全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
毛竹笋全长 cDNA文库构建
刘志伟 张智俊 韩国民 何沙娥 杨丽
(浙江省现代森林培育技术重点实验室,临安 311300 )
摘 要: Gateway技术构建 cDNA文库,利用了 噬菌体的位点特异性重组,避免使用限制性内酶切割 cDNA,能够解决常规方
法构建 cDNA文库的技术缺陷。应用 Gatew ay技术构建毛竹笋 cDNA文库,经检测 cDNA入门文库的滴度达到 17 106 cfu/mL,文库
总容量为 85 106 c fu,平均插入片段在 10 kb以上。毛竹笋文库的构建为进一步克隆毛竹纤维化分子机理打下了基础。
关键词: Gateway技术 毛竹笋 纤维素合成酶基因 cDNA入门文库
Construction of a cDNA Library ofPhyllostachs pubescens
Using Gateway Technology
L iu Zhiwei Zhang Zh ijun H an Guom in H e Shae Yang L i
(Zhejiang ProvincialK ey Lab forM odern Silvicultural T echndogy, Linan 311300)
Abstrac:t A cDNA libra ry was constructed based on theG atew ay system tha t is am ethed to construct a h igh quality cDNA library
w ithout the use o f restriction enzym e for cloning. Th is is the first report that the Gateway sy stem is used to construct a cDNA library fo r
Phy llos tachs pubescens. The en try cDNA library was constructed in th is repo rt has a high titer of 17 106 c fu /mLand conta in a tota l
clones o f 8 5 106 c fu /mL, w ith an ave rage inserts size of about 1 0 kb. The construction o f the cDNA library o f bamboo shoo ts(Phy llos t
achs pubescens) w hich m ade the further step to fibrosis gene for c lon ing la id the g roundw ork fo r the m olecularm echanism of fibrosis.
Key words: Ga tew ay m ethod M oso bam boo shoot Cesa gene cDNA en try library
收稿日期: 20091119
基金项目:国家 ! 863∀项目 ( 2007AA021403) ,浙江省自然科学基金资助项目 ( Y307469 ),浙江省现代森林培育技术重点实验室开放基金
作者简介:刘志伟,男,硕士,研究方向:植物生物技术
通讯作者:张智俊,男,博士,副教授; Em ai:l csfuzz@j yah oo. com. cn
Gateway技术是在 噬菌体整合酶 2切除酶系统
基础上创建一种通过体外特异位点重组反应 (即
2att重组系统 ) [ 1- 3] ,并在该重组系统的基础上进行
一系列修饰、改造,提高了这一重组系统的效率与特
异性 [ 4]。应用 Gatew ay技术构建 cDNA文库具有下
列优点:在 cDNA克隆中不必使用限制性内切酶消化
再与载体进行连接反应, cDNA嵌合体克隆出现的机
率明显低于通过切割连接克隆方法构建的 cDNA文
库;重组克隆法的转化效率大约是切割连接克隆方法
的 10余倍,阳性克隆率可达到 100%, 片段偏向性只
有切割连接克隆方法的 1/5,克隆中插入的 cDNA片
段平均大小高于切割连接克隆方法 [ 5, 6] ; 构建的 cD
NA文库具有更大灵活性, 将 cDNA片段重组到入门
载体中,构建出入门文库,入门文库构建简单、克隆效
率高、能够较好地保存和扩繁 cDNA片段。
竹笋以独特的营养价值和食用口感获得了大家
的喜爱,而主要笋用竹均会在采后会迅速纤维化,严
重影响了其食用价值和经济价值。而纤维素合成酶
基因 [ 7] ( cesa)基因在竹笋纤维化进程中具有重要作
用, 本研究通过构建毛竹笋全长 cDNA文库, 以期筛
选出调控竹笋纤维化进程的 cesa家族基因。
本试验在综合了各种因素之后, 选取 Inv itrogen
公司生产的 C loneM iner cDNA Library Construction
K it构建毛竹笋全长 cDNA文库。该试剂盒采用了
Gatew ay技术,即在 噬菌体整合酶 -切除酶系统
基础上创建的一种通过体外位点特异重组反应的方
法。 2001年 Ohara最早从事将该技术应用于 cDNA
文库的研究, 2003年美国 Inv itrogen公司在此技术
的基础上开发了专门构建高质量于 cDNA文库的试
剂盒。该试剂盒最大的优点是 DNA克隆中不必使
2010年第 2期 刘志伟等 :毛竹笋全长 cDNA文库构建
用限制性内切酶消化再与载体进行连接反应, 有效
地保护了 cDNA分子的完整性, 减少了 cDNA嵌合
体克隆的机率,从而大大提高了全长 cDNA的质量。
1 材料
11 试验材料及处理
植物材料为浙江临安人工毛竹林未出土毛竹笋。
取材时间为 2008年 3月下旬。将新鲜的毛竹笋, 将
笋壳快速剥去后,取笋幼嫩部分装入 Eppendorf管中,
迅速放入液氮速冻之后存放在- 70# ,备用。
12 仪器设备和试剂
Trizo l Reagent和 C loneM iner cDNA L ibrary Con
struction K it(主要包括 BP C lonase Enzyme M ix, E lec
troMAX DH10B T Phage Resistant C ells, cDNA Size
Fract ionation Co lumns, Pdonrtm 222V ector, Super
Script
TM ∃Reverse Transcriptase, E. coli DNA L igase, E.
