全 文 ：一种简单的高产 !，"!丁二醇发酵生产方法
秦加阳，肖梓军，张兆斌，马翠卿，许 平!
（山东大学 微生物技术国家重点实验室，济南 "#$%$$）
摘 要：利用一株克雷伯氏菌（!"#$%&#""’ &’( )*%+#）在以葡萄糖和磷酸氢二铵为主要成分的培养基中发酵生产 "，,!
丁二醇。在补料发酵培养过程中，通过补糖，"，,!丁二醇和 ,!羟基丁酮的最大产量分别达到了 -+ ($ . / ) 和 %$ (# . /
)，二醇的摩尔转化率达到理论水平的 0%1，转化速率达到 % (- . /（)·2）。
关键词：克雷伯氏菌；"，,!丁二醇；发酵
中图分类号：3-%# 文献标识码：4 文章编号：%56" 7 ,56-（"$$#）$+ 7 $$6% 7 $,
# $%&’() &)*+,- ,. "，,/01*23)-%,( ’4,-15*%,3
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6)7 8,4-$：!"#$%&#""’ &’ (；"，,!DBK;=LS:CQ；OLNVL=K;K:C=
"，,!丁二醇在常温下是一种无色无味透明的液
体，它广泛应用于化工、食品、燃料以及航空航天等
各个领域［%，"］。微生物发酵法生产 "，,!丁二醇已经
被广泛研究，而获得高浓度的 "，,!丁二醇是研究者
共同的目标。?Q&C= 和 9C2=&C= 利用产气节杆菌
（( ( ’#)*+#,#%）将 "55 . / )的葡萄糖转化成 06 . / ) 的
"，,!丁二醇和 %+ . / )的 ,!羟基丁酮［,］；ZB 和 J;SSQLN
利用肺炎克雷伯氏菌（ ! ( -,#./*,&’#）从 ""5 . / ) 的
葡萄糖得到 %%, . / ) 的 "，,!丁二醇和 ,!羟基丁
酮［+］；@L=.等人则利用产气节杆菌（ ( ( ’#)*+#,#%）发
酵得到最终质量浓度为 %%$ . / ) 的 "，,!丁二醇和 ,!
羟基丁酮［#］。虽然以上报道 "，,!丁二醇和 ,!羟基丁
酮的总质量浓度都已经大于 %$$ . / )，但存在的问题
是培养基成分复杂，需要使用有机氮源，或采用细胞
循环等技术，前者成本过高且后处理困难，后者则需
要较复杂的设备，都不利于实际生产。
本文 利 用 一 株 克 雷 伯 氏 菌（!"#$%&#""’ &’ (
)*%+#），研究以工业葡萄糖为碳源，廉价的磷酸氢
二铵代替有机氮为氮源，通过流加补糖工艺，发酵生
产 "，,!丁二醇，在保证产物浓度的同时可大幅降低
生产成本，为进一步工业化奠定了基础。
9 材料和方法
% (% 菌 株
实验室自行筛选保藏的一株克雷伯氏菌
（!"#$%&#""’ &’ ( )*%+#）。
! 收稿日期："$$#!$-!"$
作者简介：秦加阳（%0-"!）男，山东济宁人，博士研究生，研究方向：应用微生物与发酵技术。
联系人：许 平，教授，研究方向：环境化学生物学与环境友好生物技术；[V;:Q：’:=.YB\ &SB( LSB( P=
第 , 卷第 + 期
"$$# 年 %% 月
生 物 加 工 过 程
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*CT W "$$#
·6%·
万方数据
! "# 培养基
! "# "! 平板培养基（$ % &）
蛋白胨 !’；酵母粉 (；氯化钠 !’；琼脂 #’。
! "# "# 种子培养基（$ % &）
葡萄糖 )’；磷酸氢二铵 !’；氢氧化钾 ’ "*(；
+,-. ’ "(!；七 水 硫 酸 镁 ’ "/；七 水 硫 酸 亚 铁
