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技术与方法

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 2期
基于特定引物 PCR的 DNA分子标记技术研究进展
黄龙花1, 2
吴清平 1
杨小兵 1
胡惠萍 1
( 1广东省微生物研究所 广东省菌种保藏与应用重点实验室,广州 510070;
2广东粤微食用菌技术有限公司,广州 510070)
收稿日期: 2010
09
19
基金项目:广东省科技计划项目 ( 2008B050300001, 2008A020100024 )
作者简介:黄龙花,女,硕士研究生,主要从事分析微生物方面工作; E
m ai:l h lh512@ yahoo. com. cn
通讯作者:吴清平, E
m ai:l wuqp203@ yahoo. com. cn


摘
要:
SSR、SCAR、SRAP和 TRAP是 4种最新发展的基于特定引物 PCR的新型 DNA分子标记技术,具有简便、高效、
重复性好等优点, 已在遗传育种和种质资源研究等各个方面得到广泛应用。介绍了这 4种分子标记的基本原理和特点, 综述
了它们在分子生物学研究中的应用。
关键词:
分子标记
SSR
SCAR
SRAP
TRAP
Research Advance on DNAM olecularMarkers Based on
Specific Prim er PCR
Huang Longhua
1, 2
Wu Q ingping1
Yang X iaobing1
Hu H uip ing1
(
1
Guangdong ProvincialK ey Laboratory of M icrobial Culture Collection and App lication, Guangdong Institute of M icrobio logy,
Guangzhou 510070;
2
Guangdong Yuew ei Ed ib le Fungi T echnology Co. , Ltd. , Guangzhou 510070)


Abstrac:t
SSR, SCAR, SRAP, and TRAP a re the recen tly deve loped m olecularm arkers based on spec ific prim er PCR. They are
simp le, conven ient, e ffic ient, h ighly repeatab le, and have been w ide ly adopted in gene tic, breed ing and germp lasm research. The bas

ic princ iples, character istics and applica tions of those new types o f DNA m o lecularm arke rs w ere introduced in th is pape r.
Key words:
M olecu lar ma rker
SSR
SCAR
SRAP
TRAP
DNA分子标记技术的研究始于 1980年, 本质
上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异
的特异性 DNA片段, DNA分子标记大多以电泳谱
带的形式表现生物个体之间 DNA差异,通常也称为
DNA的指纹图谱。与其他几种遗传标记


