全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
特异性启动子调控甜瓜 ACC氧化酶反义基因
载体构建及对烟草的转化
陈佰鸿 毛娟 赵鑫
(甘肃农业大学农学院,兰州 730070)
摘 要: 以甜瓜 ACC氧化酶反义基因抑制水果成熟过程中内源乙烯的合成为基础,建立甜瓜特异性启动子调控下 ACC
氧化酶反义基因表达载体。以 pCBACO1载体为基础,进行平末端连接加入特异性启动子 pCAMACO1prom oter,对转基因甜
瓜表达载体的构建进行特异性启动子的研究,通过叶盘法转化的烟草经过 PCR检测已转入含有特异性启动子 promo ter调控
下 ACC氧化酶反义基因表达载体,为下一阶段用该反义基因载体转化甜瓜栽培品种奠定基础。
关键词: 甜瓜 CMACO1启动子 特异性表达 ACC氧化酶
Construction of a Plant Expression Vector with aM elon ACO1 Antisense
Gene Regulated by Fruit Specificity Promoter and Its
U tilization of Transformation in Tobacco
Chen Baihong M ao Juan Zhao X in
(College of Agronomy, Gansu A gricultural University, Lanzhou 730070)
Abstrac:t App ly ing antisense gene stra tegy to reduce e thy lene b io synthesis is a new feasib le m ethod to breeding m e lon cu ltivars
wh ich so ftening and senescence wou ld be delayed. A fter blunt end ligation, a fruit spec ific ity promo terw as constructed into a p lant ex
pression vecto r pCBACO1 in antisense o rienta tion, and then transfo rmed tobacco. The construc tion o f the antisense gene vecto r is suc
cessfu l and usab le, wh ich w as proved by the ev idence that the antisense genew as transferred into tobacco and PCR products. These re
su lts g ave a su fficient and essentia l preparation to transform m elon m a in cu ltivars, fo r the purpose o f increasing their keeping qua lity.
Key words: Cucum is m e lon CMACO1 prom o ter Spec ific express ACC ox idase
收稿日期: 20100504
基金项目:甘肃省生物技术专项 (GNSW200404)
作者简介:陈佰鸿,男,博士,副教授,主要从事园艺植物生物技术和设施栽培方面的数学和科研工作; Ema i:l bhch@ gsau. edu. cn
甜瓜 ( Cucum is me lon)是世界 10大水果之一。
中国甜瓜种植面积和产量居世界第一 [ 1] , 而甜瓜是
典型的跃变型果实, 大量上市成熟时期正值高温季
节,贮藏、运输过程中极易软化、腐烂, 经济损失巨
大。乙烯与果实采后的软化、腐烂有密切关系 [ 2 ]。
Adman和 Yang证明 ACC合成酶和 ACC氧化酶是
植物体内乙烯合成途径中的两个限速酶 [ 3]。通过
降低果实中 ACC合酶和 ACC氧化酶基因表达, 减
少乙烯产生从而延缓跃变型果实后熟过程。Oe ller
等 [ 4]利用 LEACS 2的反义 RNA抑制番茄中乙烯产
生;王春霞等 [ 5]将番茄的 ACC合成酶反义基因转入
西瓜,控制乙烯的释放; 李天然等 [ 6]将番茄 ACC合
成酶反义基因转入河套蜜瓜,并获得了转基因植株。
甜瓜 ACC氧化酶多基因家族的 3个成员已被克隆
和鉴定出来 [ 7] , 运用反义 RNA技术转化甜瓜也取得
成功 [ 8]。最近的研究表明这类基因的顺式调控元
件在受环境因子和发育阶段信号刺激后特异表达,
如病原菌侵染 [ 9]、热刺激 [ 10]、损伤 [ 11 ]、激素处理 [ 12]
及重金属处理 [ 13 ]等, 所以甜瓜 ACC氧化酶基因的
表达具有组织特异性,分别在植物不同发育阶段特
异启动表达。目前在甜瓜基因工程中多使用组成型
启动子,外源基因在受体植物中的非特异性持续高
