全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
柑橘基因组 DNA快速提取及 ISSR2PCR扩增体系优化
施维属 1, 2 　潘腾飞 1, 2 　钟凤林 1, 2 　潘东明 1, 2 　李开拓 1, 2
王江波 1, 2 　郭志雄 1, 2 　刘天亮 1, 2
(1福建农林大学园艺学院 ,福州 350002; 2福建农林大学园艺产品贮藏保鲜研究所 ,福州 350002)
　　摘 　要 : 　对 CTAB2m ini法进行改良 ,得到一种效率较高的柑橘 DNA提取方法。试验结果表明 ,得到的高质量 DNA适合柑
橘 ISSR分析。同时 ,采用正交设计对影响柑橘 ISSR2PCR因子进行优化。试验结果表明 : 20μl反应体系中采用 5 ng模板 DNA、
0135 mmol/L dNTPs、0115μmol/L Primer、1U Taq酶和 3μl 10 ×Buffer(含 Mg2 + )为柑橘 ISSR2PCR最优反应体系。
关键词 : 　柑橘 　CTAB2m ini　DNA提取 　 ISSR　正交设计 　体系优化
Improvement of Genom ic DNA Extraction M ethod and Optim ization of
ISSR2PCR Amplif ication for C itrus
Shi W eishu1, 2 　Pan Tengfei1, 2　 Zhong Fenglin1, 2 　Pan Dongm ing1, 2 　L i Kaituo1, 2
W ang J iangbo1, 2 　Guo Zhixiong1, 2 　L iu Tianliang1, 2
(1 College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002; 2 Institute of S torage Science and
Technology of Horticultural Products, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002)
　　Abs trac t: 　CTAB2m ini method was imp roved for extracting citrus genom ic DNA1The result showed that the method p roduced
high quality DNA for ISSR2PCR analysis1M eanwhile, the factors influencing ISSR2PCR for Citrus were op tim ized by orthogonal de2
sign1The result p roved that the op timum amp lification condition of ISSR2PCR was including 5 ng DNA temp late, 0135 mmol/L
dNTPs, 0115μmol/L Primer, 110 U Taq DNA Polymerase and 3μl 10 Buffer( containing Mg2 + ) in 20μl reaction volumes1
Key wo rds: 　C itrus L1　CTAB2m ini　DNA extraction　 ISSR　O rthogonal design　System op tim ization
收稿日期 : 2009204217
基金项目 :台湾农业新品种、新技术引进创新研究与示范 (2007BAD07B00) ,台湾果树新品种与品质控制新技术引进创新研究 (2007BAD07B01)
作者简介 :施维属 (19842) ,男 ,硕士研究生 ,从事果树分子生物学研究 ; E2mail: sws_1026@1631com
通讯作者 :潘东明 (19562) ,男 ,教授 ,博士生导师 ,从事园艺产品采后贮运保鲜研究 ; Tel: 0591283701719, E2mail: pdm666@1261com　　柑橘属于芸香科 (Rutaceae)、柑橘属 (Citrus L1)。中国南方自然气候条件优越 ,蕴藏着丰富的柑橘种质资源 ,是世界柑橘主要商品生产区之一。全国共有14个省、自治区、直辖市栽培柑橘 ,年产量达 1 000万t以上 [ 1 ]。柑橘中存在极大的变异系列 :果肉红者如红肉脐橙、黄者如纽荷尔脐橙 ,果实大者如柚、小者如来檬 ,果实酸者如柠檬、甜者如砂糖橘等 ,种质资源十分丰富。在柑橘新品种培育中 ,一般采用杂交育种、芽变选种和实生选种等方式 , 育种进程十分缓慢 [ 2 ]。