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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
禾谷镰刀菌降解毒素基因 Tri101的克隆和序列分析
闫海霞1, 2 杨丽荣 2 薛保国 2 段立清 1 孙虎 2 全鑫 2
( 1内蒙古农业大学林学院,呼和浩特 010019; 2河南省农业科学院植物保护研究所,郑州 450002)
  摘  要:  禾谷镰刀菌 T ri101基因编码的单端孢酶烯 3
O
乙酰转移酶可通过加乙酰基的形式使禾谷镰刀菌产生的单族
毒素 (如 DON )转变为较低的毒性。本研究利用 RT
PCR技术从禾谷镰刀菌 0623中扩增并克隆了 T r i101基因的 cDNA片段,
测序结果表明, T r i101基因核苷酸序列阅读框架全长 1 356 bp( GenBank序列号: GQ907236), 编码 451个氨基酸的多肽, 推测
分子量为 4945 kD,等电点为 514。氨基酸序列同源性比对结果表明, 它与 K imura报道的禾谷镰刀菌 T r i101氨基酸序列同
源性最高, 为 99 56% ,与其它 13种镰刀菌的 T r i101氨基酸序列的同源性分别为 9791% - 75 68%。系统进化树分析结果表
明, Fusar ium g ram inearium 0623与 Fusarium sporo tr ichioides属于同一进化枝且与 Fusar ium asia ticum 有较近的亲缘关系, 而与 F.
oxy sporum、F. m oniliform e、F. nygam ai、F. nisikado i和 F. decem cellu lare的亲缘关系较远。
关键词:  禾谷镰刀菌 T r i101基因 基因克隆 序列分析
Clonging and Sequence Analysis of Tri101 Gene from
Fusarium gram inearum Schwabe
YanH a ix ia
1, 2  Yang L irong2  Xue Baoguo2  Duan L iqing1  Sun Hu2  Quan X in2
(
1
College of Forestry, InnerM ongo lia A gricultural University, H uhho t 010019;
2
P lant Protection Institute,
H enan A cademy of Agricultural Science, Zhengzhou 450002)
  Abstrac:t  Fusarium gram inearum T r i101 encodes a tr icho thecene 3
O
ace ty ltransfe rase tha t converts DON to a less tox ic acety

lated fo rm. The cDNA of T r i101 genew as am plied from theFusar ium gram inearum 0623 tota lRNA byRT
PCR. The results showed that
T ri101 was 1 356 bp in size and encoded 451 am ino ac ids ( GenBank accession num ber: GQ907236). Them olecu larwe ight and theoret

ical isoe lectric po int is 4945 kD and 5 14, respectively. The deduced am ino ac id o fFusar ium gram inearum 0623 T ri101 sha red
9956% hom o logy w ith the deduced am ino ac id pub lished by K im ura in GenBank. A lignm ents w ith the deduced am ino ac id of m ature
prote ins in o ther 13 species o fFusarium show ed 97 91% - 75 68% . Based on T r i101 am ino acid sequence the phy logenic tree of tr i

cho thecene 3
O
acety ltransferase gene was established. The resu lts show ed that Fg0623 andFusar ium sporotr ich ioides be long to the sam e
g roup of org an ism s, wh ich w as close ly re lated toFusarium asiaticum wh ile distantly re lated toF. oxy sp orum, F. m oniliform e, F. nygamai,
F. nisikado i and F. decem cellulare.
Key words:  Fusarium gram inearum T r i101 gene Gene c loning Sequence ana lys is
收稿日期: 2009
10
13
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30771439) ,农业部 948!项目 ( 2008
Z22 )
作者简介:闫海霞,女,在读博士研究生,研究方向:植物保护与分子生物学; E
m ai:l yanha ixia520@ sin a com
通讯作者:薛保国,男,研究员,博士,主要从事微生物分子生物学和植物病理学研究; E
m ai:l xuebbb@ gm ail com
禾谷镰刀菌 (Fusarium gram inearium Schw abe) ,
有性态为玉蜀黍赤霉 G ibberella zeae ( Schw. ) Petch,
是小麦赤霉病 (Fusarium head bligh,t FHB)的主要致
病菌。它能产生单端孢酶烯毒素 DON ( deoxyn i

