全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-05-19
基金项目：863 探索类项目（2006AA10Z449），江苏省六大人才高峰计划
作者简介：窦文芳（1976-），男，山东济南人，博士研究生，研究方向：基因工程药物；Tel：0510-85918219，Email：douwenfang@yahoo.com.cn
通讯作者：金坚，教授，博士生导师，Tel：0510-85918219，E-mail：jinjian31@hotmail.com
糖尿病是世界性疾病，发病率居高不下，对人类健康构成严重威胁。长期以来，各国学者均致力于糖尿
病的发病机制研究和糖尿病药物的开发 [1]。 GLP-1 能刺激胰 β 细胞增殖，促进胰岛再生，同时又能抑制胰 β
细胞的凋亡， 并能促进胰 β 细胞合成胰岛素。 动物试验和临床试验均表明Ⅱ型糖尿病病人给予 GLP-1 后
血糖水平显著降低，且无胰岛素和磺脲类降糖药的低血糖危险 [2，3]。 GLP-1 独特的降血糖作用机制与众不
同，是现有抗糖尿病药物无可比拟的，但其非常短的体内半衰期大大限制了其应用 [4，5]。
影响 GLP-1 半衰期的因素主要有以下 2 个方面：（1）GLP-1 在 N 端的第 2 位氨基酸处易被体内的二肽
人胰高糖素样肽-1及其突变体在大肠杆菌 BL21中
的表达与生物活性研究
窦文芳 张莲芬 雷楗勇 张立操 陈蕴 金坚
（江南大学医药学院制药细胞与分子药理实验室，无锡 214122）
摘 要： 以人胰高糖素样肽-1（human glucagons-like peptide-1，GLP-1））为研究对象，以克隆载体pPblu2SKP/
（GLP-1A2G）2基因为模板，利用PCR扩增获得GLP-1与其突变体GLP-1A2G的编码基因，并将其插入原核表达质粒pGEX-
4T-1中，利用氯化钙法将其转入表达宿主大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中诱导表达，经IPTG诱导后，收集菌体。
菌体经超声破碎后，裂解液用GST亲和层析纯化得到融合蛋白，经凝血酶酶解，用Superdex G-75凝胶层析，得到GLP-1
及其突变体GLP-1A2G的样品，经SDS-PAGE电泳测定，样品纯度＞90%。小鼠糖耐量试验表明，相对于空白对照组而言，
GLP-1及其突变体GLP-1A2G可以明显地控制血糖的水平，两者的生物活性并无明显差异。由于突变体GLP-1A2G较GLP-1
可以更加有效的抵制DPPⅣ的降解，提示突变体GLP-1A2G较GLP-1在白蛋白融合或PEG修饰等方面具有更大的优势。
关键词： 人胰高糖素样肽-1 突变体 表达 生物活性
Expression of Human Glucagon-1ike Peotide-1 and Human
Glucagon-1ike Peotide-1 Mutant Gene in BL21
Dou Wenfang Zhang Lianfang Lei Jianyong Zhang Licao Chen Yun Jin Jian
（Laboratory of Pharmaceutical Engineering，School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract： Glucagon-like peptide-1 （GLP-1） is a 30-residue peptide hormone secreted by intestinal L-cells in
response to nutrient ingestion. This article focused on the expression purification and bio-activity of GLP-1 and GLP-1A2G.
These two genes were amplified by PCR and constructed in plasmid of pGEX-4T-1. The e ombinant plasmids of
pGEX-4T-1/GLP-1 were transformed intoEsche ichia coli BL21（DE3）and expression continued as induced by IPTG.
The fusion proteins were purified from lysates with GST affinity chromatography. The GLP-1 and GLP-1A2Gwas obtained
following two purification steps including cutting with thrombin and Superdex G75.The Tricine-SDS-PAGE showed that
the molecular weight of the GLP-1 and GLP-1A2Gwas 3.1 kD and the purity of the GLP-1 and GLP-1A2Gwas more
than 90%. The Glucose tolerance tests in mice model suggested that plasma glucose level were significantly lower after
administration of GLP-1 or GLP-1A2Gin combination with glucose，comparing with glucose alone. Thus the GLP-1A2G
Seems to be more suits for protein fusion with HSA or modification by PEG than GLP-1.