’ "’’# #(；七水硫酸锌 ’ "’’0 (；七水硫酸锰 ’ "’’/ )；
柠檬酸 ’ "#!；柠檬酸三钠 ’ "#1*。
! "/ 培养条件
平板培养：/0 2，#* 3；种子液发酵条件：(’’ 4&
三角瓶中放 !’’ 4& 培养基，/0 2，#’’ 5 % 467 培养
!) 3；发酵条件：在德国 8" 859:7 公司生产的 ( & 搅
拌式发酵罐中进行，装液量 * &，接种量 ;<，转速为
/’’ 5 % 467，通风为 ! & % 467，发酵周期为 (’ = ;’ 3。
! "* 分析方法
发酵液的光密度（!"）：使用 0## 分光光度计在
;#’ 74处测得。菌体干重（ "#$）是由光密度通过
一个校准方程（"#$ > ’ "(1# / ? !" @ ! "100 *）转
化而来。
葡萄糖浓度（ %&）：发酵液稀释、离心后采用生
物传感分析仪 A8.B*’C测定。
产物浓度的测定：D.EF.G CHB//)’ 气相色谱仪
检测。乙酸丁酯为萃取剂，体积比 ! I ! 萃取，取上层
有机相 JC 检测。具体测定的条件是：火焰离子监
测器（KF,）温度为 #)’ 2，进样器温度为 ##’ 2，而
毛细管柱温是从 (’ 2升温到 !)’ 2，载气为氮气。
! "( 正交试验
正交试验时，固定发酵配方中葡萄糖质量浓度
为 !)’ $ % &，磷酸氢二铵质量浓度为 #( $ % &。
正交试验的设计是采用 ’)（#0）正交表，各因素
及其水平确定如表 ! 所示。
表 ! ’)（#0）正交试验因素水平表
-9LMN ! &NONMP QR R9STQ5P Q7 ’)（#0）Q5T3Q$Q79M UNP6$7
水平
#（VWX）%
（$ % &）
#（（GX*）#AW*）%
（$ % &）
#（+,-.）%
（$ % &）
#（C9CM#）%
（$ % &）
#（Y$AW*·0X#W）%
（$ % &）
#（YNT9M PQMZT6Q7）%
（4& % !’’ 4&）
#（C6T59TN LZRRN5）%
（4& % !’’ 4&）
! ’ "*( ’ ’ ’ "’1 ’ "/ ’ !
# ’ 0 ! ’ ’ ! ’
注：金属离子母液包括七水硫酸亚铁 ’ "##( $ % &，七水硫酸锌 ’ "0( $ % &，七水硫酸锰 ’ "/) $ % &。柠檬酸缓冲液包括柠檬酸 #! $ % &；
柠檬酸三钠 #1 "* $ % &
! 结 果
# "! 培养基优化结果
正交试验结果如表 # 所示，各因素对发酵影响
大小的顺序依次为 VWX [ C9CM# [ Y$AW*·0X#W [ 柠
檬酸缓冲液 [（GX*）#AW* [ 金属离子母液 [ +,-.。
尤其是前三种成分影响巨大，后三者影响不大，甚至
起反作用。确定最终的发酵配方为葡萄糖 !)’ $ % &；
磷酸氢二铵 #( $ % &；氢氧化钾 ’ "*( $ % &；七水硫酸镁
’ "/ $ % &；六水氯化钙 ’ "’1 $ % &。
表 # #，/B丁二醇发酵正交试验结果
-9LMN # #，/B8ZT97NU6QM RN54N7T9T6Q7 Q7 Q5T3Q$Q79M UNP6$7
编号
#（VWX）%
（$ % &）
#（（GX*）#AW*）%
（$ % &）
#（+,-.）%
（$ % &）
#（C9CM#）%
（$ % &）
#（Y$AW*·0X#W）%
（$ % &）
#（YNT9M PQMZT6Q7）%
（4& % !’’ 4&）
#（C6T59TN LZRRN5）%
（4& % !’’ 4&）
C（H5QUZST6Q7）%
（$ % &）
! ’ \*( ’ ’ ’ \’1 ’ \/ ’ ! (/ \!
