全 文 ：克雷伯氏杆菌的固定化及其在微胶囊中
生长状况的研究
张 杰，李晓晖，张代佳，孙 磊，修志龙!
（大连理工大学 环境与生命学院生物科学与工程系，大连 !!"#$%）
摘 要：采用注滴法制备载克雷伯氏杆菌的海藻酸盐微胶囊，对微胶囊制备条件进行优化，并考察了各种因素对克
雷伯氏杆菌微囊化的影响。实验结果表明：控制海藻酸钠溶液的质量分数为 $&、氯化钙溶液的质量分数为 % ’(&、
凝胶反应 % )以及菌体与海藻酸钠溶液体积比为 ! * +#，所制备的微胶囊及微囊内菌体的生长效果最好。还初步探
讨了壳聚糖对海藻酸盐微胶囊的影响，发现微胶囊表面复合一层壳聚糖半透膜，可以提高微胶囊的强度，但弹性有
所降低。另外进行了微胶囊中克雷伯氏菌代谢途径的探索。
关键词：克雷伯氏菌；海藻酸盐微胶囊；注滴法；壳聚糖
中图分类号：,-!% 文献标识码：. 文章编号：!"/$ 0 +"/-（$##(）#+ 0 ##(- 0 #"
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MC;H6MC7L T6H) H)7 U7LH F7GJLI ;CE6D;H7 LH6H6E7C;H6H6I7 T;L ! * +# V YGJ;M7 L>CL，7JJ7MHL C7L T;L N6LM>LL7N V .JH7G L>GJ;M7 M<;H7N T6H) M)6HL7I6F7GI7;UC7 I7IUG;D7，H)7 6DH7DL6C7L 6DMG7;L7N U>H JC7Z6U6C6HO N7MG7;L7N V Y6D;CCO，H)7 F;H)=
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86% 2&1$/：!"#$%&#""’ +,#-./,&’#；;CE6D;H7；I6MGC7；NG6FF6DE；M)6H目前，研究固定化酶和细胞的壁材分为合成的
可生物降解的聚合物和天然的大分子物质［!］。其
中，海藻酸钠（.84）由于其可以在温和条件下完成
包被过程是应用最为广泛的一种包埋壁材［$］。海藻
酸盐分子是由!01=甘露糖醛酸（S;DD>G称 S）和"02=古洛糖醛酸（4>C>G过!（!"%）糖苷键连接形成的一类线形无分枝的链
状阴离子聚合物［+，%］。这两种结构单元与二价阳离
子间发生交换反应，形成了典型的“7EE=U构［(］。
! 收稿日期：$##(=#"=$+
作者简介：张杰（![/[=），女，博士生，主要从事生物转化与分离方面的研究。
联系人：修志龙，R7C \ Y;Z：#%!!=-%/#"+"[，P=I;6C：WCZ6>] I;6C ’ NCFHH ’ CD ’ MD
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·(-·
生 物 加 工 过 程
X)6D7L7 5<>GD;C 第 + 卷第 + 期
$##( 年 - 月
万方数据
克雷伯杆菌（ !"#$%&#""’ ()#*+,)&’#）是一种兼性
的厌氧菌，它可以在厌氧［!］或微氧［"］条件下将甘油
转化为 #，$%丙二醇（#，$%&’），在好氧情况下积累中
间产物 $%羟基丙醛（$%(&)）［*］，又能在微氧条件下
