全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-14
基金项目:中国农业科学院杰出人才科研启动经费资助
作者简介:何东锋(1981-),男,湖南邵阳人,硕士研究生,研究方向:植物分子生物学;E-mail:hdf8000@126.com
通讯作者:陈信波(1962-),湖南长沙人,教授,博士生导师;E-mail:chenxinbo@hotmail.com
亚麻(LinumusitatissmumL.)是亚麻科(Linaceae)亚麻属(Linum)的一年生草本植物,是重要的油料作
物和纤维作物。亚麻纤维是天然的束纤维,因此被称为“纤维皇后”[1]。亚麻遗传多样性分析和种质资源鉴
定对指导亚麻育种有重要意义。
RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA)技术 Wiliams[2]等 于 1990年建立了随机扩增多态性 DNA技
术,由于其独特的检测 DNA多态性的方式使得 RAPD技术很快渗透于基因研究的各个领域。王世全等[3]对
6个亚麻抗锈病近等基因系进行分析,获得了 2条亚麻抗锈病近等基因系 RAPD特异指纹带的 DNA序列。
高风云等[4]对亚麻显性雄性核不育基因进行 RAPD标记。利用 RAPD技术分析 18种不同国家和地区的亚
麻品种遗传多态性,为亚麻优异种质资源的科学利用和分子标记辅助育种提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
18份亚麻种质资源分别来自中国、美国、日本、法国、瑞士和埃塞俄比亚等国家,生长区域和环境相差
亚麻遗传多样性的RAPD分析
何东锋 1,2 陈信波 1,2 邓欣 1 龙松华 1 高原 2 王进 1 王玉富 1
(1中国农业科学院麻类研究所 农业部麻类遗传改良与工程微生物重点实验室,长沙 410205;
2湖南农业大学作物基因工程重点实验室,长沙 410128)
摘 要: 从600个随机引物筛选出28个扩增稳定性较好的引物,对18份来自不同国家和地区的亚麻资源遗传多
态性进行RAPD分析。结果表明:共扩增出条带529,其中多态性条带 201,总的多态性百分率(PPB)为 38.0%。用
NTSYSpc(2.10)软件进行UPGMA聚类分析,18个亚麻品种遗传距离为0.0469～0.1332之间,可分3大类,其中红木5号
与匈牙利5号亲缘关系最近,ABYSSINIA(BROWN)和匈牙利5号遗传距离相差最显著,达到0.1332。
关键词: RAPD分析 亚麻 亲缘关系 遗传距离
GeneticDiversityAnalysisofFlaxCultivarswithRAPDMarkers
HeDongfeng1,2 ChenXinbo1,2 DengXin1 LongSonghua1 GaoYuan2 WangJin1 WangYufu1
(1MinistryofAgricultureKeyLaboratoryofGeneticImprovement&EngineeringMicrobiologyforBastFiberCrops,
InstituteofBastFiberCrops,CAAS,Changsha410205;2CropGeneEngineeringKeyLaboratory,HunanAgricultural
University,Changsha410128)
Abstract: TwentyeightefectiveRAPDprimerswereselectedfrom sixhundredprimersforthegeneticdiversity
analysisof18diferentflaxvarietiesfrom diferentcountriesandregions.Atotalnumberof528bandswasamplified,and
201bandswerepolymorphic.Thepercentageofpolymorphicbandswas38.0%.Thedendrogram constructedaccording
toUPGMAbyNTSYSpc(ver.2.10)showedthat18flaxvarietiescouldbedividedintothreegroupswithgeneticdistance
from 0.0469to0.1308.The18flaxvarietieswereclusteredinto3maingroups.Redwood5andHungary5hasthe
closestgeneticrelationship.ThegeneticdistancebetweenABYSSINIA andHungary5was0.1332,whichisthemost
diversifiedamongthe18varieties.
