光度法测定 RNA 的 OD 值，结果表
明 OD260 /OD280为 1. 941。电泳结果(图 1)显示，28S
rRNA的亮度约为 18S rRNA 的 2 倍，说明提取的总
RNA纯度高而且完整性好。
图 1 甜瓜果实总 RNA的电泳结果
2． 2 Cm-CTR1 基因的克隆及序列分析
PCR产物电泳检测，得到长度为 2. 6 kb 左右的
条带(图 2) ，与预期相符。酶切鉴定显示已经得到
预期正确的克隆。
图 2 PCR扩增结果
序列分析结果表明，所克隆的 Cm-CTR1 cDNA
核苷酸序列长度为 2 613 bp，具有完整开放式阅读
框，编码 870 个氨基酸。用 DNAMAN软件分析氨基
酸序列相似度发现，Cm-CTR1 基因编码的氨基酸序
列与月季、桃子、杨毛果、拟南芥和番茄的相似度分
别 为 66. 74%、65. 72%、62. 90%、58. 04% 和
54. 06%。对拟南芥的 At-CTR1 和番茄的 Le-CTR1
等 CTR1 蛋白分析可知，在 CTR1 蛋白的 C 端含有
11 个丝 /苏氨酸激酶亚结构域，而本研究克隆得到
的甜瓜 Cm-CTR1 的氨基端序列中含有全部 11 个
丝 /苏氨酸激酶亚结构域，其中包括 ATP 结合位点
(位于 562 － 569)和丝 /苏氨酸蛋白激酶位点结构域
(位于 716 － 723)。通过用 NCBI的 BLASTP软件对
Cm-CTR1 氨基酸序列进行保守区分析，可得到 6 个
完整的保守结构域，分别是 Pkinase-Tyr 区域、S-TKc
区域、TyrKc区域、Pkinase 区域、STYKc 区域和 SPS1
区域。此序列已经在 GenBank 数据库中提交，登录
号为 HQ848663。
2． 3 生物信息学分析
利用 MEGA4. 1 软件将甜瓜 Cm-CTR1 蛋白与
拟南芥、番茄等多个物种的 CTR蛋白构建系统进化
树，结果(图 3)表明，Cm-CTR1 蛋白与拟南芥、番茄
和月季等 CTR 蛋白在进化关系上具有较近的亲缘
关系。
利用 Protparam软件分析 Cm-CTR1 蛋白的理化
性质，推测相对分子质量为 96. 0946 kD，等电点为
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5. 71，理论推导半衰期大于 20 h，不稳定参数为
45. 71，属于不稳定蛋白。
2． 4 甜瓜果实内源乙烯含量的变化
甜瓜果实内源乙烯含量从授粉后第 20 天到
第 30 天，呈上升趋势，到第 35 天显著降低，第 40
天时又急剧升高，之后又有所下降(图 4)。
2． 5 甜瓜 Cm-CTR1 基因的表达分析
从授粉后第 15 天到第 20 天，甜瓜果实 Cm-
CTR1 基因表达量显著增加，第 20 天的表达量是
第 15 天的 2. 5 倍，之后表达水平趋于稳定，第 40
天到第 45 天表达量有所下降(图 5)。
图 3 甜瓜 Cm-CTR1 蛋白与其他植物 CTR1 蛋白的系统发生分析
图 4 甜瓜果实发育成熟过程中内源乙烯含量变化 图 5 甜瓜果实发育成熟过程中 Cm-CTR1 基因的表达
3 讨论
本研究从甜瓜中克隆得到了 CTR1 全长的 cD-
NA，通过对 CmCTR1 及其他植物中的 CTR1 进行氨
基酸序列比对和同源性分析发现，Cm-CTR1 具有
CTR1 同源蛋白的典型特征和关键结构域，推测 Cm-
CTR1 编码蛋白具有 CTR1 功能。Cm-CTR1 基因的
克隆为研究甜瓜表达特性及其特异性功能奠定了基
础，并有助于进一步研究甜瓜乙烯信号转导的分子
机制。
实时荧光定量 PCR分析显示，在果实发育的不
同阶段，Cm-CTR1 基因表达水平不同，推测 CTR1 在
果实发育的不同阶段所发挥的作用有所不同。
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