利用葡萄糖生产 +，$%丁二醇（+，$%,’）［-］。这些产物
都是重要的化工原料，其生物法生产的特点是以“绿
色”为特征：资源可再生、生产清洁、环境污染非常
小，符合可持续发展的需要，已成为当前工业生物技
术研究的热点［#.］。但到目前为止，尚未看到关于固
定化克雷伯杆菌生产上述化工原料的文献报道。这
可能与这些产物的形成是生长偶联型的特征有关，
细胞在微胶囊中生长空间有限，最终导致微胶囊破
裂，不利于产物积累或微胶囊循环利用。早在 #-*$
年，/01212345等人［##］在甘油中添加盐酸氨基脲，实现
了 $%羟基丙醛的胞外积累，并保持此过程中细胞浓
度变化不大。这表明了在细胞催化甘油的过程中，
细胞代谢中的一些酶（如甘油脱水酶等）活性可保持
较高，甘油尽可能用于 $%(&) 的转化，而生物量的
生成却得到抑制。因此，本文以海藻酸钙微胶囊包
埋克雷伯杆菌为研究对象，考察了微胶囊的制备条
件以及细胞在微胶囊中的生长情况。并对克雷伯杆
菌在微胶囊中的代谢情况进行了初步探索，试图尽
量少地生成生物量，减少菌体生长导致的部分微胶
囊胀破、菌体泄漏，为发酵实验后的菌体分离、循环
利用提供前提条件。
! 实验部分
# 6# 实验材料和仪器
# 6# 6# 实验材料
克雷伯杆菌 ’/7+.+!，购自德国菌种和细胞收
集中心（’/78）；海藻酸钠，北京市旭东化工厂，化学
纯；结晶氯化钙，天津市塘沽邓中化工厂，分析纯；氢
氧化钠，沈阳医药股份有限公司化玻公司，分析纯；
高碘酸钠，中国医药（集团）上海化学试剂公司，分析
纯；乙二醇，公主岭市化学试剂厂，分析纯；壳聚糖，
浙江玉环海洋生物化学有限公司，分析纯。
# 6# 6+ 实验仪器
"+#分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；
(9%$ 恒流泵，上海青浦沪西仪器厂；*:%+ 磁力恒温
搅拌器，上海青浦沪西仪器厂；;<%#=, 气相色谱仪，
日本岛津公司。
# 6+ 实验方法
# 6+ 6# 原料液的配制
> 6 海藻酸钠（)9;）溶液配制：按质量体积比，将
一定量的 )9; 和克雷伯杆菌溶解于 =. ?9 无菌的
去离子水中，搅拌均匀。
@ 6 氯化钙（<><0+）溶液配制：将一定量的 <><0+
溶解于无菌的去离子水中。
# 6+ 6+ 微胶囊的制备
通过蠕动泵，将克雷伯杆菌和 )9; 的混合液经
由一定孔径的针头滴入 <><0+溶液中发生凝胶化反
应，形成载克雷伯杆菌的微胶囊。
# 6+ 6$ 载克雷伯氏杆菌的微胶囊的培养
将载克雷伯杆菌的微胶囊置于一定量的种子培
养基中，在 $! 6: A，#$. 5 B ?12 下培养。隔时取样，测
定发酵液的 -. 值和甘油含量。
# 6+ 6= 海藻酸钠 C 壳聚糖 C 海藻酸钠（)<)）微胶
囊的制备
将海藻酸钙微胶囊置于壳聚糖溶液中，反应
#: ?12，制得 )<)微胶囊。
# 6+ 6: 生物量 -. 值的测定［#+］
# 6+ 6! 甘油含量的测定［#+］
" 结果与讨论
+ 6# 制备条件的优化
+ 6# 6# 海藻酸钠质量分数的确定
实验中仅改变 )9; 的质量分数。实验结果表
明，当 )9;质量分数在 # 6:D以下，微胶囊成球性较
差。随 )9;质量分数的增加，微胶囊直径从 # 6* ??