# ’ ’ ! ’ \’1 ’ ’ ’ ! \1
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* ’ 0 ’ ’ \’1 ’ ! ! ! \0
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(# / "( /’ "/ // "/ !! "1 !# // "* /’ ";
% () "/ * "0 ! "/ *! "( *! "/ ! "( * "!
注：(!，(# 是各因素分别在水平 ! 和 # 所得产量的和的平均值，% > (49] ^ (467
·0#· 生物加工过程 第 / 卷第 * 期
万方数据
! "! 补料分批发酵结果
发酵培养时，初始葡萄糖质量浓度为 #$% & ’ (。
发酵进行到 )% *以后，发酵液中葡萄糖的质量浓度较
低并且葡萄糖的消耗速率也比较大，此时进行补加固
态葡萄糖。共进行了两次补糖，一次在 )# *，补料前
后发酵液中葡萄糖的质量浓度分别为 !! & ’ (和 +! & ’
(；一次在 )+ *，补料前后葡萄糖的质量浓度分别为 )%
& ’ (和 +% & ’ (。因此，总共补加的葡萄糖质量浓度为
,% & ’ (。发酵过程中维持发酵罐的转速为 )%% - ’ ./0，
通风为 # ( ’ ./0。整个发酵中各个参数的变化如图 #。
在 1# *左右，克雷伯氏菌（!"#$%&#""’ 23 " (4#$1）共消耗
葡萄糖 !%5 & ’ (，得到产物 !，)6丁二醇 5$"% & ’ ( 和 )6
羟基丁酮 #%"1 & ’ (，二醇的摩尔转化率达到理论水平
的 ,#7，转化速率达到 #"5 & ’（(·*）。
—!—()* ’（& ’ (）；—"— +, ’（ & ’ (）；—#— )（89:;/<0）’（ & ’
(）；
—$— )（=>;?0:@/
图 # 发酵过程中菌体干重（()*）、残糖（+,）以及产物生成
曲线
D/& "# E-?3*
C>;?0:@/9;/<0 @>-/0& F:-.:0;?;/<0
从图 # 中还可以发现，在发酵的末期，还有少量
葡萄糖剩余。这可能是发酵液中的氮源或者其它营
养成分的不足造成的。但这同时也说明，发酵过程
还有一定的潜力，通过优化应当可以继续提高产物
的浓度。
! 讨 论
已报道的微生物发酵生产 !，)6丁二醇的方法虽
多，但这些方法或生产成本较高，或处理较困难，对
设备和操作的要求相对较高［, H #)］，难以实现工业
化生产。
本研究采用自行筛选保藏的克雷伯氏菌（ !"#$-
%&#""’ 23 " (4#$1）发酵生产 !，)6丁二醇。以葡萄糖和
磷酸氢二铵为培养基的主要成分，在 1 ( 搅拌式发
酵罐中，通过流加补糖方式，在大约 1% * 的发酵周
期里，由 !%5 & ’ (的葡萄糖，得到 !，)6丁二醇和 )6羟
基丁酮的质量浓度分别为 5$ "% & ’ ( 和 #% "1 & ’ (，二
醇的摩尔转化率达到理论水平的 ,#7，转化速率达
到 # "5 & ’（(·*）。综合考虑产物浓度、摩尔转化率和
转化速率，该过程操作简单，易于控制，适于工业化
操作。
参考文献：
［#］ IJ> KL M =/
@/C2;-?;: 9<09:0;-?;/<0
［L］M 833A T0O/-<0 K/9-
!%%1 年 ## 月 秦加阳等：一种简单的高产 !，)6丁二醇发酵生产方法 ·+)·
万方数据