形态
标记、同工酶标记、细胞标记相比, DNA分子标记具
有的优越性有:大多数分子标记为共显性,对隐性的
农艺性状的选择十分便利;基因组变异极其丰富,分
子标记的数量几乎是无限的;在生物发育的不同阶
段,不同组织的 DNA都可用于标记分析; 分子标记
揭示来自 DNA的变异; 表现为中性,不影响目标性
状的表达,与不良性状无连锁; 检测手段简单、迅速。
DNA分子标记以其显著的优点广泛应用于动植物
遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴
别、基因库构建、基因克隆等诸多方面。
目前 DNA分子标记技术已有数十种,主要可分
为 4大类: 基于分子杂交的 DNA分子标记技术; 基
于随机 /特定引物 PCR的 DNA分子标记技术;基于
限制性酶切与 PCR技术的分子标记技术; 基于芯片
技术的 DNA分子标记技术。概述新型的基于特定
引物 PCR的 DNA分子标记技术, 包括 SSR、SCAR、
SRAP和 TRAP。目前这些 DNA分子标记技术的应
用仍具有相当的局限性, 如何将它们有效地利用于
分子生物学研究是亟待解决的问题。
1
简单序列重复 ( SSR)
1. 1
SSR标记的原理
简单序列重复 ( simple sequence repea,t SSR )又
称微卫星 DNA ( m icrosate llite DNA )或短串联重复
( short tandem repeats) ,由 L itt和 Luty于 1989年提
出 [ 1] , 其串联重复的核心序列为 1 - 6 bp, 其中最
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 2期
常见是双核苷酸重复, 即 ( CA ) n和 ( TG ) n每个微
卫星 DNA的核心序列结构相同,重复单位数目 10
- 60个, 其高度多态性主要来源于串联数目的不
同及重复程度的不完全。 SSR标记的基本原理:
根据微卫星序列两端互补序列设计引物, 通过
PCR反应扩增微卫星片段, 由于核心序列串联重
复数目不同 ,因而能够用 PCR的方法扩增出不同
长度的 PCR产物, 将扩增产物进行凝胶电泳, 根
据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因
频率。
1. 2
SSR标记的特点
SSR具有以下优点: ( 1)检测快速、信息量大;
( 2)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点;
( 3)微卫星呈共显性遗传, 故可鉴别杂合子和纯合
子; ( 4)所需 DNA量少, 即便降解了也能有效地分
析鉴定出。 SSR分析的缺点: 在采用 SSR技术分析
微卫星 DNA多态性时必须知道重复序列两端的
DNA序列的信息,如不能直接从 DNA数据库查寻,
必须针对每个染色体座位的 SSR测定并找到其两
端的单拷贝序列设计引物并筛选, 因而使其开发成
本高、工作量大。
1. 3
SSR标记的应用
SSR标记是物种的基因型鉴定与品种保护、种
子纯度评价和种质保存、多样性研究、基因和 QTL
分析、系谱分析和分子标记辅助选择育种、资源鉴
定、连续图谱绘制和克隆并筛选大片段文库等领域
的有用工具, 是应用较为广泛的遗传标记。孙琦
等 [ 2]应用 SSR标记进行了玉米遗传育种的研究。
金梦阳等 [ 3]构建了甘蓝型油菜的 SSR标记遗传图
谱,得到了 65个 SSR标记。Tang等 [ 4]利用 SSR分
子标记对 14个花生属野生种和来自多个不同国家
的 24个花生栽培种进行亲缘关系研究,结果表明花
生栽培种可被划分为两个主要类群和 4个亚类群。
Zhan等 [ 5] 对 48个高粱、苏丹草及其近缘种进行
SSR标记研究, 发现该 48个样品可被聚为 5个类
群,且高粱和苏丹草关系十分密切,可归为同一品种
Sorghum (S. bicolor )。B racci等 [ 6]运用 12个 SSR标
记研究利古里亚和地中海的橄榄的种质差异, 结果
发现利古里亚橄榄的种质资源和多态性都略胜
一筹。
2
序列特异扩增区域 ( SCAR)
2. 1
SCAR标记的原理
序列特异扩增区域 ( sequence characterized am

plified reg ion)简称 SCAR标记, 是 1993年 Paran和
M ichelmo re
[ 7]建立的一种可靠、稳定、可长期利用的
RAPD标记技术。 SCAR标记的基本流程:先用随机
引物进行 RAPD筛选, 获取特异的 RAPD标记, 然
后对标记进行克隆和测序, 根据测定 RAPD标记两
末端的序列设计一对引物, 此引物通常包含有原来
的 RAPD引物序列,多为 20 - 24 bp, 再用该引物对
所研究的基因组 DNA进行 PCR扩增, 这样就可以
把与原来的 RAPD片段相对应的单一位点鉴定
出来。
2. 2
SCAR标记的特点
SCAR标记方便、快捷、可靠, 适合于大量个体
的快速检测,结果稳定性好,重复性高。由于 SCAR
标记使用的引物长,因而试验的可重复性高,它克服
了 RAPD重复性欠佳的弱点,同时具有 STS标记的
优点,因此比 RAPD及其他利用随机引物的方法在
基因定位和作图中的应用要好, 在分子标记辅助育
种、种质资源鉴别等方面有着潜在的应用前景,
SCAR标记是共显性遗传的, 待检 DNA间的差异可
直接通过有无扩增产物来显示, 这甚至可省却电泳
的步骤。由于 RAPD扩增过程中错配几率较高,
RAPD标记片段同源性高导致 SCAR标记的转化成
功率较低,而由 SRAP和 ISSR分子标记转化得到的
SCAR标记转化成功率较高。
2. 3
SCAR标记的应用
SCAR标记直接采用专一特异性引物进行 PCR
扩增,排除了随机引物结合位点之间的竞争,且避免
了筛选引物、估算样品间遗传相似性和构建遗传聚
类图的繁琐过程, 稳定性和重复性得以显著提高。
SCAR标记目前已被广泛用于农林经济作物的种质
鉴定、分子标记辅助育种、遗传连锁图谱构建和基因
定位等诸多领域 [ 8- 11]。吴学谦等 [ 12]通过对香菇菌
株 162和申香 10号的 RAPD分析中分别获得一个
多态性片段,再将该片段转化为特异的 SCAR标记,
该标记能快速鉴定这两个菌株。谢宝贵等 [ 13]将金
针菇子实体白色基因连锁的 RAPD标记转化为
SCAR标记,认为可应用于白色金针菇良种选育, 提
62
2011年第 2期 黄龙花等:基于特定引物 PCR的 DNA分子标记技术研究进展
高育种效率。Masuzaki等 [ 14 ]利用 8对 SCAR锚定
引物构建洋葱的 SCAR标记连锁图谱, 并将此用于
其他葱类的遗传分析。Sh imada等 [ 15]在黄酮生物合
成基因内含子长度多态性的基础上, 建立 SCAR标
记,可有效鉴定龙胆草极其变种,从而保护育种者权
利。假单胞菌 ( P seudomonas brassicacearum )可代替
农药用于雪霉病 ( snow mould)的生物防治, H olm

