全 文 ：利用 TA克隆的方法简便构建入门克隆*
殷宪伦1,2, 王春涛1, 孔祥翔1, 杨永平1, 胡向阳1**
(1 中国科学院昆明植物研究所, 云南 昆明摇 650201; 2 中国科学院研究生院, 北京摇 100049)
摘要: Gateway技术是一种通用型克隆方法, 其基于 姿噬菌体位点特异性重组, 将目的 DNA快速克隆到各
种与 Gateway技术兼容的目的载体上, 不需要进行酶切和连接反应。 但存在获得入门克隆过程中相关反应
酶制剂价格昂贵, 且药品订购时间较长等问题。 通过对入门载体 pDONR207 的改造, 使之产生 3爷 端具有
单个 T鄄末端的线性化的入门载体, 采用 TA克隆的方法替代 BP反应, 从而简便、 经济和快速地获得入门
克隆。 利用改造后的 Gateway技术构建拟南芥 SOS2 基因的原核表达载体和真核表达载体, 通过原核表达
和原生质体瞬时表达证明通过此方法构建的表达载体在原核细胞和真核细胞中都得到了很好的表达。
关键词: Gateway技术; TA克隆; 入门克隆; 原核表达; 拟南芥原生质体瞬时表达
中图分类号: Q 943, Q 75摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2012)04-397-06
Simplification of Entry Vector by TA Approach
YIN Xian鄄Lun1,2, WANG Chun鄄Tao1, KONG Xiang鄄Xiang1,
YANG Yong鄄Ping1, HU Xiang鄄Yang1**
( 1 Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204, China;
2 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract: Gateway technology is a universal cloning approach that enables rapid cloning of DNA fragments into mul鄄
tiple Gateway鄄compatible destination vectors using 姿 phage site鄄specific recombination, eliminating the requirement
to work with restriction enzymes and ligase. But a problem using this system for making entry clone is the expensive鄄
ness and long time to buy the enzyme. To solve this problem, we created the TA cloning entry vector that contained
a T鄄tail in each 3爷鄄end through modification of pDONR207. The TA cloning approach can construct entry clones
simply, economically and rapidly. Using Gateway T vectors prepared by this improved method, prokaryotic expres鄄
sion vector and eukaryotic expression vector for SOS2 gene were constructed. Through the methods of prokaryotic ex鄄
pression and transient gene expression in Arabidopsis protoplasts, it proved that the SOS2 gene expressed well in both
prokaryotic cells and eukaryotic cells.
Key words: Gateway technology; TA cloning; Entry clone; Prokaryotic expression; Transient gene expression in
Arabidopsis protoplasts
摇 Gateway克隆技术是美国 Invitrogen公司开发
的一种位点特异重组的克隆技术, 该技术主要基
于 姿噬菌体位点特异性重组系统, 利用位点特
异重组构建人门载体, 实现了不需要传统酶切连
接过程的基因快速克隆和载体间平行转移, 同时
