全 文 ：生物技术通报
· 研究报告 · 刀了口了百 付 口乙口 年增刊
草坪草总 几种提取方法的比较
李聪 曾会明 韩烈保
北京林业大学草坪研究所 ,北京 !∀#
摘 要 分别采用 水法 、 法 、 一 沉淀法 、 一 酚法 、 提取液抽提法以 及异硫氛酸
孤法等 种方法提取草坪草总 , 通过检测对各种方法的提取效果进行比较分析。 结果表明 , 水法是最经
济 、操作最简单的一种方法 , 并且提取的 质量较好 、可靠性高、 易于大量制备 , 是提取草坪草 比较理想的
方法之一 ,建议使用该方法 。 利用 法提取到的 亮度约为 的两倍 , 效果较好 , 操作简单 ,
符合分子生物学实验要求。 ! 一 沉淀法 、 一 酚法 、 提取液抽提法也获得较高质量的 ,但存在不
同程度的 污染。 异硫氰酸孤法提取 有明显的蛋白质污染 , 且 部分降解 , 此种方法不予采用 。
关键词 草坪草 总 提取 电泳
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u l龟rass To talR N A Extraetion E leetrophoresis
提取纯度高 , 完整性好的 R NA 是进行许多分子
生物学实验的必要前提 , 如 :CD NA 文库构建 , N o rt h -
e
m 印迹杂交分析及寡聚(dT) 纤维素选择分离 m R-
N A 等实验的成败在很大程度上取决于 RN A 的质
量川 。 尽管 R N A 的提取已经成为很成熟的技术 , 但
在实际研究中经常很难顺利获得质量好的 R N A 。
这主要归咎于很多因素(如材料的预处理不充分 、
器具不洁净 、操作不严格等)使得植物组织总 R N A
在提取过程中 , 容易受到内源 和外源 R N A 酶的降
解 。 而且提取不同植物材料中 RN A 的最适宜条件
及其相应方法也不尽相同 , 主要原因是植物体内富
含许多次生代谢物及蛋白质 、多糖等大分子 , 这些物
质影响 R N A 提取效率 , 而且干扰其后的逆转录 、酶
切等实验操作[’, , ]并且不同植物的代谢物 , 尤其是
多糖及多酚等化合物含量亦不相同 , 因此很难有一
种方法适合于所有植物总 R NA 的提取 。 因此 , 针对
基金项 目:高校博士点基金 20 70 2 04 2 ;国家 863 计划(Zo 6A A1 0z l犯 ); “ 十一五 ”科技支撑项目(ZO06 B A田IA1 9 一 4 )
作者简介:李聪 (1986 一 ) , 女 , 2 0 8 级硕士生 , 研究方向 :草坪草生物技术育种
通讯作者:曾会明 , s e i i
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生物技 术通报 B to te ch n olo gy B u le 瓦n 2 0 0 8 年增干IJ
不同植物组织的特点 , 对 R NA 的提取方法进行优化
选择成为必要 。 通过对 6 种较常用的提取方法进行
检测比较 , 从而分析较好的草坪草 R NA 提取方法 。
1 材料和方法
1.1 实验材料
北京林业大学校园内种植的草坪草 , 主要为早
熟禾 、高羊茅混播草种
1.2 主要试剂
焦碳酸二乙醋 (D EPC ) 、 十六烷基三 乙基嗅化
铰(CTA B ) 、 T i r s 一 H C I ( p H S . O ) 、 N a C I 、 E D T A 、日一琉基
乙醇 、聚乙烯毗咯烷酮 PV P 、氯仿 、异戊醇 、 L I CI 、
S D S
、乙醇 、异丙醇 、异戊醇 、 N a A e 、 T r i s 一饱和酚(pH S.
o ) 、T R l z o l 、水饱和酚(pH 3.5 ) 、异硫氰酸肌 、十二烷
基肌氨酸钠 、 柠檬酸钠 (pH7 .0) 、 硼砂 (pH S.0 ) 、
D E P C 水(0 .1% ) 、液氮
R N A 提取中除含 Tr is 的溶液外 , 均用 0. 1%
DE PC 水处理并高压 灭菌 , 含 Tris 的溶液用经高压
灭菌的 0.1% DE Pc 水直接配制 , 玻璃器皿 , 镊子 , 剪
刀则于 180℃ 干热灭菌4h 以上 , 塑料离心管 、枪头 、
等均用 0.1% D EPC 水室温浸泡过夜后高压灭菌 , 电
泳槽及加样梳用 无水乙醇浸泡 lh 。
1
.