要想从更深层次上发掘和利用柑橘种质资源 ,就必须在分子水平上对其遗传多样性进行系统 化研究。而 DNA 分子标记能够直接反映基因组DNA间的差异 ,具有信息量大 ,多态性高 ,检测迅速 ,操作简便的特点 [ 3 ]。作为强有力的植物种质资源分析工具 ,简单序列重复区间扩增多态性 ( inter2simple sequence repeats,ISSR)标记技术综合了其他分子标记技术的各种优点 ,具有高多态性、可重复性、DNA 用量少、Primer设计简单、低成本、易操作及无需知道基因组序列等优点 [ 4～6 ]。因此 , ISSR分子标记技术被广泛应用于植物种质资源研究。DNA提取是 ISSR分子标记技术极为重要的上游工作。目前 ,有关柑橘 DNA提取方法已有相关报
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
道 ,但大多存在步骤多、耗时长、药品耗量大等缺点。
CTAB2m ini法是由 Stewart等 [ 7 ]提出的一种提取植
物基因组 DNA 的新策略 , 1 h内即可完成 DNA 提
取 ,具有简单、快速、成本低的特点。CTAB 2m ini法
在柑橘中尚未得到应用。
为使 ISSR扩增结果达到稳定、清晰、重复性好
的效果 ,必须对影响 ISSR扩增体系多个因素 ,包
括模板 DNA、dNTPs、Primer、Taq酶、10 ×Buffer (含
M g2 + )及退火温度进行梯度优化 ,以确定一个最佳
反应条件 [ 8 ] 。吴鑫等 [ 9 ]优化了柑橘 ISSR2PCR 扩
增体系 ,但该体系需多加 Tris2HCl、KCl,其余组分
浓度也相对偏高 ,增加了试验成本 ,且通过 PAGE
凝胶电泳后的图片显示 :其条带背景较为模糊 ,有
明显拖尾现象 ,不利于后期数据统计分析。
该试验首次将 CTAB2m ini法运用到柑橘 DNA
的提取上 ,并结合柑橘的特点 ,对 CTAB 2m ini法稍加
改良 ,期望得到一种效率较高的、适合柑橘 DNA提
取的方法。此外 ,对柑橘 ISSR2PCR扩增体系优化
进行深入研究 ,为利用 ISSR分子标记技术对柑橘种
质资源分析奠定技术基础。
1　材料与方法
111　试验材料
供试材料 (表 1)于 2008年 4月采自福建省泉
州市永春县天马芦柑场 ,选无病虫害的柑橘嫩叶
若干片 ,洗净后用液氮处理 ,置于 - 40℃冰箱保存
备用。
表 1　供试材料名称
编 号 1 2 3 4 5 6 7
材料名称 南丰蜜橘 本地早 早橘 福橘 蜜橘 胁山早生 山川
112　主要试剂
CTAB、EDTA、Tris、A scorbic acid、RNase及 ISSR
Primer( GA ) 8 C均为上海生工公司产品 , PVP240和
D IECA ( diethyldithiocarbam ic acid)为 SIGMA公司产
品 , Taq酶和 10 ×Buffer (Mg2 + )为申能博彩公司产
品 , dNTPs为 Solarbio公司产品 ,其它药品均为国产
分析纯试剂。
113　柑橘基因组 DNA提取 (改良 CTAB2m ini法 )
取 012 g嫩叶放入研磨中 ,在液氮下迅速研磨
成粉末 ,立即装入 115 m l离心管。加入 600 μl
DNA抽提缓冲液 (70℃预热 )及 15μlβ2巯基乙醇 ,
轻柔颠倒振荡 20 s,使之充分混匀。加入等体积酚 /
氯仿 /异戊醇 ( 25 /24 /1 ) ,轻柔颠倒振荡 5 m in,使
之充分混匀 ,常温下 6 000 r /m in离心 5 m in,取上
清液。加入 016倍体积异丙醇 ( - 20℃预冷 ) ,轻
柔颠倒振荡 ,常温下 6 000 r/m in离心 10 m in,弃上
清液。沉淀用 75%酒精清洗 2次 ,用真空干燥机
风干至无酒精味 ,加入 50μl TE缓冲液溶解 ,并按
100 /1 ( v / v)比例 ,加入 015μl RNase,放入 37℃水
浴 30 m in,结束后 - 20℃保存。
114　柑橘基因组 DNA检测
使用 1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性 ;使用
紫外分光光度计测定 OD260、OD280、检测 DNA纯度
与浓度。
115　柑橘 ISSR2PCR扩增体系优化
11511　扩增反应程序 　采用 20μl PCR反应体
系 , PCR反应在热循环仪 B iometra T2gradient上进
行 , 94℃预变性 5 m in; 94℃变性 30 s; 52℃退火
1 m in; 72℃延伸 115 m in1循环 40次 ;然后 72℃延