增加到 + 6.: ??。同时，随 )9;质量分数增大，所制
得的微胶囊内部环境越接近固态环境，微胶囊的弹
性较差。故选 )9;质量分数为 +D（图 #）。
图 # 微胶囊平均粒径与海藻酸钠质量分数的关系
E13 6# FG4 >H45>34 I1>?4J45 H45KLK JG4 MN2M42J5>J1N2 NO >0312>J4
+..: 年 * 月 张 杰等：克雷伯氏杆菌的固定化及其在微胶囊中生长状况的研究 ·:-·
万方数据
! "# "! 氯化钙溶液质量分数的确定
$%$&!溶液质量分数的改变对微胶囊的粒径影
响很小。当 $%$&!溶液质量分数小于 ’(时，微胶囊
较软、强度较差；大于 )(时，微胶囊有部分聚积。
故选 $%$&!质量分数为 * ")(。
! "! 制备条件对菌体固定化效果的影响
通过实验考察了制备条件对菌体固定化效果的
影响，选出最适合菌体生长的微胶囊微环境。
! "! "# 海藻酸钠溶液质量分数对菌体固定化效果
的影响
实验中保持 $%$&!质量分数为 *")(，凝胶反应时
间（* +），加菌量与 ,-.溶液体积比（# / ’0）不变，仅改
变 ,-.溶液的质量分数，制备载克雷伯杆菌的微胶
囊，发酵液中的 !" 值和甘油的变化如图 !，’ 所示。
由不同质量分数的 ,-. 制得的微胶囊均可使 !" 值
增长变缓，甘油含量在 1 + 之后才开始明显下降，后
面的实验中甘油含量均有相同的下降趋势。考察结
果表明前1 +，菌体是在微胶囊中生长，外部溶液中的
!" 值几乎检测不到；但培养基中甘油由于浓差驱动
逐渐进入微胶囊中；1 + 之后，微囊内菌体快速增长，
部分微胶囊破碎，导致菌体泄漏，此时发酵液中可以
检测到 !" 值的增加以及甘油的下降；随着培养时间
的延长，破碎的微胶囊增多，根据图中曲线计算得到，
在培养末期（#1 +），微胶囊中仍截留了 )0(的菌体。
当 ,-. 质量分数为 ! ")(时，!" 值稍高，甘油
消耗速率也变快。这是由于当 ,-. 质量分数增加
时，溶液粘度也增大，与 $%! 2 形成交联的海藻酸盐
微胶囊的孔径增大，强度降低，表面光滑度变差，因
此，菌体生长较迅速并渗透到发酵液中，随之甘油消
耗相对较快。
—!—345674&；—"—# 8)(；—#—!(；—$—! 8)(
图 ! 不同海藻酸钠质量分数时发酵液 !" 值随时间的变化
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6:B< C:6+ D:>><7<56 3453<567%6:45 4> %&;:5%6<
—!—345674&；—"—# 8)(；—#—!(；—$—! 8)(
图 ’ 不同海藻酸钠质量分数时发酵液中残余甘油浓度随
时间的变化
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5%6<
! "! "! 包埋的菌体量对固定化效果的影响
—!—345674&；—"—# / G0；—#—# / ’0；—$—# / #0
图 * 不同菌体与海藻酸钠溶液体积比下发酵液 !" 值随时
间的变化
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6:B< C:6+ D:>><7<56 ?4&@B< 7%6:4 4> A%36<7: 64 %&;:5%6< =4&@F
6:45
—!—345674&；—"—# / G0；—#—# / ’0；—$—# / #0
图 ) 不同菌体与海藻酸钠溶液体积比下发酵液中甘油浓
度随时间的变化
9:; ") $+%5;<= 4> 7<=:D@%& ;&E3<74& 3453<567%6:45 :5 3@&6@7< A746+
?<7=@= ><7B<56%6:45 6:B< C:6+ D:>><7<56 ?4&@B< 7%6:4 4> A%3F
6<7: 64 %&;:5%6< =4&@6:45
·G0· 生物加工过程 第 ’ 卷第 ’ 期
万方数据
实验条件同上，仅改变所包埋的克雷伯杆菌含量（即
改变菌体与 !"#溶液的体积比）。由图 $，% 看出甘