berg等 [ 16]应用 SCAR标记来有效监测假单胞菌的
生物防治作用效果。
3
相关序列扩增多态性 ( SRAP)
3. 1
SRAP标记的原理
相关序列扩增多态性 ( sequence related amplifie
po lymorph ism )简称 SRAP, 是一种新型的基于 PCR
技术的分子标记系统, 由美国加州大学蔬菜作物系
L i与 Quiros博士于 2001年提出 [ 17] , 又叫基于序列
扩增多态性 ( sequence based amp lified po lymo rph ism,
SBAP)
[ 18]。该标记通过一对引物对开放读码框
( ORFs)进行扩增, 上游引物长 17 bp, 5
端的前 10
bp是一段填充序列,紧接着是 CCGG,它们组成核心
序列及 3
端 3个选择碱基,对外显子进行特异扩增。
下游引物长 18 bp, 5
端的前 10- 11 bp是一段填充
序列, 紧接着是 AATT,它们组成核心序列及 3
端 3
个选择碱基,对内含子区域、启动子区域进行特异扩
增,因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长
度不等而产生多态性。
3. 2
SRAP标记的特点
SRAP标记测序显示多数标记为外显子区域,
25条多态性带中 16条 ( 64% )序列 GC含量超过
35%,表明可能是外显子部分; B last搜索表明, 60%
条带与已知基因序列高度一致, 这就确认了 SRAP
产生的多数标记包含了可译框中的外显子。测序还
表明 SRAP多态性产生于两个方面: 由于小的插入
与缺失导致片段大小改变,而产生共显性标记;核苷
酸改变影响引物的结合位点, 导致显性标记产生。
该标记的优点:多态性高; 产率中等; 重复性好;操作
简单; 在基因组中分布均匀;可显示大量的共显性标
记;较易对扩增得到的目标片段进行测序;引物具有
通用性,而且其正向引物可以与反向引物两两搭配
组合, 因此用少量的引物可组配得到多个引物对,提
高了引物的使用效率,降低引物合成成本。
3. 3
SRAP标记的应用
SRAP分子标记系统主要应用于物种资源鉴定
与评价、遗传图谱构建、绘制基因转录图谱、基因定
位以及标记重要基因并克隆测序。该分子技术最早
是在芸薹属作物开发出来 [ 17] , 目前已在其他作物如
马铃薯、水稻、生菜、油菜、大蒜、苹果、樱桃、柑橘与
芹菜中也成功扩增。李翠翠等 [ 19]利用 SRAP分子
标记对 12个真姬菇进行遗传多样性分析,结果表明
SRAP稳定性好, 适于真姬菇的种内鉴定。金梦阳
等 [ 3]构建了甘蓝型油菜的 SRAP标记遗传图谱, 得
到了 202个 SRAP标记。朱坚等 [ 20 ]将 SRAP分子标
记用于金针菇的种质资源分析。Peng等 [ 21]应用
SRAP分析研究 23个种群的红花 ( Carthamus tincto

