全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
基于 23S/5S rDNA序列的柑橘黄龙病
病原菌亚洲种系统发育研究
廖惠红 1, 2 白先进 3 李杨瑞 1, 3 陈传武4 杨丽涛 1 朱建华 2 徐宁 2
( 1广西大学农学院,南宁 530004; 2广西农业科学院园艺研究所,南宁 530007; 3广西农业科学院,南宁 530007; 4广西柑橘研究所,桂林 541004)
摘 要: 根据柑橘黄龙病亚洲种 23S /5S的 DNA序列设计一对引物对不同地理来源的 6个柑橘黄龙病样品 DNA进行
扩增, 扩增片段大小均为 1 654 bp包括一个假定细胞壁水解酶假基因 ( putative cell wa ll hydro lase pseudogene)和 5S rRNA基
因。序列同源性分析结果表明 ; 6个柑橘黄龙病病原菌样品与柑橘黄龙病病原菌亚洲种 S ihu i样品的同源性为 99% ,然而与土
壤杆菌, 布鲁氏菌,根瘤菌, 中华根瘤菌,巴通体菌和中慢生根瘤菌的同源性只有 89% ~ 95% , 说明在 23S /5S rDNA序列上黄
龙病病原菌亚洲种与 变形菌纲根瘤菌目的其他病原菌相差较大。对黄龙病病原菌亚洲种种内的 23S /5S rDNA序列进行比
较分析, 结果发现黄龙病病原菌亚洲种种内之间 putative ce llw all hydro lase pseudogene和 5S rRNA的基因序列非常保守, 但不
同地理来源的柑橘黄龙病样品碱基序列间确实存在差异, 差异的大小与地理的远近无关。利用简约法对黄龙病病原菌亚洲
种及 变形菌纲其它病原菌的 23S /5S rDNA序列构建的系统发育树显示黄龙病病原菌亚洲种单独聚为一类, 其他细菌聚为
另一类, 该结果与基于 rp lJ基因及 16S rRNA基因的 DNA序列构建的分子系统进化树结果一致。
关键词: 柑橘 黄龙病 亚洲种 23S /5S rDNA
Phylogenetic Analysis ofCandidatus Liberibacter A siaticus of C itrus
Huanglongbing Based on 23S/5S rDNA Sequence
L iaoH uihong
1, 2 Ba iX ianjin3 L iYangrui1, 3 Chen Chuanwu4 Yang L itao1 Zhu J ianhua2 Xu N ing2
(
1
Agr icultural College, Guangx i University, N anning 530004;
2
HorticultureR esearch Institute, Guangx iA cademy of Agricultural Sciences,
N anning 530007;
3
Guangxi A cademy of Agricultural Sciences, N anning 530007;
4
Guangx i Citrus Research Institute, Guilin 541004 )
Abstrac:t A pa ir o f pr im ers based on the 23S /5S rDNA sequences w as designed to amp lify s ix Cand idatus L iberibacte r asiaticus
stra ins co llected from d iffe rent geographica l reg ions in Ch ina The amp licon size is 1 654 bp including putative ce llw a ll hydro lase pseu
dogene and 5S rRNA gene BLAST analysis demonstrated that these strains sha red 99% of sequence identity w ith the Ca L asiaticus
sihu i stra in, but on ly 89% ~ 95% of sequence identityw ith Agrobacterium, Brucella, Rhizobium, S inorh izob ium, B ar tonella andM eso
rh izob ium Sequence compar isons w ere also conducted am ong Ca L asiaticus in 23S /5S rDNA sequence reg ion The resu lt show ed
tha t putative cellw a ll hydro lase pseudogene and 5S rRNA gene sequences in 23S /5S rDNA reg ion w ere conserv ed except a few of nu
cleo tide variations among them ultiple stra ins ofCa L asia ticus from different geog raph ica l reg ions A phy logenetic tree constructed