油的消耗速率随微胶囊中菌体含量的降低而变缓。
体积比为 & ’ () 的甘油消耗速率明显滞后，但各组甘
油的最终值相近。当菌量与 !"# 溶液体积比为 & ’
*) 和 & ’ &) 的微胶囊，发酵到在 &+ , 后，发酵液中几
乎没有甘油，但微囊中菌体缺少碳源，限制了菌体的
生长。
+ -+ -* 凝胶反应时间对菌体固定化效果的影响
仅改变凝胶反应时间，制备载克雷伯杆菌的微
胶囊，实验结果见图 (、.、/、0。当凝胶反应为 +、* ,
—!—1234526；—"—& ,；—#—+ ,
图 ( 发酵液 !" 值随凝胶反应时间变化曲线
789 -( :,;39<= 2> !" ?;6@< 2> 1@64@5< A524, ?<5=@= ><5B<34;4823
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—!—1234526；—"—* ,；—#—$ ,；—$—( ,
图 . 发酵液 !" 值随凝胶反应时间变化曲线
789 -. :,;39<= 2> !" ?;6@< 2> 1@64@5< A524, ?<5=@= ><5B<34;4823
48B< C84, B81521;D=36<= 9<6;4839 >25 *、$ , ;3E ( ,
—!—1234526；—"—& ,；—#—+ ,
图 / 发酵液残余甘油质量浓度随凝胶反应时间变化曲线
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—!—1234526；—"—* ,；—#—$ ,；—$—( ,
图 0 发酵液残余甘油质量浓度随凝胶反应时间变化曲线
789 -0 :,;39<= 2> 5<=8E@;6 96F1<526 1231<345;4823 2> 1@64@5< A524,
?<5=@= ><5B<34;4823 48B< C84, B81521;D=@6<= 9<6;4839 >25 *、$
, ;3E ( ,
时，发酵液中 !" 值增长接近于直线；这表明，凝胶
反应为 +、* ,，菌体在培养初期就有少量渗透出微胶
囊；而凝胶反应时间分别为 &、$ 和 ( , 时，由于微胶
囊表层孔隙率适中，菌体无法渗透出微胶囊，直到
( G / ,，部分微胶囊被胀破，致使发酵液中 !" 值快
速增长，但最终仍分别有 (%H、%)H和 $)H的菌体
被固定在微胶囊中。
综合以上实验结果得到，+H 的 !"# 溶液、
$ -%H的 :;:6+溶液、凝胶反应 $ ,、加菌量与 !"# 溶
液体积比 & ’ *) 时，制备的微胶囊中的菌体生长情况
最为理想，提供的微环境相对较稳定，减缓了菌体向
微胶囊外的扩散，在发酵末期，有 %)H的菌体被固
定在微胶囊中。
+ -* !:!微胶囊的制备及其对菌体固定化的影响
—!—1234526；—"—DI $；—#—DI %；—$—DI (
图 &) 表面附加不同 DI值的壳聚糖后，发酵液中 !" 值随
时间变化曲线
789 -&) J,< 1,;39< 2> !" ?;6@< 83 1@64@5< A524, ?<5=@= ><5B<34;K
4823 48B< ;>4<5 1,842=;3 ;E,<5839 42 B81521;D=@6<= ;4 E8>><5K
<34 DI ?;6@<
由图 &) 可见用不同 DI值的壳聚糖包覆的微胶
囊在发酵液中的 !" 值增长曲线相差不大。虽然与
悬浮培养相比 !" 值有所下降，在 &/ , 时 !" 值约
为 & -(，但与仅用海藻酸钙微胶囊包埋的菌体相比，
+))% 年 / 月 张 杰等：克雷伯氏杆菌的固定化及其在微胶囊中生长状况的研究 ·(&·
万方数据
!" 值增长曲线未有明显改善。这是因为复合的壳
聚糖膜使微胶囊表面的孔径变小，膜变得致密，克雷
伯氏菌在代谢过程中产生的气体，如 !"与 #$"等，不
易扩散至微胶囊外，最终导致微胶囊胀破。
" %& 微胶囊内克雷伯氏菌代谢途径的初步探索
通过以上实验，发现固定在微胶囊中的菌体仍
产生大量生物量，导致在发酵末期部分微胶囊破碎、
菌体泄漏，无法满足长时间发酵以及发酵后菌体分
离的要求。从克雷伯杆菌的代谢途径图［’(］中得知，
