全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告·
收稿日期:2007-07-23
基金项目:国家“973”项目(2006CB100202)和教育部科学研究重大项目(307025)资助
作者简介:于钦亮(1981-),男,山东昌邑人,硕士研究生,研究方向:分子植物病理研究
通讯作者:李成云(1964-),男,云南祥云人,博士生导师,教授,E-mail:li.chengyun@gmail.com,Tel:0871-5227552
禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchw),有性态为玉黍蜀赤霉(GibberetlazeaePetch),是一类分布广
泛的土壤习居菌,由该菌引起的小麦赤霉病和玉米茎基腐病、穗腐病分布广泛,给农业生产带来了严重
的危害。在致病的过程中禾谷镰刀菌产生真菌毒素——赤霉素。同时该病原菌在活体外能产生多聚半乳
糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)和果胶甲基反式消
禾谷镰刀菌基因组中含寄主靶向模体分泌蛋白功能的初步分析
于钦亮 马莉 刘林 杨静 苏源 王云月 朱有勇 李成云
(云南农业大学教育部生物多样性与病虫害控制重点实验室,昆明 650201)
摘 要: 基于生物信息学的方法,以SignalPv3.0、TargetPv1.01、Big-PIPredictor和TMHMM v2.0四个分析软件
对禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchw.)全基因组的 11640个蛋白编码基因的 N-端氨基酸序列进行信号肽分析,
预测出606个潜在的分泌蛋白编码基因。通过对这些潜在的分泌蛋白进行MEME软件分析,发现其中有157个分泌蛋白
的剪切点下游120氨基酸残基范围内具有一个保守的RXLX模体,其中有79个分泌蛋白具有可预测的功能性描述,包
括FG00023.1具有与草酸盐氧化酶1有关的功能,FG01588.1具有与1,4-α-葡糖苷酶葡聚糖有关的功能,这些基因可作
为禾谷镰刀菌致病相关的候选基因。其中FG04097.1编码的具有与丝氨酸型蛋白酶有关的功能在致病疫霉和疟原虫真
核寄生物中具有相似保守的寄主靶标模体的效应蛋白中也观察到,但FG09127.1,FG05287.1编码的蛋白尚未被证明参与
致病过程的研究报道。深入研究分泌蛋白将有助于明确植物与病原微生物互作的分子机制。利用禾谷镰刀菌基因组学研
究成果,结合计算机技术和生物信息学的方法,分析其分泌蛋白组学,将有助于全面掌握其致病因子的结构与功能。对于
这些蛋白功能的比较研究,将有利于对禾谷镰刀菌致病性的分子机制的探索,并为设计新的防治措施提供理论依据。
关键词: 禾谷镰刀菌 分泌蛋白 生物信息学 寄主靶向模体
PrimaryAnalysisofHost-Targeting-motifHarboredSecreted
ProteinsinGenomeofFusariumgraminearum
YuQinliang MaLiLiuLin YangJing SuYuan WangYunyue ZhuYouyong LiChengyun
(TheMinistryofEducationKeyLaboratoryforAgriculturalBiodiversityForPestManagement,YunnanAgricultural
University,Kunming650201)
Abstract: TheInternet-basedsoftwaresuchastheSignalPv3.0,TargetPv1.01,big-PIpredictorandTMHMM v2.0
werecombinedtopredicttheN-terminal-signal-peptide-dependentsecretoryproteinsamongthe11640ORFsin
genomeofplantpathogenicfungus,Fusarium graminearum.Theresultsshowedthat606ORFswerethepotential
secretoryproteinsaccordingtooursetoffourpredictionalgorithms.Toanalysisthepotentialproteinsinvolvedin
virulenceofthefungus,MEMEwasusedtoscreenalORFsofsecretoryproteins.Amongthese,157RXLX motif-
containingproteinswerefoundfrom 100residuesafterN-terminalsignalpeptidecleavagesiteand79proteinshavean
asignedfunctionbyhomologybasedonPEDANTdatabase.Amongthese,FG01588.1andFG04097.1,encodingglucan1,
