全 文 ：收稿日期:2008-09-16
作者简介:贾如(1984-),男,硕士研究生,研究方向:基因工程
通讯作者:魏兆军,教授;Tel:0551-2901504-8412,E-mail:weizhaojun@163.com
沈桂芳,教授;Tel:010-82109854,E-mail:gfsh2008@caas.net.cn
细粒棘球蚴病又称囊型包虫病,它是由细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus;eg)的续绦期幼虫寄生
在人体肝、肺等脏器引起的一种严重危害健康的人畜共患寄生虫病[1]。该幼虫寄生在宿主体内具有一定的
潜伏期,往往会在感染后 5～10年才出现症状,其主要危害是压迫所寄生的器官、破坏周围组织和毒性作
用。一旦棘球蚴囊破裂,可引起继发性感染或休克,甚至死亡。我国是棘球蚴病的高发国家之一,特别是在
我国西部的新疆、宁夏、甘肃、青海、西藏、四川西北部、内蒙古、陕西的牧区和半牧区等省、自治区流行广
泛,高发区约占全国面积的 44%,受威胁人口约 5000万。全国有 25个省市区有该病的散发病例报道,流
细粒棘球蚴eg95基因的克隆以及原核融合表达
贾如 1 邹媛媛 2 李轶女 2 魏兆军 1 沈桂芳 2
(1合肥工业大学生物与食品工程学院,合肥 230009;2中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081)
摘 要: 从青海省羊源细粒棘球蚴提取基因组DNA,PCR扩增eg95基因并且克隆。测序结果表明该基因序列全
长 1262bp,由2个内含子和3个外显子组成,3个外显子分别为70bp、306bp和 95bp。因此,推测其 ORF为471bp,编码
156个氨基酸。用RT-PCR方法扩增该基因的ORF,经克隆、DNAstar比对分析序列,它与预测的ORF序列100%相同。
将目的基因克隆到原核表达载体pGEX-5x-1,构建重组表达质粒 pGEX-5x-1-eg95,将其转入表达菌株BL21中进行原核
表达。表达产物经过SDS-PAGE电泳分析,得到一条特异的蛋白条带;质谱鉴定证明表达的蛋白确实是eg95抗原蛋白;酶
联接免疫吸附剂测定表明抗原抗体发生了特异性反应,进一步证明融合蛋白进行了正确表达,从而为囊型包虫病的研究
奠定基础。
关键词: 细粒棘球蚴 原核表达 酶联接免疫吸附剂测定
CloneandProkaryoticFusedExpressionofEchinococcus
granulosus95Gene
JiaRu1 ZouYuanyuan2 LiYinv2 WeiZhaojun1 ShenGuifang2
(1ColegeofBiologyandFoodEngineering,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009;2InstituteofBiotechnology,
ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081)
Abstract: ThegenomicDNA wasextractedfrom thesheephydatidcystprotoscolicesthatwasisolatedfrom
QinghaiProvinceinChina.eg95genewasamplifiedusingpolymerasechainreaction(PCR)andcloned.Thesequencing
resultsshowedthewholelengthofeg95geneis1262bp.Therearetwointronsandthreeextrons,thelengthofwhich
are70bp,306bpand95bprespectively.SotheORFofeg95waspresumedtobe471bpandencode157AA.TheORF
wasclonedbyusingtheRT-PCR andclonedintopGEM-TEasyplasmid.ThesequenceswereanalyzedbyDNAstar
andshow100%similaritywiththepresumedsequence.TheORFwasligasedintoprokaryoticexpresionvectorpGEX-
5x-1.TherecombinantexpresedplasmidpGEX-5x-1-eg95wasexpresedinprocaryoticstrainBL21.Thespecificprotein
strapwasdetectedbySDS-PAGEandthemas-spectrum resultsindicatedtheexpresedproteinistheeg95antigen
protein.ELISAshowedthespecialreactionandprovedtherightexpresion,thusitcouldprovidebaseforfurtherstudy
ofcysticechinococcosis.