va leno,l脱氧雪腐镰刀菌烯醇 )以及其它的具有毒性
的衍生物。DON毒素被认为是病菌重要的致病因
子 [ 1, 2] , 也是蛋白质合成的强烈抑制因子 [ 3] ,并且可
以诱导细胞凋亡 [ 4 ] , 当人、畜、禽误食后会引起中
毒, 导致发热、呕吐、腹泻、眩晕等症状, 严重危害人
畜健康。它不仅对动植物有毒性, 对产毒菌本身也
有毒性。因此,为避免受自产毒素的毒害,病菌必须
将毒素转化成无毒或低毒物质排出体外。而化学修
2010年第 1期 闫海霞等 :禾谷镰刀菌降解毒素基因 T ri101的克隆和序列分析
饰 DON是生物体自身主要的毒素转化机制,能提高
赤霉病抗性,减少 DON在谷物中的积累。研究表明
乙酰化可以降低毒性 [ 5]。禾谷镰刀菌 Tri101基因
编码单端孢酶烯 3
O
乙酰转移酶,可使 DON毒素的
C3位羟基乙酰化, 使其转化为一种毒性较低的物
质,从而降低其毒性。
本研究旨在克隆 Tri101基因, 分析该基因编码
的氨基酸序列,为进一步研究该基因的生物学功能
和植物基因工程奠定理论基础。
1 材料与方法
11 菌株来源
禾谷镰刀菌 0623( Fg0623)由河南省农业科学
院植保所植物病害研究室提供, 大肠杆菌 JM 109由
本实验室保存。
12 主要试剂
RNA iso
TM
Plus、Prim eScriptoTM 1st Strand cDNA
Synthesis K it、pMD19T
vector、T4 DNA 连接酶、rT aq
酶、限制性内切酶 BamH I、Xho I均购自 T aK aRa公
司;质粒小样快速抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒购自
U
gene公司; X
Gal、IPTG、氨苄青霉素 ( Ampr )等均
购自北京鼎国昌胜生物技术有限责任公司; 其它常
用试剂为国产分析纯。
13 总 RNA的提取
将新鲜 PDA斜面培养好的 Fg0623孢子接种于
液体培养基中, 150 r /m in, 28∀ , 振荡培养 48 h; 吸
取 1 mL培养好的菌液于 15 mL无菌 EP管中,
10 000 r /m in离心 10 m in; 收集菌体 [ 6] , 依据 RNA i

so
TM
Plus说明书上方法提取菌体总 RNA。
14 引物设计
根据 G enB ank中已经登陆的其他镰刀菌的
Tri101基因序列设计并合成引物。上游引物 Bp

Tri101
F: 5#
GGATCCATGGCTTTCAAGATACAGCT

3#,下划线部分为 BamH I酶切位点; 下游引物 Bp

Tri101
R: 5#
CTCGAGCTAACCAACGTACTGCGCAT

3#,下划线部分为 Xho ∃酶切位点。以上引物由上
海博尚生物技术有限公司合成。
15 RT
PCR扩增
RT1体系: RN ase Free dH 2O 65
L, dNTP
M ix
( 10mM ) 1
L, O ligo dT ( 50
M ) 2
L, To tal RNA
05
L于 PCR仪上 65∀ 反应 5 m in, 冰上急冷。
RT2体系: 上述变性、退火后的反应液 10
L, 5 %
Pr imeScript
TM
Bu ffer 4
L, RN ase Inhibitor( 40 U /
L)
05
L, Prim eScriptTM RTase ( 200 U /
L ) 1
L,
RN ase Free dH2O 45
L。反应程序: 30∀ 10 m in,
42∀ 60m in, 70∀ 15 m in, 后 4∀ 保持, 得到 cDNA。
PCR扩增体系 ( 25
L) : 25
L 10 % Buffer (M g2+
free), 25
L M gC l2 ( 25 mM ), 04
L dNTP
( 10mM ),上下游引物 ( 10
M )各 1
L, 02
L rTaq
聚合酶, 6
L模板 cDNA ( 10 ng /
L) , 114
L ddH2