forCa L asia ticus strains and o the rproteobacterias based on the 23S /5S rDNA sequence showed that a llCa L asiaticus stra ins
w ere clustered togethe r, and separated w ith o ther proteobac terias
Key words: C itrus Huang longb ing Candida tusL as iaticus 23S /5S rDNA
收稿日期: 20081215
基金项目:广西壮族自治区人才小高地项目桂发办 [ 2004 ] 47号
作者简介:廖惠红 ( 1976) ,女,助理研究员,博士研究生,主要从事果树生物技术研究; Em ai:l liaohu ihong2001@ gm ail com
通讯作者:李杨瑞,教授, Te:l 07713247689, Em ai:l liyr@ gxaasnet
柑橘黄龙病 (Huang longbing, HLB)是柑橘上的一
种毁灭性病害,感病的柑橘品种得病后可在 3~ 5年内
丧失结果能力,甚至枯死, 对柑橘生产造成极大危害。
该病主要分布在东南亚,南亚和非洲东南部,阿拉伯半
岛,毛里求斯,留尼汪岛和马达加斯加 [ 1, 2]。在我国该
病主要分布于广东、广西、福建、湖南、江西、浙江、云南、
2009年第 5期 廖惠红等:基于 23S/5S rDNA序列的柑橘黄龙病病原菌亚洲种系统发育研究
贵州、四川、海南和台湾。近年来, 在巴西及美国佛罗
里达洲也发现了黄龙病 [ 3, 4]。目前认为该病害是由不
能在人工培养基上生长,寄生在韧皮部筛管的 变形
菌纲革兰氏阴性细菌所引起 [ 5, 6] ,可通过柑橘木虱传
播 [ 7, 8]。根据 16S rRNA基因及 16S/23S rRNA基因区
间的 DNA序列, 该病原菌可分为 3个种, 亚洲种
(CaLasiaticus)、非洲种 (CaLafricanus) [ 6]和美洲种
(CaLamericanus) [ 4]。
Jagoue ix等 [ 6]利用 PCR方法首次获得了柑橘黄
龙病病原菌亚洲种和非洲种的 16S rDNA序列,并用
同样的方法于 1997年 [ 9]在该位点上将亚洲种和非洲
种的 DNA序列延伸到 16S /23S基因区间。L in等 [ 10]
利用基因组步行的方法在 16S /23S位点上将亚洲种
的 DNA序列进一步延伸, 获得了柑橘黄龙病亚洲种
23S rRNA基因的部分序列。最近,用基因组步行的
方法将黄龙病病原菌亚洲种的 23S rRNA基因的序列
延伸至全长并获得了 23S /5S rRNA基因区间的序列
及 5S rRNA基因的全长 (序列号: EU523376) [ 11] , 但
对于柑橘黄龙病病原菌亚洲种的 23S /5S区域的 DNA
序列在不同地理来源的样品间是否有差异, 其系统进
化关系如何,尚未得知。本研究测定和分析不同地理
来源的柑橘黄龙病病原菌亚洲种 23S /5S rDNA的序
列并与其他病原菌相应的 DNA序列进行比较分析,
构建分子系统进化树,探讨黄龙病病原菌亚洲种及其
近缘种之间的系统发育关系。
1 材料和方法
11 试验材料
柑橘黄龙病感病材料分别来源于我国的广西、
福建、湖南、台湾和美国佛罗里达州, 健康材料来源
于美国农业部加州帕利尔市 ( Parlier) ,见表 1。
表 1 用于黄龙病病原菌 23S /5S rDNA分析的
来自不同地区的黄龙病材料
样品名称 样品来源 样品特征
GX1 中国广西桂林 感病
GX69 中国广西南宁 感病
FJ11 中国福建 感病
HN46 中国湖南 感病
T3 中国台湾 感病
FL21 美国佛罗里达州 感病
CA17 美国加州 健康
CA113 美国加州 健康
CA119 美国加州 健康
12 试验方法
121 植物总 DNA的提取 柑橘叶脉总 DNA的
提取采用 CTAB法 [ 10]。
122 PCR扩增 PCR反应体系: 20 l反应体系中
含有终浓度 1 PCR Buffer, 20mM M gOA c, 05 M
的引物, 02mM dNTPs, 2 l模板 DNA, 05 U Taq
DNA polymerase ( ABI, Foster c ity, CA)。
PCR反应程序: 94 1m in, 94 30 s, 58 45 s,
72 15 m in, 35个循环,最后 72 延伸 7m in。
123 PCR产物的克隆和测序 从琼脂糖胶上回收
PCR扩增产物片段,产物经基因净化试剂盒 ( GENE
CLEAN
Turbo KIT)纯化后,连接到载体上 ( pGEM
T Easy Vector, Promega, M adison, W I, USA )。将连
接上 PCR产物的载体转入细菌 JM 109,挑选白色克隆
进行培养并用试剂盒 ( Q IAprep 96 w ell ki,t Q iagen,
Valencia, CA )提取质粒 DNA用于测序反应。测序在
AB I 3100 DNA ana lyzer测序仪上进行。
124 DNA序列数据处理 序列同源性比较分析采
用 NCB IBLAST。多重比对分析采用 Multalin分析软