coli DNA Po lymeraseI, E. coli RNAseH, T4 DNA Poly
merase, T4DNA Ligase, attB1 Adapter, U ltraPure G lyco
gen)购自 Inv itrogen公司、PolyATtract mRNA Iso lation
Systems K it购自 Promega公司。PCR反应试剂 10
PCR Buffer、MgC l2、dNTPs M ixture (各 10 mM、Taq
DNA po lymerase)、酸性水饱和酚 ( pH < 45) ,均购自
上海生工生物工程技术有限公司。其它生化试剂或
常规试剂均为超纯或分析纯。
2 方法
21 总 RNA的提取及质量鉴定
总 RNA用 Trizo l试剂提取 (体系同比例放大用
于大量提取 )。具体操作步骤按照 TRIzol Reagent
说明书进行,最后加入适量的 DEPC H 2O溶解。取
5 L RNA用于凝胶电泳检测和紫外分光光度计检
测。取 1 mg总 RNA用 PolyAT tract mRNA Isolat ion
Systems K it参照试剂盒说明书进行 mRNA纯化,检
测 mRNA质量。
22 cDNA的合成和片层分级
毛竹笋 cDNA文库的构建参照 C loneM iner cDNA
L ibrary Construct ion K it试剂盒说明书进行,具体步骤
稍作改动。取纯化的 mRNA 5 g,加入 Superscript∃
等试剂反转录合成一链,加入 E. coli DNA Ligase、E.
coli DNA Po lymerase%、E. coli RNAse I等试剂, 合成第
二链 cDNA,连接 attB1接头。 cDNA片段分级: 采用
合成的双链 cDNA分子经过柱层析片段分级。试剂
盒提供的分离柱每个含有 1 mL Sephacry S500HR树
脂,按照说明书操作,检测 cDNA纯度与浓度。
23 BP连接、转化和入门文库的构建
取分级后 cDNA合适大小片段 150 ng左右用
BP C lonase
TM
EnzymeM ix与 pDONRTM 222载体进行
BP连接反应。采用电击转化法 (电压 2 kV, 电阻
200 ,电容 25 F)转入大肠杆菌 DH10B感受态细
胞。 37# 、200 r/m in培养 1 h, 加入冷冻培养基 (含
40%甘油的 SOC培养基 ) , 液氮速冻, - 70# 下保
存, 即为构建的 cDNA入门文库。
24 入门文库滴度和质量检测
从文库中取 100 L菌液用 SOC培养基稀释到
10倍、100倍和 1 000倍。从中各取 100 L涂含
Kanamycin的 LB平板 (直径 9 cm ) , 每种稀释倍数
涂板两个。培养 12- 16 h, 计算其克隆数。根据公
式: 文库的滴度 =平板上克隆数 稀释倍数 /涂板体
积, 计算出文库滴度,从而得出文库的总容量。
从 cDNA文库中随机挑取 28个阳性克隆,根据
试剂盒提供的引物序列设计引物: M 13 5&端引物序
列: 5>A AAA CGA CGG CCA G3&, M 13 3&端引物
序列: 5&CAG GAA ACA GCT ATGAC3&扩增插入片
段, 用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物, 确定文库阳
性克隆率和平均插入片段大小。
3 结果与分析
31 总 RNA及 mRNA质量
RNA质量的高低直接影响到文库的质量。总
RNA经紫外 分光光度 计检测, OD 260 /OD280 =
1948, 浓度为 5668 ng /L,总共得到 200 L。同
时经电泳检测, 观察到 18S和 28S rRNA两条带完
整, 28S rRNA的亮度和宽度大致是 18S rRNA的两
倍 (图 1)。由此说明, 总 RNA样品完整且纯度较
高。1 mg总 RNA样品经 Po lyATtract mRNA Iso la
tion System s K it分离后,得到 250 L mRNA。经紫
外分光光度计检测, OD260 /OD280 = 201, OD260 /
OD230 = 375,浓度为 168 ng /L,共得到 4 200 ng
mRNA,这些指标表明分离获得的 mRNA能够完全
满足载体文库构建的要求。
32 mRNA反转录成双链 cDNA