O。扩增条件: 94∀ 3 m in; 94∀ 1 m in, 55∀ 1 m in,
72∀ 1m in, 30个循环, 72∀ 10m in; 10∀ 保持。
16 禾谷镰刀菌 Tri101基因的克隆及序列测定
PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳, 采用 U
gene
公司 DNA凝胶回收试剂盒回收 14 kb左右的目的
片段。将 PCR回收产物与 pMD19
T vector 16∀ 连
接过夜后,转化大肠杆菌 JM 109, 经蓝白斑筛选, 随
机挑选一白色菌斑过夜培养。参照 U
gene公司质
粒提取试剂盒方法提取质粒,用 BamH I、Xho I双酶
切鉴定重组克隆 pMD19
T /T ri101[ 7]。经酶切鉴定
成功的阳性克隆样品送 Sangon公司进行 DNA序列
测定。利用 DNAc lub软件并通过 NCB I网站的
BLAST功能对所测定序列进行比较分析。
2 结果与分析
21 Tri101基因序列分析
以 Fg0623总 RNA反转录后的 cDNA为模板扩
增的 RT
PCR产物,经琼脂糖凝胶电泳分析, 结果得
到 1 400 bp左右的特异性 PCR条带 (图 1)。将目
的片段与 pMD19
T载体连接,用氯化钙法转化大肠
杆菌 JM 109,在含有 Ampic ilin、X
Ga l、IPTG的 LB平
板上根据蓝白斑筛选阳性重组子, 然后用 BamH I
和 Xho I双酶切鉴定重组克隆, 酶切结果见图 2, 质
粒被切为约 27 kb的载体片段和 14 kb左右的插
入片段。酶切结果表明, 已得到插入目的片段的阳
性克隆。
Fg0623 Tri101基因序列测定结果表明, Fg0623
Tr i101基因含有一个完整的开放阅读框, 阅读框架
全长 1 356 bp。该基因已在 GenBank中登录, 登录
号为 GQ907236。它与 K imura[ 8]报道的禾谷镰刀菌
Tr i101基因核苷酸序列同源性最高, 为 9978%, 碱
基序列只在 444位由 A变异为 G,在 1173位由 T变
129
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 1期
异为 C, 从而引起 T ri101基因推导的氨基酸序列中
第 148位氨基酸由异亮氨酸 ( Ile)变异为缬氨酸
(V al),第 391位氨基酸由苯丙氨酸 ( Phe)变异为亮
氨酸 ( Leu), 虽然核苷酸序列的 830位也由 T变异
为 C,但该变化没有引起氨基酸的变化。该基因编
码 451个氨基酸残基,有其起始密码子 ATG和终止
密码子 TAG。图 3是 Tri101基因的核苷酸序列及
对应的氨基酸序列。
22 Tri101基因编码氨基酸序列分析
由 http: / /wwwexpasyo rg / too ls/# translate网站
提供的蛋白分析软件对 T ri101基因编码氨基酸序
列的基本特征进行分析,结果显示,该基因所预测的
蛋白质分子量为 4945 kD, 等电点为 514, 氨基酸
组成中带正电荷氨基酸 (A rg、Lys) 47个, 占 1042%,
带负电荷氨基酸 (Asp、G lu) 57个,占 1264%, 疏水性
氨基酸 217个,占 4812% ,亲水性氨基酸 184个,占
4080%,见表 1。该基因编码的蛋白为单端孢酶烯