Keywords: Echinococcusgranulosus Prokaryoticexpresion ELISA
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
行区人群的血清学阳性率为 1.06%～32%,患病率为 0.1%～7.64%[2]。因此,该病严重影响了牧区人民的健康
并造成畜牧业的严重损失,该病有从牧业区向农业区和城市扩散的趋势,极大地危害着人群的身体健康和
畜牧业的发展。
目前,囊型包虫病(CE)的治疗以外科手术为主,药物治疗为辅,但手术对人体损伤大且可能复发,服
用阿苯哒唑和甲苯咪唑可产生严重的不良反应[2]。目前对该病的控制主要以犬的驱虫和对牧民的预防教育
为主,但在发展中国家效果较差,因此疫苗预防将是控制该病的理想途径,当前分子生物学技术的发展为
研制理想的 eg疫苗提供了新方法。Lightowlers等[3]发现用 eg95融合蛋白免疫羊可抵抗 Eg六钩蚴的攻击,
并可获得 96%～100%的保护力,其中 86%的羊得到完全保护,提示 eg95分子是一种有较好保护性免疫力
的抗原。
林仁勇等[4,5]的研究表明表明 eg95基因是高度保守的,在 Eg生长发育中是维持生命所必需的,其保守
程度表明选择性压力保持了编码序列的保守性。但是 Thompson等[6]研究表明,细粒棘球蚴各株系之间存在
着实质性的遗传变异性,Chow等[7]研究也发现,来源于不同地域及不同宿主的 eg95基因之间也存在着差
异。因此,需要对不同来源的 eg95基因进行研究,从而找到它们的结构差别和变异的特点,为细粒棘球蚴
病的防治提供理论基础与实验依据。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌种、酶试剂及基因来源
样品细胞采自棘球蚴病患者组织,提取羊包虫 DNA作为模板;克隆菌株 DH10B、原核表达载体 pGEX-
5x-1以及原核表达菌株 BL21均为本实验室保存;克隆载体 pGEM-TEasy、用到的限制性内切酶以及反转
录酶 M-MLV-RT购自 Promega公司;DNA回收试剂为本试验室保存,DL2000DNAMarker、BriliantBluePlus
Pre-StainedProteinStandard购自全式金公司;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)购自大连宝生物工程有限
公司;TRIzol试剂购自 invitrogen生物技术有限公司。其它常规试剂为国产分析纯。
1.2 设计特异性引物,克隆细粒棘球绦虫 eg95抗原基因
根据已知的 eg95保守区序列设计引物,以提取的羊包虫的 DNA为模板,扩增 eg95抗原基因。引物序
列如下:上游引物(F):5′-GGAATTCATGGCATTCCAGTTATGTCTCAT-3′;下游引物(R):5′-GCTGCAGTCAAG
TAAGGACAACCACTATGC-3′。引物由三博远志生物有限公司合成。扩增条件为:95℃预变性 5min;95℃40s,
58℃、1min,72℃1min,30个循环;72℃最终延伸 10min。PCR产物克隆到 pGEM-Teasy上,构建重组质粒
pGEM-Teasy-eg95。重组质粒转化克隆菌株 DH10B的感受态细胞,37℃过夜培养。碱裂解法提取重组质粒,
用 EcoRI酶切鉴定并测序。
1.3 RT-PCR扩增 eg95基因的开放阅读框(ORF)
用 TRIzol试剂提取羊包虫总 RNA,用反转录酶 M-MLV-RT合成 cDNA第一链,设计特异性引物,扩增
eg95的开放阅读框(ORF)。引物的序列如下:上游引物(F):5′-GGAATTCATGGCATTCCAGTTATGTCTCAT-
3′;下游引物(R):5′-GGAATTCTCAAGTAAGGACAACCACTATGC-3′。引物由三博远志生物有限公司合成。扩
增条件为:95℃预变性 5min;95℃、40s,58℃1min,72℃50s,30个循环;72℃最终延伸 10min。RT-PCR得到
的ORF片段克隆到pGEM-Teasy,构建重组质粒pGEM-Teasy-eg95,EcoRI酶切鉴定后测序。克隆方法同上。