3 实验方法
1.3 .1 D E P c 水法沐〕 ( l) 研磨:称取 0 .19 的新
鲜草坪草廿卜片 , 用 R N as e fr ee ddH 2 0 洗两次 ,用滤纸
吸干后 , 迅速放人研钵 (放之前研钵用液氮预冷 )
中 , 加人液氮 , 迅速研磨 , 研磨过程中保证也但不挥
发干净 , 至将植物材料研成细末 , 转人 1.sml 的离心
管中。
( 2 ) 抽 提:取 Zm l 的离心 管 , 加人 7O0 m l 的
D EPC 处理过的去离子水 , 水饱和酚 (PH 3.5) 和氯
仿各 400ml 及 100 ml 的琉基 乙醇 , 置于冰上 。 取 0 .
19 研磨好的材料放入 仁述离心管中 , 4 ℃ 震荡培养
箱中震荡 20m in 。 4 ℃ 14 000 / m in 离心 10 m in 后取
出 , 置于冰上 , 抽取上清 lm L 。 加人等体积 1:l 的酚
仿 , 4 代二震荡培养箱中震荡 Zom in , 4 ℃ 14 000 甲m 离
心 10/ m i,、后取出 , 抽取上清 SO0m l。 加人等体积氯
仿 , 震荡 ZOm in , 4 ℃ 14 00 0甲m 离心 10/ m in 后取出 ,
抽取上清 。 重复此步骤 一 次 。
( 3 ) 沉淀 :加人 40Om l 的氯化锉 (SM )和 400 m l
的无水, 乙醇 , 置于 一 70 ℃ 沉淀 20 mi n 。
( 4 ) 洗涤:4℃ 14 000 / m in 离心 10/ m in , 弃上清 ,
用 75 % 乙醇洗第一次 , 吹干后加人 30 ml DE PC 水 ,溶
解沉淀。
1
.
3
.
2 T RI zo l 法提取步骤 (l) 研磨:方法同上 .
(2 )抽提 :向离心管中加人 l而minTRxzol, 充分
混匀 , 室温放置 sm in 。 4 ℃ 12 000/ m i。 离心 10/ m i。 ,
取上清 , 转移到新的无 R N as e 的新离心管中 , 加人
0.Zm L 氯仿 , 盖好盖后 , 剧烈震荡 巧s , 室 温放置
3m in . 4℃ 100 00/ m in 离心 15/ m in , 样品分层 , 把水
相约 600u/m in 转移至新管中 。
( 3) 沉淀:在得到的水相中加人 60O ml 异丙醇 ,
混匀 , 室温放置 3om in , 4 ℃ 10 000/ m in 离心 10/ m i。 ,
去上清 。
( 4 ) 洗涤:加人 lm l75 % 乙醇洗涤沉淀 , 将 75 %
乙醇用移液枪吸净 , 将离心管在超净工作台中吹干
(大约 3m in )时 间过长 , R N A 不易溶解 , 加人 3Om l
无 R N as e 水混匀溶解沉淀 。
1
.
3
.
3 c T A B 法 「, 〕 ( l) 研磨:称取 0 .19 的新鲜草
坪草叶片 , 用 D EPC 水洗两次 , 用滤纸吸干后 , 液氮
中迅速研磨(方法同上 ) , 转人 Zml 的离心管中。
( 2) 抽提 :加人 65 ℃ 预热 的 lml 提 取缓冲液
(2% CTAB ; IO0m m oF L 『T i r s 一 H C I ( P H S . O ) : 1 .
4 m o l/ L N a C I ; Z O m m o l/ L E D T A ( p H S
.