3
O
乙酰转移酶, BLAST数据库分析结果表明,其属
于转移酶总科,如图 4。
图 3 禾谷镰刀菌 0623 Tr i101基因的
核苷酸序列及其推倒的氨基酸序列
图 4 Tri101蛋白质种类
130
2010年第 1期 闫海霞等 :禾谷镰刀菌降解毒素基因 T ri101的克隆和序列分析
表 1 Tr i101蛋白氨基酸含量
氨基酸组成成分 数量 百分比 (% ) 氨基酸组成成分 数量 百分比 (% )
丙氨酸 A la( A) * 39 86 亮氨酸 Leu( L ) * 40 89
精氨酸 A rg(R ) # 22 49 赖氨酸 Lys( K ) # 25 55
天冬酰胺 A sn( N) 15 33 蛋氨酸 M et(M ) * 16 35
天冬氨酸 A sp( D) # 33 73 苯丙氨酸 Phe( F) * 18 40
半胱氨酸 C ys(C ) 3 07 脯氨酸 Pro( P) * 33 73
谷氨酰胺 G ln (Q ) # 13 29 丝氨酸 S er( S ) # 34 75
谷氨酸 G lu ( E) # 24 53 苏氨酸 Thr(T ) # 29 64
甘氨酸 G ly( G) 32 71 色氨酸 Trp (W ) * 6 13
组氨酸 H is(H )# 4 09 酪氨酸 Tyr( Y) * 13 29
异亮氨酸 Ile( I)* 21 47 缬氨酸 Val(V ) * 31 69
总计 451
 注: * 疏水氨基酸, #亲水氨基酸
M otifScan软件分析该基因编码的蛋白位点和
序列模式表明,其编码蛋白可能含有 5个 N
糖基化
位点, 1个 cAMP和 cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位
点, 7个酪蛋白激酶 &磷酸化位点, 11个 N
端十四
烷基化位点, 5个蛋白激酶 C磷酸化位点, 1个酪氨
酸激酶磷酸化位点和 1个三角状五肽重复区, 其具
体位置如图 5所示。
1. N
糖基化位点 ( ASN _GLYCOSYLATION ); 2. cAMP和 cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点 ( CAMP_PHOSPHO_S ITE) ;
3.酪蛋白激酶&磷酸化位点 ( CK2_PHOSPHO_SITE ) ; 4. N
端十四烷基化位点 (MYRISTYL) ; 5.蛋白激酶 C磷酸化
位点 ( PKC _PHOSPHO _SITE ) ; 6.酪氨酸激酶磷酸化位点 ( TYR _PHOSPHO _S ITE ) ; 7.三角状五肽重复区 ( PPR)
图 5 Tri101编码蛋白模式位置
运用 SOPMA 软件 ( http: / /www expasyorg /
too ls/# translate)预测禾谷镰刀菌 T ri101蛋白的二级
结构 (图略 ) , 表明该蛋白含约 3814%的 
螺旋,
266%的
折叠, 1330%的延伸链, 4590%的不
规则卷曲。该基因编码的蛋白主要由 
螺旋和不
规则卷曲构成,而
折叠和延伸链则散布于整个蛋
白质中。在 SW ISS
MODEL数据库中进行蛋白质三
维结构分析,得到该蛋白的三维结构图 (图 6)。
23 T ri101同源性和分子进化分析
利用网站 ( http: / /wwweb.i ac. uk /Tools /clust