1.4 原核表达质粒 pGEX-5x-1-eg95的构建、表达与检测
用 EcoRI分别酶切原核表达载体 pGEX-5x-1和重组质粒 pGEM-Teasy-eg95,载体酶切后在 70℃灭活
15min,目的片段凝胶电泳回收,经 T4DNA连接酶的作用构建重组表达质粒 pGEX-5x-1-eg95。连接产物转
化克隆菌株 DH10B的感受态细胞。碱法提取质粒,用 EcoRI酶切鉴定目的片段的大小、BamHI鉴定目的
片段的连接方向。将鉴定好的重组表达质粒转化原核表达菌株 BL21,在 IPTG(终浓度为 0.25mM)的诱导下
进行原核表达,SDS-PAGE检测表达目的蛋白的分子量大小。
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2008年第5期
1.5 重组蛋白的质谱鉴定
切割 SDS-PAGE电泳后凝胶中的目的蛋白条带,在中科院动物研究所质谱实验室进行质谱鉴定。
1.6 酶联接免疫吸附剂测定 eg95抗原蛋白
经质谱鉴定后 eg95抗原蛋白用包被液包被,做梯度稀释,10×、100×、500×、2500×、5000×、10000×。用
商品化抗 GST标签小鼠单克隆抗体作为一抗,用 HRP-兔抗小鼠 IgG作为二抗,做酶联接免疫吸附剂测定
ELISA,酶标仪测 492nm处各孔的吸光值。
2 结果
2.1 eg95抗原基因的克隆与测序
以羊包虫 DNA作为模板,设计特异性引物扩增得到的 eg95抗原基因全长为 1200bp左右。经克隆得
到重组质粒 pGEM-Teasy-eg95用 EcoRI酶切鉴定,得到与目的片段大小一致的条带(图 1)。测序结果表
明,基因序列全长为 1262bp,由 3个外显子,2个内含子组成,3个外显子长度分别为 70bp、306bp和 95bp,
因此推测该基因 ORF长度为 471bp,编码 156个氨基酸。将 eg95基因序列在 NCBI网站进行 BLAST比对,
发现与 GenBank公布的我国青海发现的羊包虫 eg95-QH-3基因(登录号:AY421718)有 99%的同源性。只
有在 148bp、284bp、442bp、576bp和 899bp5处存在差异,而且都是内含子部分,从而表明该基因是高度保
守的。
2.2 eg95抗原基因 ORF的克隆与鉴定
经过 RT-PCR得到 eg95ORF片段,经琼脂糖凝胶(1.0%)电泳检测,得到 0.5kb左右的片段。得到的
PCR产物克隆到载体 pGEM-Teasy上,构建重组质粒 pGEM-Teasy-eg95,EcoRI进行酶切鉴定,得到 500bp
左右大小的 DNA片段(图 2)。
2.3 eg95基因 ORF的测序
克隆得到的 eg95基因 ORF经测序,表明该基因的片段长度为 471bp。用 DNAstar软件 MegAlign与预
测的 eg95基因 ORF进行比对,两者具有 100%的一致性,表明没有发生基因突变。
图 1 重组质粒 pGEM-Teasy-eg95酶切鉴定图谱
M.DL2000DNAMarker;1.pGEM-Teasy-eg95EcoRI酶切结果
图 2 重组质粒 pGEM-Teasy-eg95酶切鉴定图谱
M.DL2000DNAMarker;1.pGEM-Teasy-eg95EcoRI酶切结果
2.4 原核表达载体的鉴定
构建的原核表达重组质粒 pGEX-5x-1-eg95′转化 DH10B后,利用快速细胞裂解法鉴定重组质粒,碱裂
解法小量提取质粒后,用 EcoRI进行酶切鉴定目的产物的大小;用 BamHI进行酶切鉴定重组质粒的连接
方向,因为 eg95基因内部 400bp左右有一个 BamHI酶切位点,在 pGEX-5x-1载体的 MCS上 EcoRI前面
存在一个 BamHI酶切位点,若连接方向正确,用 BamHI会切下大约 0.5kb片段。如图 3所示,2种酶切都
得到目的大小的片段,从而证明了连接大小与方向的正确性。测序结果也表明没有基因的移码突变,可以
进行下一步原核表达。
贾如等:细粒棘球蚴eg95基因的克隆以及原核融合表达 173