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
效表达造成能量浪费, 而且可能在需要大量表达的
时间或组织部位因表达量过低而达不到预期效果,
外源基因的过量表达影响转基因植物生物安全性。
本试验研究甜瓜高效遗传转化体系的建立及甜瓜特
异性启动子调控下 ACC氧化酶反义基因植物表达
载体的构建及转化。针对甜瓜转 ACC氧化酶反义
基因中使用 35S组成型启动子, 以克隆出的 CM
ACO1果实特异性启动子为基础, 对转基因甜瓜表
达载体的构建进行特异性启动子的研究, 选择诱导
性或特异性表达启动子增加外源基因表达的效果和
效率, 减少能量和物质的消耗, 从分子水平上调控后
熟果实乙烯的产生提供可行的途径, 进而提高果实
采后耐储性,提高甜瓜的经济效益。
1 材料和方法
1. 1 试验材料
烟草红花大茎子 (N icotiana tabacum );启动子质粒
pCAMACO1promoter, 农杆菌 EHA105,质粒 pBI101. 2
由本实验室保存。各种限制性内切酶、T4DNA连接
酶、K lenow大片段购自 Promega生物公司, DNA mark
er、大肠杆菌 DH5、Taq DNA 聚合酶、卡那霉素
(Kan)、羧苄西林 ( Carb)、利福平 ( Cef)购自天根生化
科技 (北京 )有限公司; PCR引物由北京天根生物技
术有限公司合成。常规化学试剂为国产分析纯。
12 试验方法
121 pCAM ACO1promo ter植物转化载体的构建
及鉴定 碱裂解法大量制备含有目的基因的
pCAM ACO1promoter和 pB I101. 2载体并进行纯
化, BamH 和 H ind !进行双酶切, 回收 promoter
小片段和 pB I101. 2大片段,对 pB I101. 2大片段进
行磷酸化。将回收的 promoter小片段和质粒载体
pB I101. 2大片段进行连接,转化大肠杆菌感受态细
胞。进行细菌培养后碱裂解法小量提取质粒, 以
pB I101. 2载体为对照, 用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳进
行滞后带检测,从滞后质粒中随机挑取质粒进行双
酶切鉴定。
122 农杆菌转化鉴定 采用直接转化法构建植
物转化载体,重组质粒 pCAPG101. 2转化感受态农
杆菌 EHA105, 对照 ( CK )中无目的基因片段, 其余
成分与处理相同。将转化菌液涂布在固体 YEP培
养基 ( Kan 50 g /mL, R if 25 g /mL, S tr 25 g /mL)
平板上, 28∀ 培养 24 - 48 h, 待重组质粒在筛选培
养基上长出菌落后随机挑取新鲜菌落培养, 提取质
粒为模板,用启动子的引物进行 PCR扩增。
123 烟草外植体的转化 经农杆菌感染的叶片
外植体在选择培养基上进行诱导分化培养, 进行
Kan抗性芽的筛选;经过筛选的 K an抗性苗转接到
含 100 mg /L Kan的 1 /2 M S培养基上进行生根培
养; 对继代两次的转化烟草随机抽取生根的 K an抗
性植株进行 PCR扩增检测。
124 甜瓜特异性启动子调控 ACC合成酶基因载
体构建 重组质粒的构建、鉴定, 农杆菌的转化鉴定
及烟草的转化方法同上。
2 结果与分析
2. 1 重组质粒小片段的获得
碱裂解法大量制备含有目的基因的 pCAM
ACO1promoter质粒 DNA, 用 BamH 和 H ind !进
行双酶切 (图 1), 回收 promoter小片段;重组质粒大
片段的获得: 碱裂解法大量制备含有目的基因的
pCBACO1质粒 DNA, 用 Xba 和 H ind!进行双酶
切, 回收 pCBACO1大片段。
1. pCAMACO1酶切; 2. M ark er;
3. pCAMACO1p rom oter酶切
图 1 质粒酶切鉴定
2. 2 重组质粒的构建
大小片段酶切位点只有 H ind!相同, promo ter
小片段 3#端为 BamH , pCBACO大片段 5#端为
Xba ,不能直接进行连接,需要进行由 DNA聚合酶
K lenow片段补平 3#凹陷,使不相匹配的末端转变为
平端,进而进行平端连接, 构建植物表达载体 pCB
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2010年第 12期 陈佰鸿等:特异性启动子调控甜瓜 ACC氧化酶反义基因载体构建及对烟草的转化
aACO1P。然后转化大肠杆菌感受态细胞, 进行细
菌培养后按照碱裂解法小量提取质粒, 用 10%琼
脂糖凝胶电泳进行检测后, 进行启动子引物及 CM
ACO1引物的 PCR扩增鉴定 (图 2)。
1.分子量标准; 2.对照; 3, 4.重组质粒
PCBACO1p rom oter扩增产物
图 2 重组质粒启动子 PCR鉴定
2. 3 农杆菌转化鉴定
采用冻融法将构建好的植物转化载体 pCBaA
CO1P转化到感受态农杆菌 EHA 105, 对照 ( CK )中
无目的基因片段, 其余成分与处理相同。将转化菌