要生成 ’，)*+,需要还原型辅酶!（-.,!）和维生素
/’"（0/’"）。
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A：—%—3B<46B>
图 ’’ 向发酵液中追加不同浓度的辅酶!和 0/’"后，发酵
液中残余甘油质量浓度的变化曲线
C7D %’’ EF5 3F2 D>I356B> 3B<35<46247B< 7< 3=>4=65
16B4F J56H=H G56?5<4247B< 47?5 2G456 H=K562@@73B<35<46247B< BG -.,! 2<@ 0742?7< /’" 4B 4F5 3=>4=65
16B4F
在只有甘油、代谢途径无法完全进行下去的情
况下，如果保证 -.,!和 0/’"充分存在，则克雷伯杆
菌内的甘油脱水酶和 ’，)*+, 氧化还原酶活性仍可
存在，这样就可在产生 ’，)*+, 的同时，抑制生物量
的生成。本部分实验将一定浓度的菌体加入到只有
甘油和酵母存在的培养基中，再改变所加入的
-.,!和 0/’"的量，检测发酵液中生物量的生成情
况、甘油的消耗情况（图 ’’）以及各代谢产物（如 ’，
)*+,、乙酸和乙醇（图 ’"））的生成情况。
.：—"—12345672 "8 9 0/’" ( :((" ;8 9 -.,!" ( :"; ?D L ?M 7<
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3=>4=65 ?5@7=? 54F2 2354245
图 ’" 向发酵液中追加不同浓度的辅酶!和 0/’"后，发酵
液中乙酸和乙醇浓度的变化曲线
C7D %’" EF5 3F2 3B<35<462*
47B< 7< 3=>4=65 16B4F J56H=H G56?5<4247B< 47?5 2G456 H=K56*
2@@74F5 3=>4=65 16B4F
由图中看见，整个培养过程中，始终检测不到发
酵液的 !" 值，微胶囊也一直保持完整状态；甘油质
量浓度在前 ’( F 持续下降，从 "" D L M降至 ’N D L M左
右，之后处于振荡状态；乙酸和乙醇质量浓度也存在
一定程度的振荡。实验表明在 -.,!和 0/’"存在的
情况下，菌体内一些酶仍具有活性，而某些酶的活性
却得到了抑制，代谢过程进行得不完全，处于 ’，)*
+,、乙酸、乙醇之间的平衡状态，进而抑制了生物量
的增殖。今后将进一步在振荡状态进行实验考察。
·N"· 生物加工过程 第 ) 卷第 ) 期
万方数据
! 结论
通过考察海藻酸钠微囊固定克雷伯氏杆菌的影
响因素，得出以下结论：
（!）采用注滴法将 "#海藻酸钠溶液制备成直
径约为 " $$ 的微胶囊强度较好。所包埋的菌液和
海藻酸钠溶液体积比为 ! % &’ 时，发酵液中 !" 值增
加较平缓，甘油消耗有所滞后。凝胶反应时间为 ( )
时，发酵液 !" 值增长较缓慢，甘油消耗最为滞后，
菌体的固定化效果最好。
（"）最优的制备条件下制得的微胶囊在一定程
度上延迟了菌体的生长曲线，延长至 * + !’ )，可用
于克雷伯氏菌的间歇发酵，并为菌体的回收创造了
有利条件。
（&）只含甘油和酵母的培养基中加入 ,-./ 和
01!"，菌体仍具有活性，但菌体代谢未完全进行下
去，处于 !，&23.、生物量、乙酸、乙醇之间的平衡状
态。这一现象还有待进一步的研究。
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进展［5］4化学通报，"’’!，!’：7"!27"8 4
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［!"］刘海军，王剑锋，张代佳，等 4用克雷伯氏菌批式流加发酵法生
产 !，&2丙二醇［5］4食品与发酵工业，"’’!，"Q（Q）：(2Q 4
"’’8 年 * 月 张 杰等：克雷伯氏杆菌的固定化及其在微胶囊中生长状况的研究 ·7&·
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