伸 7 m in;最后置 4℃保存 , 115%琼脂糖凝胶电泳
检测 [ 10 ] 。
11512　 ISSR2PCR条件优化 　以样品 6 (胁山早生 )
为体系模板 DNA,参考欧文军等 [ 11 ]设计方案 ,进行
ISSR2PCR体系优化。对体系中模板 DNA量设置 9
个梯度 ,依次为 5、10、20、30、40、50、60、80与 100 ng。
针对 dNTPs ( 10 mmol/L )、Primer ( 10μmol/L )、Taq
酶 (5 U /μl)及 10 ×Buffer (含 Mg2 + ) 4种因素 ,选用
L9 (34 )设计 PCR各反应成分的因素水平 ,共有 9
个处理 (表 2)。每个 Primer都必须确定一个最佳
退火温度。使用梯度 PCR仪 ,以 ( GA ) 8 C的 Tm为
中心温度 ,设定退火温度梯度范围 ( 10℃) ,自动形
成 1～ 12 个 梯 度 , 从 中 选 择 4619℃、4810℃、
4912℃、5014℃、5116℃、5218℃及 5410℃,共 7个
温度对 Primer ( GA ) 8 C进行优化。其余条件反应
程序均相同。
011
2009年第 10期 施维属等 :柑橘基因组 DNA快速提取及 ISSR2PCR扩增体系优化
表 2　PCR扩增体系水平 —因素正交设计表
编号 dNTPs(mmol/L)
Primer
(μmol/L)
Taq酶
(U /20μl)
10 ×Buffer
(Mg2 + )μl
1 0115 0115 015 110
2 0115 0125 110 210
3 0115 0135 115 310
4 0125 0125 015 310
5 0125 0135 110 110
6 0125 0115 115 210
7 0135 0135 015 210
8 0135 0115 110 310
9 0135 0125 115 110
2　结果与分析
211　柑橘基因组 DNA检测
从图 1可以看出 DNA条带整齐 ,无降解和
RNA污染、无弥散的荧光出现 ,加样孔清晰 ,基本没
有多糖等杂质。使用紫外分光光度计测定 OD260、
OD280 ,试验结果表明 (表 3) , OD260 . OD280在 116～
118之间 ,符合柑橘 ISSR2PCR要求。
图 1　柑橘基因组 DNA电泳图
表 3　7份供试材料在紫外分光光度计上的吸光度值
紫外波长
紫外光吸收光度值
样品 1 样品 2 样品 3 样品 4 样品 5 样品 6 样品 7
OD260 01466 01326 01256 01354 01288 01216 01232
OD280 01272 01191 01153 01211 01178 01125 01142
OD260 /OD280 11713 11707 11673 11678 11618 11728 11634
DNA (μg/m l) 699 489 384 531 432 324 348
212　柑橘 ISSR2PCR条件优化
21211　模板 DNA浓度梯度优化结果 　试验结果表
明 (图 2) , 5～100 ng模板 DNA对扩增结果的一致
性无明显影响。
图 2　模板 D NA浓度梯度优化结果电泳图
21212　 dNTPs、Primer、Taq 酶及 10 ×Buffer (含
Mg2 + )对 ISSR2PCR反应的影响 　 ISSR2PCR正交设
计试验表明 (图 3) ,第 1、第 5和第 9泳道条带数量
极少 ,分别出现 1条、1条和 3条 ,原因可能是 Mg2 +
浓度过低 ,不能有效激活 Taq酶 ,影响 PCR反应的
特异性和扩增效率。第 2、第 3泳道的条带较为模
糊 ,可见的条带只有 5条 ,原因可能是 dNTPs浓度偏
低 ,使 dNTPs过早消耗完 ,影响 PCR扩增产率。第 7
泳道的条带数达到 7条且清晰度高 ,但较第 4、第 6、
及第 8条泳道来看 ,其在 1 000 bp以上的条带消失 ,
原因可能是 Primer浓度过高 ,出现非特异性扩增及
Primer二聚体 ,从而与靶序列竞争 Taq酶和 dNTPs,
影响靶序列的产量。第 4和第 6泳道的条带数达到
7条、清晰度也高 ,但第 8泳道的条带则更为清晰稳
定。最终体系确定在终体积 20μl的反应体系中 :
dNTPs为 0135 mmol/L、Primer为 0115μmol/L、Taq
酶为 1 U、10 ×Buffer(含 Mg2 + )为 3μl。
图 3　Pr im er( GA) 8 C的 ISSR2PCR
正交试验设计扩增结果电泳图
111