alw2 / index. htm l)和 Genedoc软件,将 Fg0623 Tri101
基因推导的氨基酸序列进行同源比对, 结果表明
(图 7) ,它与 K imura报道的禾谷镰刀菌 T ri101氨基
建模残基范围为 21~ 451;模板为 3b2 sA ( 192
);
序列同源性为 98667% ; E值为 000e
1
图 6 禾谷镰刀菌 Tri101蛋白三级构同源建模
酸序列 [ 8]同源性为 9956%。与其它 13种镰刀菌的
Tri101氨基酸序列的同源性分别为 9791% - 7568%,
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 1期132
2010年第 1期 闫海霞等 :禾谷镰刀菌降解毒素基因 T ri101的克隆和序列分析
其中氨基酸同源性最低的是 Fusarium sporotrichioides,
最高的是 Fusarium asiaticum。利用 MEGA31软件对
编码单端孢酶烯 3
O
乙酰转移酶的 Tri101、T ri201和
TAT基因的氨基酸序列建立的系统进化树 (图 8)表
明, Fusarium gram inearium 0623与 Fusarium sporotri

chioides属于同一进化枝且与 Fusarium asiaticum有较
近的亲缘关系, 而与 F. oxysp orum、F. moniliform e、F.
nygamai、F. nisikadoi和 F. decemcellulare的亲缘关系
较远。
图 8 FgTri101基因推导的氨基酸序列与其他编码单端孢酶烯
3
O
乙酰转移酶基因的氨基酸序列的进化树比较
3 讨论
赤霉病 (Fusarium head bligh,t FHB)主要由禾谷
镰刀菌 (Fusarium gram inearum Schw abe)引起, 是谷
类作物的一种破坏性病害,可导致大量田间减产和毒
素污染。单族毒素是镰刀菌的次生代谢产物,是禾谷
镰刀菌的致病因子,对人和牲畜有强烈的毒害作用。
为了自我保护,产生单端孢酶烯的镰刀菌有 Tri101基
因,编码单端孢酶烯 3
O
乙酰转移酶,该酶能将单族
毒素转化成乙酰化的低毒性的化合物,从而避免自身
的中毒反应 [ 9]。K imura等 [ 10]从产生单端孢酶烯的
Fusarium gram inearum F15上分离到一个 3 kb的 Xho
I
Xba I片段, 并证明是编码单端孢酶烯 3
O
乙酰转
移酶的结构基因 Tri101。他通过分析包含 T ri101的
黏性质粒,发现该抗性基因不在已报道的合成基因簇
内,而是位于与单端孢酶烯生物合成无关的 UTP
am

mon ia连接酶基因 ( ura7)和磷酸透酶基因 ( pho5)之
间, 并证明了该基因对真菌的生长和发育有关键作
用,但对单端孢酶烯的生物合成却无作用 [ 9]。
然而,编码单端孢酶烯 3
O
乙酰转移酶的基因并
非只有 T ri101一个。K imura等从 3个不产生单端孢
酶烯的镰刀菌,包括尖孢镰刀菌 (F. oxy sporum )、串珠
镰刀菌 (F. moniliform e)和镰刀菌 IFO 7772上克隆并
测序了 pho5到 ura7基因片段,这些序列的 BLAST分
析显示出预测多肽部分与 Tri101多肽有很高的相似
性。但是 FspT ri101基因 ( Fusarium species Tri101)
编码一个功能 3
O
乙酰转移酶,而 FoTri101(F. oxys

porum Tri101)和 FmT ri101( F. moniliform e T ri101)是
假基因。令人惊奇的是尽管 FoTri101和 FmTri101是
没有功能的假基因,但却有单端孢酶烯 3
O
乙酰转移
酶活性,能给单端孢酶烯的 C
3位加乙酰基, 这就说
明这些不产毒素的镰刀菌有另外一种当时还未确定
的 3
O
乙酰转移酶基因。之后 K imura等又从 F. ox

ysp orum和 F. moniliform e上分别克隆了 FoT ri201和
FmTri201基因, 这两个 Tri201基因的核苷酸序列与
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 1期
FgTri101和 F spTri101的核苷酸序列的相似性不高,
但有单端孢酶烯 3
O
乙酰转移酶活性 [ 11]。说明乙酰
转移酶基因在 F. oxysporum 和 F. moniliform e的进化
历史中经历了基因复制 (产生的 T ri201基因 )和基因
失活 (没有活性的 T ri101基因 )。
除了有性态的赤霉菌, Tokai等 [ 12]从有性态 Al