反转录产物经沉淀后溶解于 18 L 1 TE中。
经紫外分光光度计检测, OD260 /OD280 = 189, OD260 /
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
OD 230 = 224, 浓度为 369 ng /L。双链 cDNA片段
分级, 共收集 22管片段分级样品。采用紫外分光光
度计检测各管 cDNA样品浓度, 结果发现从第 5管
到第 20管样品能够检测到 cDNA片段。为了得到
合适大小的 cDNA片段,并尽可能包含更多的片段,
合并第 4管到第 10管的样品,约 200 ng。
图 1 总 RNA凝胶电泳图
33 文库构建及文库质量评价
经检验,毛竹笋 cDNA文库的滴度为 17 106
CFU /mL, 文库总容量为 85 106 CFU。随机挑取
28个克隆进行菌落 PCR, PCR产物经凝胶电泳检
测, 插入片段大部分在 1 kb以上, 阳性克隆率为
96% (图 2)。按照 C loneM iner cDNA L ibrary Con
struction K it的要求, 一个高质量的文库, 其滴度应
大于 1 106CFU /mL,文库总容量大于 5 106 CFU,
阳性克隆率大于 95%, 平均插入片段大于或等于
15 kb。由此可见,本研究构建的毛竹笋 cDNA文
库是一个质量较高的文库。
M. marker; 1- 28.单克隆
图 2 随机挑取 28个克隆进行 PCR检测
4 讨论
cDNA文库构建, 是以细胞中存在的 mRNA为
起始材料的。mRNA对细胞功能作出的贡献,受其
降解速率的影响。而 mRNA降解的快慢又受其相
应的核酸酶活力的影响,而且与 mRNA特异的因子
也有关系。一个典型细胞含总 RNA约 10 - 5 g,
mRNA占总 RNA的 1% - 5%左右, 且分子大小和
核苷酸序列各不相同, 相差悬殊 [ 8]。每种特异 mR
NA的含量则更少。mRNA降解的主要原因是 RNA
酶作用,该酶是一种极难灭活的酶, 而且到处存在,
特别是研究人员的手往往是 RNA酶污染的主要来
源。因此,试验操作过程中, 选择、确定含特异 mR
NA最丰富的细胞或组织、采集新鲜的样品并及时
保存和减少 RNA的污染等, 对保证 RNA数量及质
量具有重要的影响。
构建文库过程中,片段与载体连接前,分离去除
短的片段非常重要, 如果不能有效去除短片段
( < 500 bp) ,这些短片段将与载体优先连接,从而降
低文库平均插入片段长度, 严重影响文库质量。但
过度去除短片段,则又会造成文库的初始滴度下降,
从而就会丢失一些基因信息。因此, 要构建一个高
质量的文库,把握好上述几个因素也显得非常重要。
在试验中,采取了分离柱分级 cDNA片段, 这一步骤
非常关键。试剂盒中提供平板法检测分级的 cDNA
片段大小,在实际操作中采取的是紫外风光光度计
法。紫外分光光度计检测并不能直接检测片段的大
小,但可以通过吸收峰值判断目的片段的存在。这
种方法比较简单,但对于没有经验者并不推荐。
一个高质量 cDNA文库的关键就是要保证文库
的完整性与覆盖度。本试验所构建的毛竹笋 cDNA
文库,插入片段绝大多数在 1 kb以上, 文库总容量
达到 85 106 CFU, 阳性克隆率达到 96%, 由此可
见, 本研究所构建的 cDNA是高质量的 cDNA文库。
但是这种方法也有不足之处, 封闭的系统仅适用于
Inv itrogen提供的表达载体,应用成本高。而且在启
动子和目的基因间必需插入一段特定的噬菌体重组
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2010年第 2期 刘志伟等 :毛竹笋全长 cDNA文库构建
酶识别序列,对构建的表达载体文库中的基因表达
可能会产生不利影响。另外,文库中的插入片段并
非都是全长 cDNA。
毛竹笋高质量全长 cDNA文库的成功构建,为
研究竹类植物纤维素合成相关基因及纤维素合成机
理奠定了坚实的基础, 现已成功筛选出了几条 cesa
家族基因,为进一步研究提供了保障。
参 考 文 献
[ 1] H art ley JL, em ple GF, B rasch MA, et a.l DNA clon ing us ing in vitro
s ite sp ecific recom b ination. Genom e Res, 2000, 10: 178817951.