还保持了正确的 ORF和方向 (Hartley 等, 2000;
Bushman等, 1985; Landy, 1989)。 该技术主要
由 BP和 LR 两个反应构成。 与传统的克隆方法
相比, Gateway技术不需要考虑目的 DNA是否有
合适的酶切位点, 不需要进行酶切和连接反应,
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2012, 34 (4): 397 ~ 402
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2012. 11185
*
**
基金项目: The Major Science and Technology Program (110201101003鄄TS鄄03, 2011YN02 和 2011YN03)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: Huxiangyang@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2011-12-14, 2012-04-01 接受发表
作者简介: 殷宪伦 (1984-) 男, 在读硕士研究生, 主要从事植物逆境和功能基因研究。 E鄄mail: yinxianlun@ mail. kib. ac. cn
而是借助位点特异性重组, 一旦获得入门克隆后
就能将目的 DNA 以正确的方向和读码框克隆到各
种与 Gateway 技术兼容的目的载体上, 大大简化
了基因克隆的步骤, 具有阳性克隆率高、 快速、
灵活等优点 (梅文倩等, 2004)。 Invitrogen公司还
开发了系列目的载体, 包括适用于原核、 酵母、
昆虫和哺乳动物等不同宿主的表达载体, 大大提
高了 Gateway技术的适用性和兼容性 (Hartley等,
2000; Skinner鄄Adams等, 2003)。 由于 Gateway 技
术具有良好的可扩展性, 基于 Gateway 技术的载
体改造已经成功应用于许多领域, 如 Zhu 等
(2009) 曾改造 Gateway 技术中的载体, 以用作
真菌中的高通量表达; Busso 等 (2005) 曾构建
了基于 Gateway技术的目标载体, 以在大肠杆菌
中用作高通量克隆和表达筛选。
为了将目的基因最终转化到其他表达系统
中, 首先需将目的基因构建到入门载体上获得入
门克隆。 但是由于获得入门克隆过程中相关反应
酶制剂价格昂贵, 且药品订购时间较长, 并未被
国内学者广泛接受。 如何能简便、 经济和快速地
获得入门克隆是应用这些载体系统的一个瓶颈问
题, 我们利用 TA克隆的方法替代了原先较昂贵
的 BP反应。 首先通过 BP反应将含有 XcmI 酶切
位点的 GFP片段克隆到入门载体 pDONR207 上,
而后利用限制性内切酶 XcmI酶切该克隆载体, 随
之会产生一个 3忆端具有单个 T鄄末端的线性化的载
体, 即获得了带 T鄄末端的线性入门载体。 为了降
低由于酶切不完全导致的载体自连, 采用 TA 连
接的方法, 将 ccdB基因替换掉 GFP片段, 载体命
名为 pEGW, pEGW 经 XcmI 酶切后 (pEGW鄄T)
可与外源片段直接进行 TA 连接。 pEGW 即新的
入门载体, 可运用到实验室今后需要 Gateway 技
术的实验中。 除载体改造中用到一次 BP 反应,
改造后的载体在以后的实验中不再需要 BP 反
应, 而只需通过简单的 TA 连接来构建入门克
隆。 为验证改造后的 TA 入门克隆的连接效率,
我们选取拟南芥抗盐相关基因 SOS2 作为外源
DNA片段, 采用改造后 TA克隆的方法构建入门
克隆, 并利用 Gateway技术构建原核表达载体和
真核表达载体, 通过原核表达和拟南芥原生质体
瞬时表达技术证明通过此方法构建的表达载体在
原核细胞和真核细胞中都得到了很好的表达。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
哥伦比亚 (Columbia, Col) 野生型拟南芥 (Arabi鄄
dopsis thaliana) 植株, 由美国拟南芥种质资源库提供,
后由本实验室繁衍, 贮存。 大肠杆菌 (Escherichia coli)
菌株 DH5琢、 pEGAD载体质粒、 col拟南芥 cDNA 保存于
本实验室; Gateway LR、 BP reaction 试剂盒、 pENTR1A
载体、 原核表达载体 pDEST15 和真核表达载体 pEarleyG鄄
ate 104 购于 Invitrogen 公司; 限制性内切酶、 高保真
Prime Star DNA聚合酶、 T4DNA 连接酶、 蛋白 Marker 为