Keywords: RAPDanalysisFlax(Linumusitatissmum) Geneticdiversity Geneticdistance
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较大。其样品编号、名称及来源见表 1。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA的提取和浓度测定 取组培室
无菌培养的亚麻幼苗,采用 TIANGEN新型试剂盒提
取亚麻基因组 DNA。紫外分光光度计检验 DNA浓度
及纯度。将 DNA浓度稀释为 20ng·μl-1,-20℃冰箱中
保存、备用。
1.2.2 RAPD反应体系 在 25μl反应体系中,含有
10×Bμfer(含 Mg2+)(TianGen)2.5μl,10mmol·L-1dNTP
(IBM)0.5μl,10μmol·L-1引物各 2μl,模板 DNA20ng,
TaqDNApolymerase(TianGen)1U,ddH2O补足。PCR
扩增条件 94℃预变性 4min,94℃45s,37℃1min,72℃
1.5min,40个循环;72℃延伸 10min,4℃保温。
1.2.3 PCR产物的检测 先用 2.0%的琼脂糖凝胶
分离 RAPD扩增产物,用 AlphaImager2200分析电泳
图像结果,再用 6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检
测产物,使用 9W恒功率条件下电泳 4h,采用银染法
进行凝胶染色[5],并照相。
1.2.4 数据处理与统计分析 将电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为“1”,同一位置没有条带的记为
“0”,由此生成“0”和“1”原始矩阵。统计每个引物扩增出的总带数和多态性带数。将数据输入计算机采用
NTSYSpc(2.10)软件进行分析,运用 Dice系数计算出亚麻各样品的遗传距离,UPGAM方法绘制聚类分析
树状图。
2 结果及分析
2.1 RAPD扩增结果
从上海生物公司购买 600条随机引物,从中筛选出对试验亚麻材料能扩增出清晰的谱带,且重复性稳定
的 28条引物(表 2)。
28条引物对 18种亚麻 RAPD扩增,共产生条带 529,其中差异条带 201,平均每个引物扩增出 8.24条
多态性条带,多态性比率为 38.0%。
2.2 RAPD标记产物的琼脂糖凝胶电泳筛选结果分析
在 2.0%琼脂糖凝胶电泳上扩增出大小不同的 DNA片段。筛选条带清晰,稳定可靠再用聚丙烯酰胺凝
胶电泳分析(图 1)。
2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
由于聚丙烯酰胺凝胶电泳的敏感性较
琼脂糖凝胶电泳高,其敏感性相差 10倍以
上。采用 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行了
扩增产物检测验证。确认了扩增的多态性
条带清晰、稳定(图 2)。
2.4 18个亚麻品种的聚类分析(表 3)
在聚类分析中,以遗传距离 0.082为阈
值可将 18个亚麻品种分为 3大类,第 1类
表 1 试验亚麻品种清单
图 1 S19为引物的 18个亚麻品种 RAPD扩增琼脂糖凝胶电泳图
何东锋等:亚麻遗传多样性的RAPD分析 127
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包括 3个品种:日本三号,NDR714,WINONASEL。第 2类包括 14个品种:百花,瑞士红,法国胡麻,范尼
Fany,PSKOVVSKIV,达克他,红木 5号,匈牙利 5号,83078,K-180,K-1195,花德大,纺织工人,山西大同。第
3类只有一个品种 ABYSSINIA。第 1类中 NDR714与 WINONASEL遗传距离最近,且均是美国品种,地域跨
度小,遗传距离相近,具有一定的同源性。第 2类中加拿大红木 5号与匈牙利 5号,PSKOVSKIV与达克他,
K-1195与花德大 3类遗传距离较近。第 2类中来自中国的山西大同和法国品种白花的遗传差异性最大。
表 2 用于 RAPD分析的 28个有效引物序列和扩增结果
图 3 基于遗传距离用 UPGMA法构建的 18个