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
2.5 原核表达产物的 SDS-PAGE电泳
重组表达质粒转化原核表达菌株 BL21后,在 IPTG(终浓度为 0.25mM)的诱导下表达,表达后菌液离
心后的上清与沉淀都经 SDS-PAGE电泳,检测蛋白的分布情况。结果表明上清中几乎没有表达,只有从沉
淀得到特异的蛋白条带,沉淀经过 TritonX-100洗涤,离心后同样进行 SDS-PAGE电泳,只有在沉淀得到特
异单一的条带,上清中没有条带。如图 4所示。从而表明该融合蛋白绝大部分是以包涵体的形式存在。
图 3 重组质粒 pGEX-5x-1-eg95酶切鉴定图谱
M.DL2000DNAMarker 1.EcoRI酶切结果
2.BamHI酶切结果
图 4 pGEX-5x-1-eg95的原核表达
M.BluePlusProteinMarker(12kD~94kD) 1.pGEX-5x-1-eg95原
核表达后上清 2.pGEX-5x-1-eg95原核表达后沉淀 3.沉淀用
TritonX-100洗涤后上清 4.沉淀用 TritonX-100洗涤后沉淀
2.6 质谱鉴定结果
对 GST-eg95融合蛋白的质谱分析见图 5,鉴定的结果表明该融合蛋白肽段质量数与理论值匹配率为
64.51%。从质谱峰图中解析出的肽段序列,搜索数据库表明以下 7段肽段在假定的蛋白中存在,因此可以
确定表达的蛋白的确为 eg95抗原蛋白。
MSPILGYWK、LLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIRYIKHNMLGGCPK
ERAEISMLEGAVLDIR、IAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHK、KRIEAIPQIDKYLK、YIAWPLQGWQATF
GGGDHPPKSDLIEGR、KHFNLTPVGSQGIRLSWEVQHLSDLKGTDISLKAVNPSDPLVYKRQTAKFSDGQLTIGELKP
STLYK以及 KTILGFTVDIETPR。
图 5 eg95抗原蛋白质谱鉴定结果
2.7 酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)检测 eg95抗原
ELISA结果表明,抗原抗体发生了特异性的反应,证明原核融合表达的 eg95带有 GST标签,融合表达
是正确的,而且在在抗原稀释到 2500倍时还是有效的。
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3 讨论
pGEX-5x-1是一个带有 GST标签的原核融合表达载体,很多情况下所表达的融合蛋白是可溶性的,而
且表达量通常也很高。外源基因可插入该质粒 MCS的酶切位点从而在大肠杆菌中进行表达。表达的外源
蛋白 N端含有 GSTs片段,因而表达产物可以根据 GSTs的性质进行检测和纯化,而且 GSTs部分还可以用
凝血因子 X切除,获得单一的外源基因表达产物。GSTs融合蛋白能与亲和介质上的谷胱甘肽结合,再用还
原性谷胱甘肽竞争 GSTs上的结合位点将融合蛋白洗脱下来,从而达到纯化的目的[8]。
借用 pGEX载体得到 GST与 eg95的融合蛋白,从而构建了重组表达质粒 pGEX-5x-1-eg95′,使得 eg95
抗原蛋白的处理可以借助谷胱甘肽-S-转移酶的性质进行纯化,为进一步开展 eg95疫苗相关方面的研究提
供奠定基础,该融合蛋白经洗涤处理后可用于制备抗体。但是该融合蛋白最终没有能够分泌到细胞外,是
以包涵体的形式存在,而包涵体处理引起的变性、复性以及蛋白的纯化比较麻烦,因此需要对蛋白表达方
式进一步研究,譬如可以利用杆状病毒表达系统和毕赤酵母表达系统等来进行表达研究,从而为囊型包虫
病的研究奠定基础。
参考 文献
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贾如等:细粒棘球蚴eg95基因的克隆以及原核融合表达
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