Takara (大连) 公司产品; 质粒小量提取及 DNA 回收、
纯化试剂盒为天根 (北京) 公司产品; 氨苄青霉素
(Amp) 等试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公
司; 引物合成和测序由北京六合华大基因科技股份有限
公司完成。
1. 2摇 pDONR207鄄GFP的构建
以含 GFP基因的 pEGAD质粒为模板, 用 Prime Star
DNA聚合酶进行 PCR扩增。 引物序列如下: attB1鄄XcmI鄄
GFP鄄F: GGGG ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC
CCAATACTTGTATGG ATGGTGAGCAAGGGCGAG; attB2鄄
XcmI鄄GFP鄄R: GGGG ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC
CCAATACTTGTATGG CGCAGCTCCGGACTTGTAC, 其中
GFP片段两端内侧带有 XcmI 酶切位点 (下划线部分),
外侧带有 attB位点 (框中部分)。 经琼脂糖凝胶电泳后
切胶回收 PCR扩增产物。
将 GFP片段通过 BP反应重组到入门载体 pDONR207
上。 在 0. 5 mL离心管中加入以下反应体系 (总体积 5. 0
滋L): attB鄄PCR product (50 ~ 100 ng) 2. 7 滋L, pDONR207
(30 ~ 50 ng) 1. 0 滋L, 5xBP reaction buffer 1. 0 滋L, BP en鄄
zyme mix 0. 3 滋L。 短暂离心后将混合体系放 25 益水浴 4
h以上, 取 2. 5 滋L反应体系用热激法转化 DH5琢 感受态
细胞, 经菌液 PCR扩增和测序检测, 鉴定正确的阳性克
隆即为 p207鄄GFP。
1. 3摇 T鄄末端入门载体 pEGW的构建
将 p207鄄GFP 质粒用 XcmI 完全酶切, 将 p207鄄GFP
中的 GFP片段切除。 XcmI 酶切后在切口两端会产生 T鄄
末端, 产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收大片段, 即获
得带 T鄄末端的线性入门载体, 并可直接用于 TA 连接。
为了降低由于酶切不完全导致的载体自连, 我们采用 TA
连接的方法, 将 ccdB 基因替换掉 GFP 片段。 其引物序
列为: XcmI鄄ccdB鄄F: TGTATGG CCGGCTTACTAAAAGC鄄
CAGATAAC; XcmI鄄ccdB鄄R: TGTATGG TTTCTTGTTATAT鄄
TCCCCAGAACATCAG (划线部分为带 A鄄末端的部分 Xc鄄
mI酶切序列), 经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收 PCR扩增
产物, 利用连接酶将其连接到经 XcmI 酶切后带 T鄄末端
893摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
的线性入门载体, 连接后的产物用热激法转化到大肠杆
菌 DH5琢感受态细胞中, 经菌落 PCR 和 XcmI 酶切进一
步鉴定验证后, 获得了含 XcmI 酶切位点的带 ccdB 基因
的入门载体, 命名为 pEGW。 pEGW 经 XcmI 酶切后
(pEGW鄄T) 可与外源片段进行 TA连接。
1. 4摇 入门载体 pEGW鄄T的 TA连接效率检验
1. 4. 1摇 拟南芥 SOS2 基因利用改造后的 Gateway 技术构
建原核表达载体 摇 根据 GeneBank 上 SOS2 基因的全长
cDNA 序列 (序列号 AF237670), 利用 Oligo 6. 0 软件设
计 引 物, SOS2鄄F: CCGGCTTACTAAAAGCCAGATAAC;
SOS2鄄R: TTTCTTGTTATATTCCCCAGAACATCAG。 以 拟
南芥总 cDNA 为模板, 进行扩增。 PCR 反应体系为 50
滋L, 反应条件: 94 益预变性 4 min; 94 益 变性 30 min、
58 益退火 30 min、 72 益延伸 2 min, 30 个循环; 72 益 10
min。 经琼脂糖凝胶电泳切胶回收 PCR 产物, 对其 3忆末
端进行加 A反应。 加 A产物与 pEGW鄄T载体连接后转化
大肠杆菌 DH5琢, 经菌落 PCR 鉴定和测序, 证明正确的
阳性克隆即为 pEGW鄄SOS2 入门载体克隆。
将该入门载体 pEGW鄄SOS2 与原核表达载体 pD鄄
EST15 通过 LR 反应进行连接, 反应体系如下, 在 0. 5