bonectria和 N eocosmospora的 F. decemcellulare和 F.
so lani中分别扩增了单端孢酶烯 3
O
乙酰转移酶基
因 TAT。在这些系统发育远缘的镰刀菌中发现有功
能的 TAT基因,增加了单端孢酶烯 3
O
乙酰转移酶
基因只是一个抗生素抗性基因,并通过不同的进化
历史从其他的单端孢酶烯生物合成基因进化而来的
可能性。根据已报导的序列, 运用 Primer 50软件
在同源区设计并合成引物,利用 PCR技术从国内一
野生型 Fusarium gram inearum 0623中扩增了 Tri101
基因的全长 DNA,它编码的氨基酸序列与不产毒镰
刀菌的 Tri201和 TAT基因编码的氨基酸序列相似
性为 61% - 63%。根据 Tri10基因在不产单端孢酶
烯的镰刀菌中的存在, 可以推测该基因在镰刀菌从
不产毒到产毒的系统进化之前就已经存在于真菌基
因组中,也就是说不产毒的赤霉菌曾经可能是产毒
菌株, 现存的不产毒菌株可能是由单端孢酶烯基因
的积累突变而逐渐形成的。
单端孢酶烯族毒素是一类结构多样性的倍半萜
烯环氧化物,含有一个 12, 13
环氧单端孢酶烯结构,
但因侧链取代的不同而不同。根据在 C8位置上的
取代作用,定义了 2种类型的毒素, A型和 B型 [ 13 ]。
A型携带一条非酮侧链或根本不携带侧链, B型该
位置是一个酮功能团。T
2毒素是一类 A型单端孢
酶烯, 在 C8位上有一个与酯连接的异戊酰基团,而
DON是 B型单端孢酶烯,在 C8位上有一个酮基团。
因此,本研究得出的进化树分析中产生 DON毒素的
Fusarium gram inearium 0623和产生 T
2毒素的 Fu

sarium sporotrichio ides属于同一进化枝, 而与不产毒
的 F. oxy sporum、F. moniliform e和 F. decem cellu lare等
的亲缘关系较远。
目前,国外对 T ri101基因的结构、功能以及在酵
母 [ 14]、烟草 [ 15]、小麦 [ 16]和大麦 [ 17]中的成功表达已多
有报道 [ 18]。本研究中禾谷镰刀菌 Fg0623 Tri101基因
的成功克隆对研究该基因在麦类作物上的表达能否
降低赤霉病的发病率,提高作物产量, 同时降低真菌
毒素水平奠定基础。虽有报道 Tri101基因可在几种
作物中成功表达,但至今还没有将该基因转入玉米的
报道,因此,今后对 Tri101基因的研究热点可能会集
中在该基因在玉米中的表达和毒理分析。
参 考 文 献
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2010年第 1期 闫海霞等 :禾谷镰刀菌降解毒素基因 T ri101的克隆和序列分析
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科学出版社新书

单分子技术实验指南
(生命科学实验指南系列 )
[美 ] P. R.塞尔文  [韩 ]河泽集主编  罗建红主译
978
7
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2
98. 00 2009年 11月出版
内容简介:生命过程的单分子研究是一个新兴的研究领域,常常清晰并令人惊奇地揭示出生物大分子的精细
工作。本书在世界范围内首次较全面地介绍了单分子研究技术,主要涉及两大类技术,一是荧光成像和光谱
学技术,二是基于力学的操作和检测。全书共分 21章。第 1章对单分子技术的发展做了回顾和展望,其余
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语言清晰易懂,具有很强的实用性。
本书不仅对单分子生物学领域的专家具有重要的参考价值,更重要的是对那些想要在单分子领域做些
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