液涂布在固体 YEP培养基 ( K an 50 g /mL, R if 25
g /mL, Str 25 g /mL)平板上, 28∀ 培养 24- 48 h,
待重组质粒在筛选培养基上长出菌落后随机挑取新
鲜菌落培养,提取质粒为模板, 用特异性启动子引物
及 CM ACO1引物进行 PCR扩增鉴定 (图 3)。
1. PCBACO1扩增产物; 2.分子标记; 3.对照
图 3 重组质粒目的基因 PCR鉴定
2. 4 烟草转化
2. 4. 1 K an抗性芽的筛选 农杆菌侵染的烟草叶
片外植体在选择培养基上进行诱导分化培养, 在含
100 mg /L Kan的 MS选择分化培养基上, 外植体最
初表现黄化迹象,对照外植体的黄化程度明显,选择
10 d以后对照外植体全部死亡, 而转化外植体有膨
大迹象,在黄化叶片边缘处有针尖状的芽点开始分
化, 约 20 d开始陆续分化出含多株苗的丛生苗。虽
然抗性芽在选择培养基上的生长情况明显弱于正常
再生芽,但还是能够独立成苗,而且独立芽的发生率
很高。
2. 4. 2 不定芽的诱导 经过筛选的 Kan抗性苗转
接到 1 /2 M S生根培养基 ( 100 mg /L Kan)上, 发育
成为完整植株,未经转化植株不能在生根培养基上
生根,小苗将会慢慢自下而上变黄枯萎而死。另外
根系的发育受 Cef的影响很大, 在含 1 /2 M S+ 100
mg /L Kan+ 200 mg /L C ef培养基上, 烟草根系比较
粗大,但不分枝,而在 1 /2M S+ 100 mg /L K an培养
基上,根系生长正常, 发生侧根, 说明 Cef对烟草根
系的分化是有影响的。
2. 4. 3 烟草抗性苗的 PCR检测 对继代两次的
转化烟草随机抽取生根的 Kan抗性植株进行 PCR
扩增检测,用一对 pCAM ACO1 (图 4)特异性引物
PCR扩增 (图 5)和启动子特异引物作 PCR扩增。
转化的烟草植株完全可以同时扩增出 ACO1基因
和启动子基因, 说明目的基因已整合到烟草基因
组中。
1.分子标记; 2- 6. PCBACO1扩增产物; 7.未转化对照
图 4 转基因烟草的 CMACO1基因 PCR鉴定
3 讨论
3. 1 CM ACO调控基因
薄皮甜瓜 [ 8]、哈密瓜 [ 14]等植物中利用反义 RNA
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1.分子标记; 2 - 6. PCBACO1扩增产物; 7.未转化对照
图 5 转基因烟草的特异性启动子 PCR鉴定
技术抑制乙烯合成推迟果实软化已有大量研究。黄
永红等 [ 15]研究了 ACC氧化酶反义基因植物表达载
体的构建;郭庆勋等 [ 16]研究了特异性启动子 E8植
物转化载体在甜瓜中的转化。调控植物乙烯代谢的
研究大多数针对整个果实, 对于植株组织之间乙烯
产生量变化的研究还未见报道。本研究发现, ACO1
启动子只在果皮组织中高效表达, 这与乙烯的代谢
密切相关,所以推测甜瓜果实成熟过程中乙烯的合
成与代谢主要发生在果皮部位,与果肉组织影响不
是很大。CM ACO1在果实后熟和逆境下迅速表达,
CM AC02仅在黄化下胚轴中低水平表达, CM AC03
在开花时特异表达 [ 17] ,且不受环境刺激诱导。转基
因植物器官或组织中表达的特异性启动子可使目的
基因在特点生长发育阶段或不同环境条件下表达,
其中 CM ACO1是在成熟果实中惟一伴随着氧化酶
活性高峰而出现转录高水平的基因 [ 18]。近年来的
研究更进一步证明这类基因的特异表达是由其启动
子的特异表达所决定,并且在这方面做了大量研究,
Lasserre
[ 9 ]研究表明甜瓜 CM ACO1基因的启动子在
转基因烟草中的表达完全具有组织和时空特异性。
3. 2 甜瓜的遗传转化
甜瓜的遗传转化相对比较困难, 在甜瓜遗传
转化中出现的问题主要有: ( 1)细胞分裂素与抗生
素之间的相互影响; ( 2 )农杆菌在体内的影响;
( 3)基因导入的整合问题。目前常用的甜瓜遗传
转化的方法有基因枪法、花粉管通道法和根癌农
杆菌介导法 [ 8, 19 ] , 就目前的研究结果看, 最成功的
是根癌农杆菌介导法。遗传转化的成功一个方面
决定与农杆菌与植物受体相互作用获得转化细胞
的数量;另一个方面决定于转化细胞再生率的高
低。影响限制每一步的因子都会影响到最后的转
化效率。由于酶切位点不同, 在连接时需要限制
性酶或核酸外切酶消化,或由 DNA聚合酶 K lenow
片段补平 3#凹陷, 使不相匹配的末端转变为平端。
成功的连接反应需纯净的目的 DNA片段和载体
DNA, 一般采用插入片段 (目的 DNA )与载体 DNA
分子数比为 3- 5∃1。目的基因比例太多, 易产生
基因自连后插入载体的多聚体。
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(上接第 112页 )
能。为指导染色体结构的深入研究, 以及实际的转
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