Key words： Glucagon-like peptide-1 Mutant Expression Bio-activity
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
酰基肽酶Ⅳ（DPPⅣ）降解而失去生物活性；（2）GLP-1 的分子量比较小，仅为 3.1kD，在代谢过程中极易被
肾小球滤过 [6]。 为克服以上 2 个缺点，实现 GLP-1 在体内的长效作用，首先将 GLP-1 与其突变体 GLP-1A2G
在大肠杆菌中表达并比较其活性， 再运用生物信息学的手段通过分子模拟设计合理的 GLP-1 或其突变体
GLP-1A2G 与白蛋白的融合分子，并在毕赤酵母中表达，进一步研究融合分子的药效学和药代动力学。 主要
研究 GLP-1 与 GLP-1A2G在大肠杆菌中的分泌表达情况， 纯化和制备 GLP-1 与 GLP-1A2G 样品， 并且比较了
GLP-1 与 GLP-1A2G生物活性的差异。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌宿主菌株为 Escherichia coli DH5α，克隆载体 pPblu2SKP/（GLP-1A2G）2，由本实
验室保存；大肠杆菌表达宿主菌株为 BL21，表达载体 PGEX-4T-1，由微生物系李华钟教授惠赠 ，重组大肠
杆菌 BL21（PGEX-4T-1- GLP-1）、BL21（PGEX-4T-1-GLP-1A2G）为本研究中构建。
1.1.2 工具酶和试剂 实验用限制性内切酶 BamH I、Not I、T4 DNA 连接酶购自 Fermentas 公司 ；pfu DNA
聚合酶购自南京天根公司；细菌基因组提取试剂盒，Bradford 蛋白含量试剂盒，琼脂糖凝胶回收试剂盒及小
量质粒提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、小分子量蛋白质标准、还
原型谷光甘肽为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；除特别注明外，实验用各种试剂均为国产分析
纯。
1.2 培养基和培养条件
1.2.1 培养基 LB 培养基：10g/L 蛋白胨，5g/L 酵母粉，10g/L 氯化钠，去离子水配制，自然 pH。固体培养基
添加 2%的琼脂。 固体和液体培养基在需要时加入氨卞青霉素至 50μg/ml。
1.2.2 培养条件 大肠杆菌在 37℃振荡培养过夜，往复式摇床转速为 110r/min。
1.3 分子克隆技术
根据同源性，参照 GLP-1 的基因序列设计一对寡核苷酸引物：
PG1：5-TGCGGATCCCACGGTGAAGGTACTTTCACTTCTGA-3
PG2：5-ATAGCGGCCGCTTAACGACCCTTAACCAACCAAGC-3
PG3：5-TGCGGATCCCACGCTGAAGGTACTTTCACTTCTGA-3
PG1、PG2 用于 GLP-1 基因的 PCR；PG3、PG2 用于 GLP-1 突变体基因的 PCR。
上下游引物分别引入 BamH I，Not I 酶切位点。 分别以克隆质载体 Pblu2SKP/（GLP-1A2G）2 为模板进行
PCR 扩增。 循环参数为：95℃预变性 4min，94℃变性 45s，52℃退火 45s，72℃延伸 30s，反应为 29 个循环，最
后 72℃延伸 10min。
引物合成由上海生工生物工程服务技术有限公司完成。 DNA 序列测定由上海捷瑞生物工程有限公司
完成。 引物设计及 DNA 序列分析采用 DNAman5.2.2 软件。
1.4 融合蛋白 GST-GLP-1 和 GST-GLP-1A2G的诱导表达和纯化
将所挑取的单菌落接种于 10ml LB 培养液中 （含氨苄青霉素 50mg/L），37℃、250r/min 振摇过夜， 次日
按 1：100 的比例接种至 1L 上述 LB 培养液中，37℃、 250r/min 培养 2~3h 至 OD 值为 0.8 左右加入终浓度为
0.5mmol/L 的 IPTG，37℃、250r/min 诱导表达 6h。8 000r/min 离心 10min 收集菌体。将离心所得的菌体重悬于
100ml 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，5mmol/L DTT，pH 7.4）。 在冰浴条件下超声破菌，收集超声后的液体，混
匀。随后在 4℃，12 000g 离心 20min，收取上清，并于 4℃保存，用 GST 亲和层析柱在 4℃进行蛋白质的纯化。
用冷 PBS 进行预平衡 ， 上柱流速为 5ml/min， 上柱后用冷 PBS 洗至 A280 到基线水平 ， 然后用 pH 8.0 的