件 [ 12]。分子系统发育树构建采用 Tamura等 [ 13]系统
发育分析软件 MEGA40。
2 结果
21 23S /5S rDNA序列的扩增及测序
利用基因组步行的方法已获得柑橘黄龙病病原
菌亚洲种 23S /5S rRNA基因的 DNA序列 [ 11] ,依据该
区域的序列在 23S rRNA基因末端上游区约 797 bp
处设计了一个前置引物 ( 5CGTAGCTGATGGGAAC
CA3),在 5S rRNA基因末端 74 bp处设计了一个后
置引物 ( 5CCTTCAGGTTATGAGCC3), 分别对来源
于广西、福建、湖南、台湾、佛罗里达州的 6个柑橘黄
龙病 DNA样品 ( GX1、GX69、FJ11、HN46、T3和 FL2
1)及来源于美国农业部加州帕利尔市的 3个柑橘健
康样品 DNA ( CA17、CA113和 CA119)进行扩增,感
病样品均获得了与预期目标片段 1 650 bp相近的条
带;健康样品没有获得扩增,表明所设计的引物专一
性强,扩增的确实是柑橘黄龙病病原菌亚洲种 23S /
5S rDNA的序列。对 6个柑橘黄龙病感病样品的
PCR扩增产物进行回收测序, 6个样品的核苷酸序列
长度均为 1 654 bp包括 23S rRNA基因的部分序列及
一个假定细胞壁水解酶假基因 ( putat ive ce ll w all
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
hydrolase pseudogene)全长和 5S rRNA基因的全长。
22 核苷酸序列比较分析
221 序列同源性比较分析 来源于广西、福建、湖
南、我国台湾和佛罗里达州的 6个柑橘黄龙病病原菌
样品 23S /5S rDNA序列与来源于 NCB I数据库的柑
橘黄龙病病原菌亚洲种 S ihu i样品相应的 DNA序列
的同源性为 99%,与土壤杆菌 (Agrobacterium )的同源
性为 91%~ 95% ,多数为 95%,与布鲁氏菌 (Brucella )
的同源性为 95%, 与根瘤菌 (Rhizobium )的同源性为
91% ~ 95%,与中华根瘤菌 (S inorhizobium )和巴通体
属病原菌 (Bartonella )的同源性均为 90%~ 94%, 与中
慢生根瘤菌 (M esorhizobium )的同源性为 89%~ 95%。
图 1 黄龙病病原菌亚洲种 23S /5S rDNA序列的多重比对
222 序列遗传变异分析 来源于 NCBI的柑橘黄
龙病病原菌亚洲种 S ihu i样品的 23S /5S rDNA序列与
本研究获得的 6个柑橘黄龙病样品 ( GX1、GX69、FJ1
1、HN46、T3和 FL21) 23S /5S rDNA序列之间有 8个
碱基的差别,其中包括 1个碱基的插入 ( 20 bp,图 1)
及 7个碱基的替换 ( 1 312 bp、1 412~ 1 416 bp、1 549
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2009年第 5期 廖惠红等:基于 23S/5S rDNA序列的柑橘黄龙病病原菌亚洲种系统发育研究
bp,图 1)。GX1、GX69、FJ11、HN46、T3和 FL21在 1
654 bp的 23S /5S rDNA序列中只有 7个碱基的差异
且均由碱基替换所引起 ( 49 bp、91 bp、673 bp、676 bp、
1 011 bp、1 054 bp、1 608 bp, 图 1)。
223 Putative cell w all hydro lase pseudogene及 5S
rRNA基因的分析 对来源于广西、福建、湖南、我
国台湾和佛罗里达州的 6个柑橘黄龙病病原菌样品
与来源于 NCBI的柑橘黄龙病病原菌亚洲种 Sihui
样品的 putat ive cell w all hydro lase pseudogene和 5S
rRNA基因的序列进行比较分析, 结果表明在不同
地理来源的 7个样品 ( GX1、GX69、FJ11、HN46、T3、
FL21和 Sihui)中, GX69在 putative ce llw a ll hydro
lase pseudogene基因序列中有 2个碱基发生了替换
( 1 011 bp、1 054 bp,图 1),其余 6个样品的 putative
cell w all hydrolase pseudogene序列完全一样; Sihui
在 5S rRNA基因中, 只有 1个碱基发生了替换 ( 1
549 bp,图 1), 其余 6个样品的 5S rRNA基因序列完
全一样。在 putative cellw all hydro lase pseudogene基
因和 5S rRNA基因区间, S ihu i样品与其他 6个不同
地理来源的样品相差较大, 有 6个碱基的差异 ( 1
312 bp、1 412~ 1 416 bp,图 1)。
23 系统进化发育
本研究获得的 6个柑橘黄龙病病原菌 23S /5S
rDNA序列及来源于 NCB I数据库的其它 12个病原细
菌相应的 DNA 序 列 ( EU6444491、AB1027352、
AY2443701、AY2443771、AY2443821、AY2443681、
AY2443801、AF2201491、AF2201481、AY2443661、