rius L. )及其两个近缘种 (Carthamus lanatus L. )种
群的遗传多样性, 发现 23个红花种群遗传差异较
大,两个近缘种群间亲缘关系极为密切。U zun等 [ 22]
运用 SRAP标记对 86个柑橘亚科 (Aurant io ideae)柑
橘属 ( C itrus)品种及其近缘种的遗传多样性和亲缘
关系进行研究,共产生 376个多态性片段,但他们在
系统树上的差异并不明显, 亲缘关系极近。 L iu
等 [ 23]首次将 SRAP标记应用于自交系苎麻 DNA水
平的变化的研究,为苎麻的杂交育种提供理论依据,
结果发现巴西的苎麻品种可能为中国品种进化而
来的。
4
靶位区域扩增多态性 ( TRAP)
4. 1
TRAP标记的原理
靶位区域扩增多态性 ( target reg ion amp lified
po lymorphism )简称 TRAP, 也是一种新型的基于
PCR的植物基因型标记技术, 由美国农业部北方作
物科学实验室 Hu与 V ick于 2003年提出 [ 24]。与
SRAP、RAPD和 AFLP等标记技术无须任何序列信
息即可直接 PCR扩增不同, TRAP技术是基于已知
的 cDNA或 EST序列信息。它借助日益增长的庞大
的生物序列信息,利用生物信息工具和 EST数据库
信息,产生目标候选基因区多态性标记。 TRAP技
术是从 SRAP技术改进而来的, SRAP使用两个任意
引物,而 TRAP是使用长度为 16- 20核苷的固定引
物 ( fixed primer)与任意引物 ( arb itrary prime)。固
定引物以公用数据库中的靶 EST序列设计而来; 任
意引物与 SRAP所用的一样 [ 24] ,针对外显子和内含
63
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 2期
子的特点,设计为分别富含 GC或 AT核心区的任意
序列。固定引物的设计步骤:从 EST数据库中鉴别
所需序列, 再采用有关引物设计软件 (如 Primer3
等 )设定核苷酸序列合理长度 ( 18个碱基 )与最适、
最大和最小 Tm值 ( 53、55、50
) , 最后选定最适的
引物。任意引物设计完全同 SRAP技术, PCR扩增
前 5个循环采用 35
的退火温度, 后 35个循环采
用 50
的退火温度, 每次 TRAP
PCR反应在 6. 5%
聚丙烯酰胺测序胶可产生 50- 900 bp的片段 30-
50个。
4. 2
TRAP标记的特点
TRAP标记技术不但具有 RAPD技术的操作简
单、易于建立的特点, 而且具有 AFLP技术强大功
能的优势,它是一种新的基于 PCR的植物基因型标
记技术,具有操作简单、重复性好、多态性丰富、效率
高和稳定性好的特点。
4. 3
TRAP标记的应用
TRAP技术适用于在不同作物上用于各种目的
的研究,包括遗传图谱的构建、重要性状基因标记、
种质资源的多样性研究和鉴定评价、标记辅助选择
育种、gDNA与 cDNA指纹分析乃至图位克隆等方
面。Hu等 [ 24]将 TRAP标记运用于植物的基因分型
研究。金梦阳等 [ 3]构建了甘蓝型油菜的 TRAP标记
遗传图谱, 得到了 10个 TRAP标记。杜晓华等 [ 25]
用 TRAP标记对多年生向日葵的 16个种进行了遗
传多样性研究,建立的系统树与基于形态特征的分
类结果相似。 Johnson等 [ 26]的研究表明, TRAP可以
有效地应用于接骨木 ( Sam bucus sp. )的普通种、栽
培种和野生选育种的遗传多样性评估。Hong等 [ 27]
利用 TRAP标记对天葵 (P elargon ium )的遗传变异种
进行评价研究, 发现该 TRAP标记系统非常适合于
天葵选育种的分类鉴定。A lw a la等 [ 28]利用 TRAP
分子标记进行甘蔗 ( Saccharum )种间杂交的连锁图
谱和基因组分析研究,结果发现 TRAP标记比 AFLP
标记和 SRAP标记的效果都要好, 因为该标记具有
靶基因定位功能。
5
结语
DNA分子标记技术的开发是近年来分子生物
学领域研究的热点,分子标记作为新的遗传标记,与
形态标记、细胞标记和同工酶标记等相比, 具有方
便、快捷、稳定性好、重复性高等诸多显著优点,因此
自其诞生以来,短短 20多年, 已发展了多种新型分
子标记技术,并已广泛应用于动植物和微生物的遗
传育种、连锁图谱构建、基因克隆定位、种质资源评
价和物种鉴定等各方面的研究。
分子标记技术发展迅速,但在某些物种的应用仍
具有相当局限性,如在食用菌研究中, 开发的分子标
记数量不足, 难找到与目标基因紧密连锁的分子标
记; 分子标记对数量性状基因的精确定位有较大差
距;试验程序未实现自动化,难以对大群体进行研究。
随着生物信息学、比较基因组学 ( Compara tive
genom ics)、功能基因组学 ( Funct ion genom ics)、基因
表达的序列分析 ( SAGE )、DNA芯片技术和 cDNA
微阵列等生物技术的发展, DNA分子标记技术也将
不断完善,它们将在种质基因型鉴别评价和目的农
艺性状的基因标记等才刚起步的研究领域开拓更广
泛的应用前景。
参 考 文 献
[ 1] L ittM , Luty JA. A hypervariab le m icrosatell ite revealed by in v itro
am plif icat ion of a d inucleot ide repeatw ith in the card iacm uscle act in
gen e. Am JH um Genet, 1989, 44: 397
401.
[ 2] 孙琦,孟昭东,张发军,等. SSR标记在玉米遗传育种中的应用,
玉米研究, 2006, 14 ( 1) : 37
39.
[ 3] 金梦阳,刘列钊,付福友,等.甘蓝型油菜的 SRAP、SSR、AFLP和
TRAP标记遗传图谱的构建.分子植物育种, 2006, 4 ( 4 ): 520