50mmol/L Tris-HCl（含 10mmol/L 的还原型谷胱甘肽）进行洗脱。 对洗脱蛋白用 Bradford 方法进行蛋白质定
量，取部分样品进行 SDS-PAGE 分析。
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1.5 蛋白 GLP-1 和 GLP-1A2G的纯化和鉴定
按 10U 凝血酶/mg 蛋白的用量将凝血酶加入已纯化的融合蛋白液体中， 于 4℃酶切 8h， 用 PEG20000
在截留分子量 1 000 透析带中浓缩，再用 SephadexG-75 凝胶过滤柱分离目标蛋白。 对洗脱蛋白用 Bradford
方法进行蛋白质定量，取部分样品进行 Tricine-SDS-PAGE 分析 [7]。
1.6 GLP-1 及 GLP-1A2G的生物活性测定
取 18 只昆明 ICR 雄性小鼠，自由饮水取食，每天保持 12h 明暗环境。 小鼠适应环境 1 周后，按体重随
机分组，每组 6 只，称重、编号。在试验前 1 天晚上禁食，仅给予饮水，次日早上进行试验。分别以 1.5g/kg 体
重的剂量灌胃给葡糖糖，对照组尾静脉注射 100ul 的生理盐水；实验组分别尾静脉注射 GLP-l 和 GLP-1A2G
供试品（12nmol/kg）。 分别在 0、30 和 60min 尾静脉取血，测定血糖水平 [8]。
2 结果与分析
2.1 GLP-1 与 GLP-1A2G的基因合成
以 pPblu2SKP/（GLP-1A2G）2 为模板 ， 分别利用引物 PG1-PG2 和 PG3-PG2 扩增 GLP-1 和 GLP-1A2G 的基
因。1.2％琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物（图 1）。由图可知，在略高于 100bp 处出现明亮的特异性条带，表明
已经成功扩增了 GLP-1 与 GLP-1A2G的基因。
2.2 表达质粒 pGEX-4T-1/GLP-1 和 pGEX-4T-1/GLP-1A2G
的构建及其鉴定
将上述 PCR 扩增的 GLP-1 与 GLP-1A2G 基因用 DNA 片段
快速胶回收试剂盒进行纯化。 将纯化的 GLP-1 与 GLP-1A2G 的
基因和质粒 pGEX4T-1 用限制性内切酶 BamHI 和 NotI 进行消
化 ， 用 T4 连接酶连接目的片段和载体质粒 ， 构建重组质粒
pGEX4T-1/GLP-1 与 pGEX4T-1/ GLP-1A2G。 其构建流程见图 2。
将重组质粒 pGEX4T-1/GLP-1 与 pGEX4T-1/GLP-1A2G 用氯
化钙法转化到大肠杆菌 BL21（DE3）受体菌，涂布于含 Amp 的
LB 琼脂平板上，37 ℃培养过夜。 由于目的基因的片段长
度很小 ， 无法用限制性内切酶鉴定阳性菌落 ， 故选用
PCR 法检测阳性克隆菌落。 将鉴定为阳性的菌落过夜培
养，提取质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测
序，结果与预测完全一致（结果略）。
2.3 融合蛋白 GST-GLP-1 与 GST-GLP-1A2G在大肠杆
菌中的表达与产物的纯化
挑取测序正确的阳性克隆子 ， 以大肠杆菌 BL21
（DE3） 作对照 ， 接种至 20ml 上述 LB 培养液中 ，37℃、
250r/min 培养 2 ~3h 至 OD 0.8 左右 ， 加入终浓度为
0.5mmol/L 的 IPTG 诱导表达 6h。 经 IPTG 诱导后的重组
大肠杆菌 BL21（pGEX4T-1/GLP-1））和 BL21（pGEX4T-1/
GLP-1A2G）全细胞 SDS-PAGE 电泳（图 4），在 29.2kD 位置
出现明显特征条带 ， 与预测完全一致 ， 说明融合蛋白
GST-GLP-1 与 GST- GLP-1A2G 已经成功的在原核宿主
BL21（DE3）中得到表达。
将超声波破碎后的细胞裂解液按照 GST 亲和柱的
图 1 GLP-1 与 GLP-1A2G 基因的扩增
1：DL2000 分子量标准 ；2：GLP-1 基因 PCR 产物 ；3：
GLP-1A2G 基因 PCR 产物

PCR
GLP-1 

PCR
GLP-1 
BamHI NotI 
T4  
  
  


 

 
图 2 pGEX4T-1/GLP-1 与 pGEX4T-1/GLP-1A2G
的构建流程
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
说明进行亲和层析， 将纯化后的蛋白进行 SDS-PAGE 电
泳分析。融合蛋白 GST-GLP-1 或 GST- GLP-1A2G经纯化后
在分子量 29.2kD 处呈现单一条带， 说明经 GST 亲和层
析后 ， 已经获得了单一的融合蛋白 GST-GLP-1 或 GST-