4-alpha-glucosidaseandPRC1-carboxypeptidasey,serine-typeprotease,respectively,wasfoundinRXLX-motifcontaining
proteininPhytophthoraandPlasmodium aswel.Manyofthetheseproteinsareproteaseorlipase,probablyasociate
withpathogenicity,buttheevidenceoftheseproteinsandpathogenicityorvirulencethefungusremaintobeclarified
Keywords: Fusariumgraminearum Secretedprotein Bioinformation Host-targeting-motif
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除酶(PMTE)等细胞壁降解酶,是 F.gramimearum致病的一个重要因子。对禾谷镰刀菌的致病性具有重要作
用[1]。
分泌蛋白是蛋白组的一个重要组成部分,指穿过合成所在的细胞到其它组织细胞去的蛋白质,通常由
信号肽引导穿过细胞膜被运输到达胞外,信号肽位于分泌蛋白的 N端,对于分泌蛋白的分泌起主导作用。
信号肽的基本功能是通过疏水作用和静电引力与质膜相互作用,对含有信号肽序列的前体蛋白的胞外转
运发挥作用。在分泌蛋白中有许多是细胞分泌到胞外的酶类,它们对于微生物与周围环境的物质、能量和
信息交换具有重要的意义[2]。
目前,禾谷镰刀菌基因组测序已经完成(htp:/www.broad.mit.edu/annotation/genome/fusarium_graminearu
m/Home.html)。通过对禾谷镰刀菌全基因组数据的生物信息学分析和研究,为进一步了解禾谷镰刀菌中潜
在的分泌蛋白所具有的结构及功能提供了可能。
近年来,病原菌的分泌蛋白在病原与寄主互作中的功能研究越来越受到重视,已有研究表明病原菌的
分泌蛋白在与寄主抗性基因蛋白的互作中起着关键作用。Bhatacharjee等通过对疟原虫(Plasmodium
falciparum)输出蛋白转运信号的检测中,识别出了不同的蛋白以 5个氨基酸为核心的 RXLXE/D/Q的 11个
氨基酸的模体,该模体是 Plasmodiumfalciparum输出蛋白到寄主红细胞所必需的。这个 RXLXE/D/Q模体的
作用是在蛋白输出中靶标寄主与重塑寄主模式时所需的一个输出信号,目前已在约 400多个 Plasmodium
falciparum蛋白中检测到,是重要的致病性输出途径[3~6]。另外通过对来自于 Hyaloperonosporaparasitica的
ATR1NdWsB,Phytophthorainfestans的 AVR3a,Phytophthorasojae的 Avr1b-1这 3个基因编码的氨基酸序列
的比对,在预测的 N端信号肽的下游的 32个氨基酸内存在一个保守的模体,这个模体的序列构成是
RXLR-x5-21-ddEER,是以 RXLR残基为中心[7]。通过生物信息学分析表明,RXLR模体普遍存在于卵菌的
10个已知的无毒蛋白及 59个 Phytophthorainfestans,176个 Phytophthorasojae,147个 Phytophthoraramorum
具有信号肽的分泌蛋白中,说明在这些蛋白中 RXLR具有保守性,暗示了在卵菌中 RXLR在功能上可能具
有重要性[8]。从而研究者 AnneP.Rehmany提出假说:RXLR模体的功能是作为介导致病蛋白在寄主细胞内
运输所需一个信号,在真核寄生物的许多致病蛋白中,具有一定的保守性[9]。
采用 SignalPv3.0,TMHMMv2.0,big-PIPredictor及 TargetPv1.01这 4种程序对禾谷镰刀菌基因组中的
分泌蛋白进行分析,预测出 606个潜在的分泌蛋白编码基因。通过对这些潜在的分泌蛋白进行 MEME软
件分析,发现其中有 157个分泌蛋白的剪切点下游 120氨基酸残基范围内具有一个保守的 RXLX模体,进
一步证实了这种模体在真核病原菌的致病性上的保守性,同时将有助于对禾谷镰刀菌分泌蛋白的功能机
制更深入的理解,也为探索植物病原真菌分泌蛋白的 N端信号肽的功能提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 基因组序列及推测蛋白的氨基酸组成序列
研究所用的材料来自于 htp:/www.broad.mit.edu/fusarium_graminearum_1_proteins.fasta.gz-GZIP。网站已
经公布的禾谷镰刀菌基因组 11640个蛋白质氨基酸序列,利用 SignalPV3.0(htp:/genome.cbs.dtu.dk/
services/SignalP3.0)软件[10]l.5对该物种氨基酸序列是否具有信号肽进行分析;TMHMMv2.0(htp:/genome.
cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0)软件 [11]用于是否具有跨膜结构进行分析;big.PIPredictor(htp:/mende1.
imp.univie.ac.at/gpi/gpi-server)软件[12,13]用于鉴定蛋白质的 GPI锚定位点;最后采用 TargetPv1.01(htp:/
www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)软件[14]预测目的蛋白在亚细胞器中的分布和定位,进一步确定该信号序列
是否为穿膜信号肽。同时满足含有信号肽、分泌到胞外而不是胞内其它细胞器、非锚定蛋白和不含有跨膜
螺旋结构条件的蛋白序列被预测为由信号肽引导的分泌蛋白[15]。
1.2 分泌蛋白的 motif分析
通过 MEME软件对预测得到的分泌蛋白进行分析,预测在这些蛋白中是否存在 RXLX模体[16],并把
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通过 MEME软件分析获得的具有该模体的分泌蛋白用 LOGO作图[17],检测这个模体及两翼序列的保守性。
1.3 对分泌蛋白进行功能分析
通过对具有 RXLX模体的禾谷镰刀菌分泌蛋白的序列与 PEDNAT数据库中禾谷镰刀菌蛋白功能预测
的数据库进行比对,获得对具有 RXLX模体的禾谷镰刀菌分泌蛋白功能的描述。
2 结果与分析
2.1 禾谷镰刀菌全基因组分析分泌蛋白
分别用 4种不同的分析软件对禾谷镰刀菌基因组所有编码蛋白的基因进行了分析,结果表明,由
SignalP软件分析含有信号肽的分泌蛋白有 1428个,由 TargetPv1.01分析,含胞外分泌信号,无线粒体分
泌信号的分泌蛋白为 1843个;由 Big-PIPredictor分析无 GPI锚定修饰的为分泌蛋白,其数量为 1814个;
而由 TMHMM软件分析不含跨膜结构的蛋白为 9402个。同时满足这 4个分析软件的蛋白为分泌蛋白,数
量为 606个。
分别用 4种不同的分析软件对禾谷镰刀菌基因组所有编码蛋白的基因进行了分析,结果表明,由
SignalP软件分析含有信号肽的蛋白有 1242个,由 TargetPv1.01对 1242个含有信号肽的蛋白分析,含胞
外分泌信号的蛋白为 846个;而由 TMHMM软件对 846个蛋白分析不含跨膜结构的蛋白为 649个,由 Big-
PIPredictor对 649个蛋白分析无 GPI锚定修饰的蛋白数量为 606个。同时满足这四个分析软件的蛋白为
分泌蛋白,数量为 606个。
表 1 禾谷镰刀菌分泌蛋白 N端信号肽剪切点下游 120个氨基酸残基内的 RXLX模体及其两翼序列
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2.2 RXLX模体的识别
利用 MEME软件对 606个具有信号肽的禾谷镰刀菌分泌蛋白进行分析,发现在 157个分泌蛋白 N端
信号肽剪切点下游 120个氨基酸内存在一个由四个碱基组成的 RXLX模体,说明具有这种模体的分泌蛋
白在禾谷镰刀菌中存在一定的量,而此前有关该模体的报道仅为疟原虫毒性蛋白转运进入寄主红细胞并
重建寄主防御模式的寄主靶标 RXLXE/D/Q模体以及与在疫霉属的分泌蛋白中存在的调节蛋白输送到植
物细胞质的 RXLR模体。从表 1可以看出,该模体在不同蛋白中的位置主要位于 N端信号肽下游 33~113
aa的范围内,但位置并无保守性,表 1列出了 RXLX模体两翼序列的部分氨基酸比对结果。
2.3 RXLX模体的保守性分析
利用 WEBLOGO软件对具 RXLX模体的禾谷镰刀菌分泌蛋白序列进行分析的结果表明:模体的两翼
序列是高度趋异的,在此范围内没有任何保守的氨基酸残基出现。
2.4 具 RXLX模体的禾谷镰刀菌分泌蛋白的
功能
对具有 RXLX模体的禾谷镰刀菌分泌蛋白
序列与 PEDANT数据库进行比对,获得具该模