mL离心管中加入以下反应体系 (总体积 2. 5 滋l): Entry
clone (50 ~ 100 ng) 1 滋L, pDEST15 (50 ~ 100 ng) 1 滋L,
LR enzyme mix 0. 5 滋L。 混匀后短暂离心, 将混合体系放
25 益水浴 4 h以上, 取 2. 5 滋L反应体系产物用热激法转
化到 DH5琢感受态细胞中, 经菌落 PCR 鉴定, 阳性克隆
即为 pEXP15鄄SOS2 原核表达载体。
1. 4. 2摇 pEXP15鄄SOS2 原核诱导表达 摇 将含 pEX15鄄SOS2
的 E. coli Rosseta单菌落接种于含氨苄青霉素 (Amp) 的
5 mL LB 培养液中, 于 37 益, 200 r / min 过夜培养, 次
日, 将培养物按 1 颐 100 接种至含 Amp 的 10 mL 液体 LB
培养基中, 于 37 益, 200 r / min振荡培养至 OD600达到 0. 6
~0. 8, 加入 IPTG (使终浓度为 1 mmol·L-1 ) 诱导培养
8 h。 取 1 mL菌液于 4 益 , 12 000 g离心 5 min, 收集菌
体沉淀用 100 滋L PBS 悬浮, 加入 50 滋L 的 2伊SDS鄄PAGE
上样缓冲液, 充分混匀, 100 益煮沸至样品不再呈黏稠
状, 10% SDS鄄PAGE 电泳检测 SOS2 蛋白表达情况, 同
时, 以含 pDEST15 的 E. coli Rosseta做对照。
1. 4. 3摇 pEG104鄄SOS2 真核表达载体的构建摇 将该入门载
体 pEGW鄄SOS2 与真核表达载体 pEarleyGate 104 通过 LR
反应进行连接, 反应体系同 1. 4. 1。 取 2. 5 滋L 反应体系
产物用热激法转化到 DH5琢 感受态细胞中, 经菌落 PCR
鉴定和菌液测序, 鉴定正确的阳性克隆即为真核表达载
体 pEG104鄄SOS2。
1. 4. 4摇 pEG104鄄SOS2 的拟南芥原生质体瞬时表达摇 由于
pEG104 带有 GFP标签, 所以可用于外源基因的 GFP 瞬
时表达检测。 pEG104鄄SOS2 拟南芥原生质体的分离和
PEG介导的瞬时表达采用 Yoo等 (2007) 的方法。 利用
共聚焦显微镜在 488 nm波长的激发光下, 观察绿色荧光
在拟南芥叶肉细胞内的分布。
2摇 结果
2. 1摇 pDONR207鄄GFP的构建
以 PEGAD 质粒 DNA 为模板, 用高保真的
Prime Star DNA 聚合酶成功扩增出 pEGAD 载体
上 GFP 片段 (图 1), 其两端带有 attB 和 XcmI
酶切位点; PCR 产物大小约为 800 bp 左右, 与
理论预测的目标 DNA 长度 (848 bp) 相符。 琼
脂糖凝胶电泳回收, 通过 BP 反应重组到入门载
体 pDONR207 上, 转化 DH5琢后, 进行菌落 PCR
筛选阳性克隆 (图 2), 将阳性单克隆送测序,
序列比对结果与目的片段序列相同, 得到入门克
隆载体 p207鄄GFP。 由于 GFP基因序列两端 XcmI
限制性酶切位点酶切后在切口两端会产生 T鄄末
端, 产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收大片段,
即获得了带 T鄄末端的线性入门载体, 并可直接
用于 TA连接。
摇 摇 摇
图 1摇 GFP基因的扩增产物
M: DNA Marker; 1: GFP基因扩增产物
Fig. 1摇 Amplification of GFP
M: DNA marker; 1: PCR product of GFP
图 2摇 p207鄄GFP载体的菌液 PCR鉴定结果
M: DNA marker; 1 ~ 4: 菌液 PCR结果
Fig. 2摇 PCR checking in p207鄄GFP
M: DNA marker; 1-4: colony culture PCR checking results
9934 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 殷宪伦等: 利用 TA克隆的方法简便构建入门克隆摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
2. 2摇 T鄄末端入门载体 pEGW的构建
为了降低由于酶切不完全导致的载体自连,
我们采用 TA 连接的方法, 将 ccdB 基因替换掉
GFP片段。 ccdB 基因作为负选择标记可以省略
菌落的蓝白斑筛选过程。 用限制性内切酶 XcmI
完全酶切 p207鄄GFP 质粒, 经琼脂糖凝胶电泳后
切胶回收大片段 p207鄄T (图 3); 采用 PCR 方