GLP-1A2G（图 5）。 用 Bradford 蛋白含量检测试剂盒对纯化
后的蛋白进行定量，GST-GLP-1 和 GST- GLP-1A2G 的浓度
分别为 2.6mg/ml 和 2.5mg/ml。
2.4 蛋白 GLP-1和 GLP-1A2G的纯化和鉴定
将上述纯化获得的融合蛋白， 按 10U 凝血酶/mg 蛋
白的用量 ，于 4℃酶切 8h，用 PEG20000 在截流分子量
1 000 透析带中浓缩， 再用 SephadexG-75 凝胶过滤柱分
离目标蛋白。 将凝血酶酶切后的蛋白进行 SDS-PAGE 电泳分析，将分子筛获得的目标蛋白用 Tricine-SDS-
PAGE 分析。
由图 4 可以看出，融合蛋白经酶切后在 26.0kD 处出现 GST 的条带，说明融合蛋白已经被凝血酶切开，
但由于 GLP-1 与 GLP-1A2G 的分子量较小，进一步用 Tricine-SDS- PAGE 分析 ，由结果 （图 5）可知在分子量
3.1kD 处出现单一条带，运用软件 Gelpro 4.5 分析，蛋白纯度>90%，说明目标蛋白 GLP-1 与 GLP-1A2G 得到
有效的纯化，符合下一步药效学实验的要求。经 Bradford 蛋白含量检测试剂盒测定，GLP-1 和 GLP-1A2G的浓
度分别为 0.2mg/ml 和 0.23mg/ml。
2.5 GLP-1 及 GLP-1A2G的生物活性测定
图 3 重组大肠杆菌的全细胞蛋白及 GST 亲
和层析纯化的电泳
1：蛋白分子量标准 ;2：IPTG 诱导重组大肠杆菌 BL21
(PGEX-4T-1- GLP-1) 2.5h;3：IPTG 诱导重组大肠杆
菌 BL21(PGEX-4T-1-GLP-1A2G);4：大肠杆菌 BL21；5:
GST-GLP-1 亲和层析 ;6：GST-GLP-1A2G 亲和层析
图 5 GST-GLP-1 和 GST-GLP-1A2G SephadexG-
75 纯化电泳分析
图 4 GST-GLP-1 和 GST-GLP-1A2G 凝血酶
酶切电泳分析
1：蛋白分子量标准；2：GLP-1；3：GLP-1A2G1：蛋白分子量标准 ；2：GST-GLP-1 凝血酶酶切 ；3：GST-
GLP-1；4：GST-GLP-1A2G 凝血酶酶切
为了探讨 GLP-1 与 GLP-1A2G的活性差异， 将上述制备得到的 GLP-1 与 GLP-1A2G样品用雄性昆明小鼠
进行生物学活性测定。 葡萄糖对照组按体重施予 18mmol/kg 的葡萄糖，GLP-1 与 GLP-1A2G样品组施予 1.5g/
kg 的葡萄糖和 12nmol/kg 的 GLP-1 与 GLP-1A2G待测样品，水对照组施予相同体积的生理盐水。 起始注射时
间记为 0min， 注射后 30min 和 60min 分别尾静脉取血测定
小鼠血糖（图 6）。
由图 6 可知， 在 30min 时生理盐水对照组的平均血糖
水平达到 13.4mmol/L，而 GLP-1 与 GLP-1A2G 样品组的平均
血糖水平分别为 8.3mmol/L 和 8.6mmol/L，而在 60min 时生
理盐水对照组的平均血糖水平达到 8.3mmol/L， 而 GLP-1
与 GLP-1A2G 样品组的平均血糖水平分别为 6.2mmol/L 和
6.1 mmol/L， 这充分证明了 GLP-1 与 GLP-1A2G 可以控制血
糖的的水平在一个比较稳定范围内 ， 也说明了 GLP-1 与 图 6 注射 GLP-1 与 GLP-1A2G 小鼠糖耐量实验
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GLP-1A2G 的生理活性基本上没有明显差异，这一结果与张志珍等 [8]报道的结果相一致，因此可以选则 GLP-
1A2G作为目标分子进一步与白蛋白融合。
3 讨论
以能够降糖作用的 GLP-1 为研究对象，分别将其和突变体在大肠杆菌 BL21 中得以表达，并运用 GST
亲和层析和分子筛 SephadexG-75 分离获得目标蛋白，纯度>90%。 在进一步的试验中证明，GLP-1 及其突变
体 GLP-1A2G在体内外生物活性无明显差异，由于突变体 GLP-1A2G 较 GLP-1 可以有效的抵制 DPPⅣ的降解，
因此突变体 GLP-1A2G较 GLP-1 更适合与白蛋白等大分子量蛋白融合表达，延长其体内的半衰期，这一结论
也在进一步的试验中得到验证，结果将在另一篇文章中详述。
参考文献
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窦文芳等：人胰高糖素样肽-1及其突变体在大肠杆菌 BL21中的表达与生物活性研究
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