体分泌蛋白的功能描述,其中在 157个具有
RXLXmotif的分泌蛋白中,有 79个具有可预测
的功能性描述。这些功能描述中大多是与代谢,
蛋白折叠,修饰和去向有关,一些蛋白则与能
量,细胞循环和处理有关。可见具有该模体的蛋
白可在不同的生理活动中发挥作用。表 2列出
了数据库中具有 RXLX模体的分泌蛋白的功能
描述。
图 1 根据 157个禾谷镰刀菌分泌蛋白 RXLX模体
两翼序列绘制的 LOGO图
表 2 禾谷镰刀菌基因组中具 RXLX模体的分泌蛋白功能描述
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3 讨论
禾谷镰刀菌是一种分布广泛,对玉米、小麦等重要粮食作物危害严重的植物病原真菌,尽管对该菌的
致病专化性、生理小种分布以及抗病性研究都已经有不少的报道,但在分子层面对其侵染、致病机制还所
知甚少,仅有 tri5和 gpmk2等少数致病性基因报道[18]。利用较为可靠的生物信息学软件,结合有关植物病
原真菌、病原卵菌致病机制的研究进展,分析基因组中可能的致病相关基因,可为了解基因组的特点及开
展试验研究提供许多有用的信息。
在已经报道的植物病原真菌的致病蛋白中,有不少是分泌蛋白。因此,通过可靠的计算机软件从基因
组规模进行分泌蛋白的分析,可为致病蛋白的试验分析提供初步的信息。尤其是近来发现在卵菌
Phytophthora和疟原虫(Plasmodiumfalciparum)的致病蛋白中保守模体 RXLX的发现,则能够更好的分析基
因组中潜在的致病蛋白。通过利用生物信息学相关软件对已公布的禾谷镰刀菌全基因组进行分析预测到
分泌蛋白为 606个,编码这些分泌蛋白的基因在基因组中编码蛋白质基因总数的约 5.4%。通过进一步的
分析表明,在禾谷镰刀菌基因组中存在着 157个具有 RXLX模体的分泌蛋白,由于该模体在疟原虫和致病
疫霉的致病相关蛋白中较为保守。因此,禾谷镰刀菌基因组中具有该模体的蛋白也可能与致病性有关。但
毕竟镰刀菌与疟原虫、卵菌在侵染结构、侵染机制、致病过程和寄主范围都有许多差异,具有该模体的蛋
白,在镰刀菌及其寄主的互作中,是否同样具有同样的功能;或是镰刀菌是否在与寄主的协同进化过程中,
产生了新的寄主靶向模体;在不同寄主细胞内,是否有着共同的靶标,或是靶标分子中有共同的模体;都还
需要试验来进行分析和验证。
参考 文献
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2 GreenbaumD,LicholasNM,JansenR,eta1.GenomeResearch,2001,11:1463~1468. (下转第180页)
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(上接第165页)
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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2.4 ELISA鉴定
采用间接竞争 ELISA方法鉴定,结果表明,采用混合酸酐法合成的全抗原抑制明显,说明全抗原的合
成是成功的;采用重氮化法合成的抗原,无明显抑制。结果见表 2。
由紫外计算偶联率和 ELISA鉴定的结果综合分析可以看出,重氮化法合成的全抗原,经紫外鉴定偶联
率较高,但是在 ELISA鉴定中抑制并不明显,说明紫外鉴定的方法只能大概反映抗原合成的情况,不能作
为抗原合成的惟一鉴定方法。
该研究表明,以混合酸酐法合成的氯霉素全抗原成功率高,方法切实可行,并且优于重氮化法。所得抗
原已经免疫兔子制备多克隆抗体,其他研究在进一步进行当中。
参考 文献
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表 2 ELISA鉴定结果
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