法, 以 pENTR1A 质粒为模板, 利用引物组合
XcmI鄄ccdB鄄F+XcmI鄄ccdB鄄R扩增出 ccdB 基因片段
(图 4), 其片段两侧带有 A鄄末端, 胶回收后利
用连接酶连接到经 XcmI 酶切后带 T鄄末端的
p207鄄T上, 之后转化 DH5琢 感受态细胞, 经菌
落 PCR筛选阳性克隆 (图略), 命名为 pEGW。
pEGW 经 XcmI 酶切后 ( pEGW鄄T) 可与外源片
段进行 TA连接。 载体改造如图 5。
图 3摇 XcmI酶切 p207鄄GFP
M: DNA marker; 1: 酶切结果
Fig. 3摇 XcmI digestion of p207鄄GFP
M: DNA marker; 1: Digestion results
图 4摇 ccdB基因的扩增产物
M: DNA Marker; 1: ccdB基因扩增产物
Fig. 4摇 Amplification of ccdB
M: DNA marker; 1: PCR product of ccdB
2. 3摇 拟南芥 SOS2 基因利用改造后的 Gateway
技术构建原核表达载体
拟南芥总 cDNA模板经引物 SOS2鄄F+SOS2鄄R
扩增后, 电泳显示了一条 1 341 bp 的特异条带
(图 6)。 回收该片段, 加 A产物与 pEGW鄄T载体
连接后转化大肠杆菌 DH5琢, 经菌落 PCR 鉴定
(图略) 和测序, 鉴定正确的阳性克隆即为
pEGW鄄SOS2 入门载体克隆。 通过 LR 反应与原
核表达载体 pDEST15 进行连接, 连接产物转化
DH5琢, 经菌落 PCR 鉴定 (图 7), 阳性克隆即
为 pEXP15鄄SOS2 原核表达载体。
2. 4摇 pEXP15鄄SOS2 原核诱导表达
重组表达载体 pEXP15鄄SOS2 转化大肠杆菌
Rosseta, 用 1 mmol·L-1 IPTG诱导融合蛋白表达。
SDS鄄PAGE结果显示, 37 益诱导 8 h 后融合蛋白
开始表达。 条带约为 70 kD, 大小与完整 SOS2
融合蛋白大小相符; 空载体质粒转入大肠杆菌
Rosseta后, 没有显示出诱导效应 (图 8)。
2. 5摇 pEG104鄄SOS2 真核表达载体的构建及拟南
芥原生质体瞬时表达
pEGW鄄SOS2 入门载体通过 LR 反应与真核
表达载体 pEarleyGate104 进行反应, 产物转化
图 5摇 入门载体改造的示意图
Fig. 5摇 Chart of modification of gateway vector
004摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
摇 摇 摇
图 6摇 SOS2 基因的扩增产物
M: DNA Marker; 1: SOS2 基因扩增产物
Fig. 6摇 Amplification of SOS2
M: DNA marker; 1: PCR product of SOS2
图 7摇 pEXP15鄄SOS2 载体的菌液 PCR鉴定结果
M: DNA marker; 1 ~ 4: 菌液 PCR结果
Fig. 7摇 PCR checking in pEXP15鄄SOS2
M: DNA marker; 1-4: colony culture PCR checking results
图 8摇 融合蛋白的 SDS鄄PAGE分析
M: 蛋白 Marker; 1: pEXP15鄄SOS2 (原 gateway 技术) 经 IPTG
诱导 8 h; 2: pDEST15 (原 gateway技术) 经 IPTG 诱导 8 h; 3:
pEXP15鄄SOS2 (改造后) 经 IPTG诱导 8 h; 4: pDEST15 (改造
后) 经 IPTG诱导 8 h
Fig. 8摇 SDS鄄PAGE analys of fusion protein
M: protein Marker; 1: pEXP15鄄SOS2 (Gateway technology) expres鄄
sion result with IPTG induced 8 h; 2: pDEST15 (Gateway technolo鄄
gy) expression result with IPTG induced 8 h; 3: pEXP15鄄SOS2 (af鄄
ter modification) expression result with IPTG induced 8 h; 4: pD鄄
EST15 (after modification) expression result with IPTG induced 8 h
DH5琢, 经菌落 PCR 鉴定 (图略), 阳性克隆即
为 pEG104鄄SOS2 真核表达载体。 采用 Yoo 等