[ 2 ] W alhou tA J, Sordella R, Lu X, et a.l Protein interaction m app ing in
C. elegans using p roteins in volved in vu lva l d evelopm ent. Science,
2000, 287: 1161221.
[ 3] 梅文倩,宋文强,潘怡,等.利用 Getaw ay克隆技术大规模克隆拟
南芥转录因子.分子植物育种, 2004, 2 ( 3) : 358364.
[ 4] Bu shm anW, Thom pson J, VargasL, et a.l Con trol of d irect ional ity in
lam bda site specif ic recomb in at ion. S cien ce, 1985, 230: 9069111.
[ 5] Ohara O, Tem ple G. D irect iona l cDNA l ibrary con struction assisted
by the in vi tro recomb in at ion react ion. Nu cleic Acid s Research,
2001, 29: 18.
[ 6] Oh ara O, N agase T, M itsu iG, et a.l C haracterizat ion of s ize fractiona
ted cDNA libraries generated by the in vi tro recom b inatiorr assisted
m ethOD. DNA R eseach, 2002, 9: 47 571.
[ 7] 李春秀,齐力旺,王建华,等.植物纤维素合成酶基因和纤维素的
生物合成.生物技术通报, 2005 ( 4) : 510.
[ 8] 姚知行.分子生物学技术讲座 (三 ) -真核细胞 mRNA的提取、
纯化、分析及 cDNA 文库的构建. 生物学通报, 1997, 3 ( 8 ):
2324.
(上接第 97页 )
[ 6 ]V enem a K, B elver A, M arinM an zano MC, et a.l A novel int racellu lar
K+ /H + ant iporter related to Na+ /H + ant iporters is importan t for K+
ion h om eostasis in p lants. Th e Jou rn al of B iological Chem is try, 2003,
278( 25 ) : 22453 22459.
[ 7] Rodr guezRosalesM P, Jiang X, G lvez FJ, et a.l Overexpression of
th e tom ato K+ /H + an t iporter LeNHX2 confers salt toleran ce by im
p roving potass ium com partm entalizat ion. New Phyto,l 2008, 179 ( 2 ):
366377.
[ 8] Q iaoWH, Zhao XY, L iW, et a.l Overexp ress ion of AeNHX1, a root
specific vacuolar Na+ /H + an t iporter from Ag ropyron elonga tum, con
fers salt toleran ce to Arabid opsis and Fe stuca p lants. P lan t C ell Rep,
2007, 26: 16631672.
[ 9] Rodrgu ezRosalesMP, Glvez FJ, H uertas R, et a.l P lan t NHX cat
ion /proton an tiporters. P lan t S ign aling & B ehavior, 2009, 4 ( 4 ):
265276.
[ 10 ] Yu JN, Hu ang J, W ang ZN, et a.l An Na+ /H + an tiporter gene from
w heat p lays an im portant role in stress to lerance. J B iosc,i 2007, 32
( 6 ) : 11531161,
[ 11 ] Ch auhan S, ForsthoefelN, Ran Y, et a.l Na+ /m yoinositol sym port
ers andNa+ /H+ ant iport inM esem bryan themum cry stall inum. Plant
J, 2000, 24( 4) : 511522.
101