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
21213　退火温度对 ISSR反应的影响 　图 4中从
1～ 7 依 次 为 4619℃、4810℃、4912℃、5014℃、
5116℃、5218℃及 5410℃。试验结果表明 ,第 1至
第 5泳道的条带都较为清晰、稳定 ,一致性较高。第
6、第 7泳道在 750 bp至 2 000 bp之间的部分条带
则出现模糊现象 ,原因可能是退火温度过高 ,影响
PCR扩增效率 ,导致产物量下降。
图 4　Pr im er( GA) 8 C退火温度
梯度优化结果电泳图
213　优化反应体系的确定
20μl反应体系中包括 : 5 ng模板 DNA、0135
mmol/L dNTPs、0115μmol/L Primer、1 U Taq酶和 3μl
10 ×Buffer(含 Mg2 + )为柑橘 ISSR2PCR最优反应体系。
214　Primer( GA ) 8 C对 7份不同 DNA模板的 ISSR2
PCR扩增结果
利用该优化体系 , 使用 Primer ( GA ) 8 C 在
5116℃的退火温度下 ,对 7份供试样品 DNA 进行
ISSR2PCR扩增。结果如图 5所示 ,该体系能够得到
清晰、稳定的扩增条带 ,完全适合 ISSR分子标记对
柑橘进行种质资源分析。
图 5　Pr im er( GA) 8 C对 7个供试样品的
ISSR扩增结果电泳图
3　讨论
311　柑橘基因组 DNA的高效快速提取
柑橘叶片中富含酚类、多糖、单宁及色素等干扰
物质 [ 12 ]。因此 ,提取柑橘叶片基因组 DNA 较难。
熊光明等 [ 13～15, 16 ]曾采用不同改良 CTAB法提取柑
橘基因组 DNA,都需 65℃水浴 30～60 m in、氯仿 /异
物醇反复抽提及过夜等一系列繁琐处理 ,耗时长、效
率低、药品耗量大。
改良 CTAB 2m ini法是在 CTAB2m ini法基础上建
立起来的一种适合柑橘 DNA提取的方法。与传统
CTAB法相比 ,改良 CTAB2m ini法在 DNA提取缓冲
液中多加了 PVP240、A scorbic acid及 D IECA 3种成
分。酚结合剂 PVP240可以除去柑橘中富含的酚类
物质 ; A scorbic acid可以增强 DNA抽提缓冲液体系
的抗氧化作用 ;酚氧化酶抑制剂 D IECA可以阻止酚
类物质发生氧化 ,避免其与 DNA的不可逆结合 ,从
而提高 DNA 的纯度和得率 [ 17 ]。此外 ,改良 CTAB2
m ini法无需 65℃水浴、无需氯仿 /异戊醇反复抽提 ,
成本低、效率高 ,所提出的高质量 DNA完全满足柑橘
ISSR分析。
312　模板 DNA浓度对 ISSR反应的影响
ISSR2PCR反应中对模板 DNA浓度范围要求通
常较宽 , 20μl反应体系中一般为 5～50 ng[ 18 ]。浓
度过低会导致扩增产物不稳定 ,过高则可能出现非
特异性扩增 [ 19 ]。体系中最佳 DNA模板浓度与 DNA
纯度关系密切 ,因为样品 DNA里的杂质会影响 Taq
酶发挥作用 ,稀释则会减少杂质对 Taq酶的影响 [ 20 ]。
因此 ,在允许范围内 ,选择较低的模板 DNA浓度可以
降低对 PCR体系扩增的影响。综合考虑 ,选用 5 ng
模板 DNA量用于柑橘 ISSR2PCR扩增。
313　Primer退火温度对 ISSR反应的影响
通常过高的退火温度会影响 PCR扩增效率 ,导
致产物产量下降。较低的退火温度在保证 Primer
与模板结合稳定性的同时 ,也会使 Primer与模板之
间未完全配对的一些位点间得到扩增 ,即产生一定
的错误扩增。因此 ,在允许的范围内 ,选择较高的退
火温度可减少 Primer和模板之间的非特异性结合 ,
提高 PCR反应的特异性 [ 21 ]。综合考虑 ,选 5116℃为
Primer(GA) 8 C在该体系的最佳退火温度。
314　 ISSR分子标记技术的不足之处
ISSR技术虽然在植物鉴别与系统分类方面有
强大说服力 ,但也存在不足。如用 ISSR标记数据计
算遗传相似系数时可能会出现偏差 ,可能由于在一
个位置上出现的条带并不是来自基因组上的同一区
211
2009年第 10期 施维属等 :柑橘基因组 DNA快速提取及 ISSR2PCR扩增体系优化
域 ,但片段长度刚好相等 [ 22 ]。此外 , ISSR大部分情
况下是显性标记 ,不能区分纯合体与杂合体 [ 23 ]。因
此 ,在柑橘分类研究中应该综合其他分子标记技术
等多方面的证据 ,才能对柑橘分类提供一个更完美
的解释。
参 考 文 献
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