AY4845931、AF4109441、E scherichia co li UTI89)用于
构建分子系统发育树 (图 2), 其中 E scherichia coli
UT I89用于外类群。系统发育树的构建采用最大简约
法 (M axmi un Parsmi ony), 并用自展法 ( Bootstrap)对所
构建的系统树进行检测, 自展重复次数设定为 1 000
次。结果表明, 柑橘黄龙病病原菌亚洲种 7个样品
GX1、GX69、FJ11、HN46、T3、FL21、Sihui自成一类,自
展百分比为 99%, 变形菌纲的其他细菌聚为另一类,
自展百分比为 67%。在同一类群内,同属于根瘤菌科
土壤杆菌属的 Agrobacterium tumefaciens, 根瘤菌属的
R izobium vitis strain和 Rizobium rhizogenes strain,中华根
瘤菌属的 S inorizobium kostiense strain和 S inorizobium
saheli stra in聚为亚类; 来源于布鲁氏菌科 ( B rucellace
ae)布鲁氏菌属 Brucella melitensis的 rRNA操纵子
( rRNA operon)B和 C、巴通体科 ( Bartonellaceae)巴通
体属的 Bartonella quintana和 Bartonella birtlesii,叶杆菌
科 ( Phyllobacteriaceae)中慢生根瘤菌属的 M esorhizobi
um huakuii strain及叶杆菌属的 Phy llobacterium myrsi
nacearum strain聚为另一亚类。
图 2 基于 23S /5S rDNA序列的黄龙病亚洲种及
变形菌纲的其他细菌系统进化发育树
3 讨论
柑橘黄龙病是柑橘产区最严重的病害之一,其病
原菌为韧皮部杆菌属革兰氏阴性细菌, 目前有 3个
种,亚洲种 (CaLasiaticus)、非洲种 (CaLa fricanus)
和美洲种 ( CaLamericanus)。关于该病原菌 16S
rRNA基因的研究较多, 如黄龙病病原菌的 PCR检
测 [ 14] ,不同地理来源不同种间的 16S rDNA序列的比
较及多样性分析 [ 15, 16] ,基于 16S rDNA序列的分子进
化系统发育研究 [ 3, 11, 17]等。本研究对黄龙病病原菌
亚洲种 7个样品 ( GX1、GX69、FJ11、HN46、T3、FL21
和 Sihui)的 23S /5S rDNA序列进行比较分析,结果发
现黄龙病病原菌亚洲种种内之间 23S /5S rDNA序列
与 16S rRNA基因, 16S /23S rRNA基因区间序列一样
非常保守 [ 9, 15, 16] ,且此 23S /5S rDNA碱基序列与 16S
rRNA基因及 16S /23S rRNA基因区间的碱基序列一
样确实存在差异 [ 15]。 16S rRNA 基因及 16S /23S
rRNA基因在黄龙病病原菌亚洲种种内之间的碱基序
列差异与地理来源有关 [ 15] , 本研究中 23S /5S rDNA
碱基序列在黄龙病病原菌亚洲种种内之间的差异程
(下转第 100页 )
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
抑制 K562细胞增殖。 72 h核蛋白表达则增加, 推
测可能与药物浓度有关, 随着时间延长, TSPG药效
逐渐衰减所致。研究表明, 在非刺激的情况下,
STAT5蛋白绝大多数位于细胞质中, 而在接受刺激
的情况下, STAT5蛋白迅速转运到细胞核内,进而诱
导相应基因表达,在信号终止后, STAT5蛋白又迅速
转运回细胞质中。 6、12、24、48、72 h, 浆蛋白中
STAT5表达较对照组增加,考虑可能与以下因素有
关: ( 1)逆转位, 即 STAT5从核里面转至胞浆; ( 2)
转位阻滞,即 TSPG影响 STAT5从胞浆到胞核的正
常运转, 但是否影响 K562细胞 STAT5总量表达与
活性尚待进一步研究。
总之, 在 TSPG调控 K562细胞增殖中影响了
STAT5的表达模式, STAT5的异常表达激活与抑制
K562细胞增殖的关系还有待于进一步明确,深入研
究 STAT5信号转导通路作用机制有可能为治疗
CML提供新的理论和实验基础。
参 考 文 献
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(上接第 91页 )
度与地理的远近无关。利用最大简约法对来自我国
广西、福建、湖南、台湾和美国佛罗里达州的 6个柑
橘黄龙病样品 ( GX1、GX69、FJ11、HN 46、T3和 FL2
1)的 23S /5S rDNA序列及来源于 NCB I数据库的
变形菌纲其他病原菌相应的碱基序列构建系统进化
发育树显示黄龙病病原菌亚洲种 7个菌株单独聚为
一类并与 变形菌纲其他病原菌分开, 该结果与
Teixeira等 [ 17 ]基于 rp lJ基因和 Doddapanen i等 [ 11]基
于 16S rRNA基因的 DNA序列构建的分子系统进化
树结果一致。
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