526.

[ 4 ] Tang RH, ZhuangW J, G ao GQ, et a.l Phylogen et ic relationsh ips in
genu sA rachis based on SSR and AFLP M ark ers. Agricu ltu ral Sci

ences in Ch ina, 2008, 7( 4 ): 405
414.
[ 5] Zhan QW, Zh ang TZ, Wang BH, et a.l D ivers ity com parison and
phy logenetic relationsh ips of S. bicolor and S. sudanense as revealed
by SSR m arkers. P lan t S cience, 2008, 174( 1) : 9
16.
[ 6] B racciT, S ebastian iL, Bu scon iM, et a.l SSR m arkers reveal the u

n iqu eness of olive cu ltivars from th e Ital ian region of Liguria. S cien

t ia H ort icu ltu rae, 2009, 122( 2 ): 209
215.
[ 7] Paran I, M iche lm ore RW. D evelopm en t of reliab le PCR
b ased
m arkers l inked to dow ny m ildew resistance in lettu ce. Theor App l
Genet, 1993, 85( 8 ) : 985
993.
[ 8] 车克鹏, 许勇,梁春阳,等. 西瓜核心种质的 AFLP指纹图谱和
SCAR标记.植物学报:英文版, 2003, 45 ( 6) : 731
735.
[ 9] X iang TH, Y ang JB, Yang QI. SCAR m arkers assisted select ion for
a ben tazon suscep tib le lethality gen e( ben ) in rice. R ice S cien ce,
2003, 11( 1
2) : 6
10.
64
2011年第 2期 黄龙花等:基于特定引物 PCR的 DNA分子标记技术研究进展
[ 10 ] 张仁兵,易克,许勇,等.用重组自交系构建西瓜分子遗传图谱.
分子植物育种, 2003, 1( 4 ): 481
489.
[ 11 ] Yang KQ, Wang Y J, Zh ang JJ. Mapping of seed lessness gene in
grapes us ing SCAR m arkers. A cta G enetica S in ica, 2005, 32 ( 3 ) :
297
302.
[ 12 ] 吴学谦,李海波,魏海龙,等. SCAR分子标记技术在香菇菌株
鉴定上的应用研究.菌物学报, 2005, 24 ( 2) : 259
266.
[ 13 ] 谢宝贵,刘维侠,王秀全,等.金针菇子实体颜色基因的分子标
记.福建农林大学学报:自然科学版, 2004, 33 ( 3) : 363
368.
[ 14 ] M asu zak i S, M iyazak iT, M cCa llum JA, et a.l C onvers ion of chro