亚麻品种亲缘关系的聚类分析树状图
图 2 引物 33S的 18个亚麻品种 RAPD扩增非
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
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品种 ABYSSINIA为单独的 1大类,与其它品种遗传距离较远,和匈牙利 5号的亲缘关系最远(图 3)。
3 讨论
用筛选出较好的 28个引物,将 18个品种可以区分开来。Fu等[6]研究认为亚麻以 RAPD检测遗传多态
性较低。本研究中 RAPD多态性带的比率为 38.0%,亚麻遗传距离为 0.0469～0.1308之间。此前报道的 10
个亚麻品种聚类分析[7]遗传距离仅为 0.0273~0.0724,可能与所选的亚麻品种分布的区域、气候差异有关。
根据 UPGMA法构建 18个亚麻品种亲缘关系的聚类分析树状图,将 18亚麻品种分成 3大类:第 1大类
NDR714与 WINONASEL亲缘关系相近。第 2大类中加拿大红木 5号与匈牙利 5号,PSKOVSKIV和达克他
主要分布的环境气候偏冷,K-1195与花德大可能跟气候干燥相关。第 3大类只有 1种品种来自非洲埃塞
俄比亚 ABYSSINIA,且遗传距离与其他试供亚麻品种相差较大,说明亲缘关系较远。
RAPD技术应用非常成熟,且操作简单,成本低。运用 RAPD技术检测亚麻的遗传多样性是目前适用
的分子标记技术之一。ISSR标记[8]和 SRAP标记[9,10]虽然比 RAPD标记检测多态性稳定可靠,但目前国内外
尚未发现大量稳定可靠的 ISSR和 SRAP引物可以区分亚麻的遗传多态性。RAPD技术缺陷是 PCR反应扩
增的多态性不够稳定,因此对反应的环境要求严格,保证操作和反应条件的一致性。RAPD检测亚麻遗传
多态性,关键在于筛选 RAPD引物,能扩增出稳定差异带。从 600条随机引物筛选得到 28条重复性稳定的
引物。先用琼脂糖凝胶分离 RAPD的扩增产物,得到稳定结果,再用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测最终
结果。试验结果显示差异条带增多,便于观察亚麻的差异带。以 RAPD技术成功的将 18种亚麻品种区分开
来,得到它们不同的遗传距离大小。本试验结论有利于亚麻新品种选育策略的制定。在实际运用中可以根
据聚类分析的结果指导亲本杂交,选择遗传距离较远的材料,增强后代的遗传变异,选育出杂种优势强,综
合性状好,适合我国气候条件的优良亚麻品种。
参考 文献
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表 3 18个亚麻品种的 Nei遗传距离
何东锋等:亚麻遗传多样性的RAPD分析
(下转第144页)
注:1~18品种序号,见表 1
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
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(上接第129页)
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鼠将患年龄依赖性的糖尿病,说明 MafA基因在胰岛素的表达中起着重要的作用[7]。
用细胞免疫荧光的方法检测到在 TAT-MafA孵育 24h的 IEC-6细胞中有胰岛素的表达,RT-PCR检测
进一步证明了这一点。这说明 TAT介导的 MafA融合蛋白不但可以高效进入 IEC-6细胞,而且进胞后仍然
保持 MafA原有的生物学活性,启动胰岛素基因的表达。
肠组织是体内干细胞最多的组织之一,它与胰腺在发育上有着共同的来源,都来源于内胚层[8],除此之
外,小肠细胞和胰腺内分泌细胞在分化上的相似性预示着小肠细胞有着被诱导成为胰岛素分泌细胞的可
能。IEC-6是大鼠上皮细胞,具有干细胞特性,国外已有报道将腺病毒载体介导转录因子 PDX-1或 MafA等
作用于 IEC-6细胞,能诱导该细胞成为胰岛素分泌细胞[9,10]。利用蛋白质转导的方法将小肠细胞 IEC-6诱
导成胰岛素表达细胞,为以肠组织作为靶器官,利用蛋白质转导的方法治疗糖尿病提供了理论依据。
参考 文献
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