(2007) 的 PEG介导的瞬时表达方法将真核表达
载体 pEG104鄄SOS2 质粒导入拟南芥细胞原生质
体中, 在共聚焦显微镜下观察融合基因正常的瞬
时表达 (图 9), 可以看到 SOS2 基因在拟南芥原
生质体中的细胞核和细胞膜中均有表达, 而阴性
对照则没有 GFP的表达。
3摇 讨论
基于位点特异性重组的 Gateway 技术得到越
来越多的研究人员的青睐。 Invitrogen 公司开发
了一系列多用途的目的载体, 这些载体中还包括
着两套与 Gateway兼容的植物双元表达载体, 可
用于农杆菌介导的植物转化, 为高通量分析植物
基因的功能提供了有力的工具 (Karimi 等, 2002;
Curtis等, 2003; Royer 等, 2004)。 为了很好的利
用这些目的载体, 首先要将 DNA片段插入到入门
载体上产生入门克隆。 入门载体的构建可通过位
点特异性重组酶进行 BP 反应, 或拓扑异构酶进
行 TOPO反应。 但这两种方法存在着一些局限性,
如相关反应产品售价高, 到货时间长等问题。
我们通过对入门载体 pDONR207 的改造,
使其产生 3忆端具有单个 T鄄末端的线性化的入门
载体。 根据限制性内切酶 XcmI 酶切后会在片段
两侧产生 T鄄末端的特性, 我们在 pDONR207 载
体上插入 GFP 基因片段的同时也在其两端引入
了 XcmI酶切位点, 通过 XcmI 酶切即可产生 3忆
端具有单个 T鄄末端的线性化的入门载体, 实验
时只需将目的 DNA 片段通过加 A 反应即可与改
造后的入门载体连接形成入门克隆。 同时, 为了
降低由于酶切不完全导致的载体自连, 我们将
ccdB基因替换掉 GFP 片段, 获得带 ccdB 基因的
载体。 由于 ccdB 基因对大多数 E. coli 菌株的致
死效应, 它能极大的减少空载体克隆的可能性。
因此, ccdB基因作为一个负选择标记提高了传
统 TA克隆的可靠性, 不需要进行菌落蓝白斑筛
选。 新的入门载体因为含有 XcmI 的酶切位点,
因此我们将目的 DNA 片段通过加 A 反应即可与
改造后的入门载体 pEGW鄄T 连接形成入门克隆,
从而使今后的 Gateway实验中入门克隆的获得不
再需要昂贵的 BP反应, 而以新载体 pEGW提供
1044 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 殷宪伦等: 利用 TA克隆的方法简便构建入门克隆摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 9摇 拟南芥原生质体中的瞬时表达
1: 未转化的正常拟南芥原生质体; 2: 注射了 pEG104鄄SOS2 质粒的原生质体; a: 绿色荧光; b: 叶绿体荧光;
c: 绿色荧光和叶绿体荧光的叠加图; d: 发射光下
Fig. 9摇 Transient expression of fluorescence in protoplast of Arabidopsis
1: negative control鄄untransformed protoplast of Arabidopsis. 2: transformed protoplast of Arabidopsis by pEG104鄄SOS2.
a: GFP fluorescence; b: chlorophyII fluorescence; c: represent combined images of both chlorophyII and GFP fluorescence; d: bright
的 TA连接方法简便、 经济和快速地获得入门克
隆。 同时, 将 ccdB 基因替代 GFP 片段对 TA 连
接入门载体进行改进后, 减少了空载体克隆的可
能性, 大大增加了 TA 克隆的可靠性。 改造后的
入门 T载体可方便兼容各种含限制性内切酶的
目的片段。 虽然 TA连接存在着非定向克隆的缺
点, 但我们可以利用 PCR 方法和测序很容易鉴
定片段的插入方向。 利用此方法将拟南芥 SOS2
基因构建到与 Gateway技术兼容的原核表达载体
和真核表达载体上, 通过原核表达和真核瞬时表
达可见 SOS2 蛋白都得到了很好的表达, 同时通
过共聚焦显微镜观察 SOS2 基因在拟南芥叶肉细
胞原生质体瞬时表达情况, 可见 SOS2 蛋白在细
胞的细胞膜、 细胞核均有表达。
总之, 通过改造后的入门载体 pEGW, 使之
能将目的 DNA 片段通过改进的 TA 连接的方式
插入到入门载体中, 从而简便、 经济和快速地获
得与 Gateway技术兼容的 TA入门克隆。
也参摇 考摇 文摇 献页
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