m osom e
specific RAPD s into SCAR
b ased anchorm arkers for on ion
linkage m aps and its app lication to genet ic analyses in otherA llium
species. S cien tiaH orticu lturae, 2008, 115 ( 4) : 323
328.
[ 15 ] Sh im ada N, Nakatsuk a T, Nakano Y, et a.l Ident ification of gen

t ian cu ltivars using SCAR m arkers based on intron
length polym or

ph ism s of flavono id b iosyn th et ic genes. S cien tia H ort icu ltu rae,
2009, 119( 3 ) : 292
296.
[ 16 ] H olmb erg AIJ, M elin P, Levenfors JP, et a.l Developm en t and e

valu at ion of SCAR markers for aP seudom ona s brassicacearum strain
used in b iological control of snow m ou ld. B iologicalC ontro,l 2009,
48 ( 2) : 181
187.
[ 17 ] L iG, Quiros CF. Sequence
related am pl if ied polymorph ism ( SRAP ),
a new m arker system based on a sim p le PCR reaction: its appl ica

t ion to m app ing and gene tagging in B ra ssica. Theor App l Genet,
2001, 103( 2
3) : 455
461.
[ 18 ] FerriolM, Pic
MB, Nu ez F. Gen et ic d iversity of som e accessions
ofCucurbi ta maxima from Spain u sing RAPD and SBAP m arkers.
Genet ic Resources and C rop Evo lut ion, 2003, 50( 3 ): 227
238.
[ 19 ] 李翠翠,郭立忠,卢伟东,等. RAPD和 SRAP分子标记在真姬
菇菌种鉴定中的应用.食用菌学报, 2009, 16 ( 1) : 21
25.
[ 20] 朱坚,高巍,林伯德,等.金针菇种质资源的 SRAP分析.福建农
林大学学报, 2007, 36( 2) : 154
158.
[ 21] Peng S, Feng N, Guo M, et a.l G enetic var iation of Cartham us
tinctorius L. and related species revealed by SRAP analysis. B io

ch em ical System at ics and Ecology, 2008, 36 ( 7) : 531
538.
[ 22] U zun A, Y es ilog lu T, Aka
K acar Y, et a.l Gen et ic d ivers ity and
relat ion sh ips w ith inC itrus and related genera based on sequence re

lated am p lified polym orph ism m arkers ( SRAPs) . S cien tia H ort i

cu lturae, 2009, 121( 1) : 306
312.
[ 23] L iu L J, P DX, W ang B. G enetic Relation Analys is on Ram ie
[ Boehm eria n ivea ( L. ) G aud. ] Inbred L ines by SRAP M arkers.
Agricu ltural Scien ces in Ch in a, 2008, 7 ( 8) : 944
949.
[ 24] H u J, V ick BA. T arget region am pl ification polymorph ism: a novel
m arker techn ique for p lan t genotyp ing. P lantM olecu lar B iology Re

porter, 2003, 21: 289
294.
[ 25] 杜晓华,王得元,巩振辉.目标区域扩增多态性 ( TRAP ) :一种
新的植物基因型标记技术. 分子植物育种, 2004, 2 ( 5) : 747

750.

[ 26] JohnsonHY, ByersP, H u J, et a.l A ssessm en t of genetic d iversity
am ong elderberry (Sam bu cu s sp. ) species, cult ivars, andw ild se

lection by TRAP techn ique. H ortScience, 2008, 43 ( 4 ) : 1137

1138.

[ 27] H ong WF, Ba iCQ, B roeM, et a.l Assess ing genetic variab ility of
P elarg onium species using PCR
based TRAP markers. H ortScience,
2004, 39 ( 4) : 812
813.
[ 28] A lw ala S, K imb eng CA, V erem is JC, et a.l L inkage m app ing and
genom e analysis in a Saccharum interspecific cross us ing AFLP,
SRAP and TRAP m ark ers. Euphytica, 2008, 164 ( 1) : 37
51.
(责任编辑
马鑫 )
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