0 ) ; 2 % p 一 琉
基乙醇:2% pV p) , 充分振荡混匀 , 6 5 ℃ 水浴 10m in ,
其间每隔 3m in 颠倒混匀一次。 冷却至 5 ℃ , 加人
1m L 氯仿/异戊醇(24 :1) , 充分颠倒混匀 sm in , 室温
放置 10 m in , 1 8 ℃ , 1 0 O 0 0 m i n , 离心 10 m in 。 将上清
75 0m l移至新的 1.sml 离心管中 , 加人等体积氯仿/
异戊醇 (24 :1 ) , 充 分颠 倒混匀 sm in , 室温放置
IOm in , 1 8 ℃ , 1 0 0 0 0 / m i n , I O m i n 。 ( 3 ) 沉淀:将上清
lm L 移至 新的 1.sml 离心 管中 , 加人 0. 25 ml 的
IOm ol/ L LICI , 一 2 0 ℃ , 3 h r 。 4 ℃ , 1 2 0 0 0 / m i n , 离心
20 m in , 弃上清 。
( 4 ) 再次抽提 :加人 30 林1 0 .5 % S D S 溶液溶解沉
淀 。 转人 1.sml 的离心管中 , 加人等体积氯仿/异戊
醇(24 :1 ) , 充分颠倒混匀 sm in , 室 温放置 10 m in ,
1 8 ℃ , 1 0 0 0 0 / m i n , 离心 sm in 。
( 5 ) 沉淀 :吸取上层水相 50 ml 至新的 1.sml 离
心管中 , 加人 ro o ml 的无水乙醇 , 一 20 ℃ , 放置 lhr
有沉淀析出 , 4 ℃ , 1 2 0 0 0 / m i n , 离心 15 m in , 弃上清 ,
年增刊 李聪等:草坪草总 RN A 几种提取方法的比较 22 1
留沉淀 。
( 6) 洗涤:用 75 % 乙醇洗沉淀 , 两次 , 瞬时离心 ,
用移液枪除去上清液 , 放在超净工作台中 , 干燥
3m in , 加人 30林1 D E p C 水溶解沉淀 。
1
.
3
.
4 s D s
一酚法提取困 ( l) 研磨:同上
(2) 抽提:向离心管中加人 0 .6m l SD S 提取液
(SD S 提取液:2% SD S , 硼砂 0 .025m ol/ L (PH S.5 ) ,
D E P C 水处理 , 氯仿 , Tri s 一苯酚(PH S.O) , 4 m o l/ Ll i C I ,
Z m
o
F 加aA C(PH S.2 )将上述材料 0.29 迅速加人离
心管中 , 用旋涡震荡器剧烈震荡 3而。 , 12 o 0 0/ m in
离心 5/ m in , 转移上清液到新离心管中 , 加人 0.3ml
苯酚和 0.3nil 氯仿 , 用旋涡震荡器剧烈震荡 Zm in ,
1 2 0
(X)
/ m i
n 离心 5/ m in , 取上清液700Inl 。 用等体积
氯仿重复步骤 2 抽提一次 。
( 3) 沉淀:吸取 so nil 上清液并加人等体积的
4m ol/ L LI CI和 300m l的无水乙醇 , 混匀 , 一 2 0 ℃ , 冰
浴 3h , 1 2 0 0 0 / m i n 离心 10/ m in , 沉淀 RNA . 沉淀溶
于 40nil 的 DEPC 水中 , 待溶解后加人 4ulZ m oF
LnaA C(PHS .2 )和 150Inl 无水乙醇 , 冰浴 50m in , 1 0
0
0()
/ m i
n 离心 10/ m in , 沉淀 RN A 。
( 4) 洗涤:用 75 % 乙醇洗涤沉淀 1次 , 沉淀溶于
3OInl D E P C 水中待用 。
1
.
3
.
5 S D S 提取液抽提法[v] (l) 研磨 :同上述方
法 。
( 2 ) 抽提 :将研磨好的样品迅速转人 Zm L 离心
管中 , 依次加人 80om lRN A 抽提掖 [0 .oZm oF U I, ri s -
H C I P H S
.
0
)
、
1 % S D S
、
0
.
Z m o F L N a C I
、
0
.
O 0 5 m o F
L E D T A 」, 8 0 0 林l 酚: 氯仿 :异戊醇 (25 :24 :1) , 震
荡Zm in 后于4℃12 (X) 0/ m in 离心 5/ m in 。 吸取上清
液800林l移至 Zm l离心管中 , 加人 800林l 氯仿 充分
混匀 4℃ 、 1 2 (X) o r/ m i n 离心 sm in 。
( 3 ) 沉淀:将上清液 50 闪 转移至 Zml 离心管
中 , 加人 soul3m ol/ LN aAe(pH S.2 ) , 2 . 5 倍体积的
无水乙醇于 一 70 ℃ 冰箱 中放置 30 mi n 后 , 4 ℃ 12
O 00 r/ m in 离心 15 m in , 收集沉淀
(4 )洗涤 :分别用 75 % 乙醇和无水乙醇洗涤沉
淀 1 次 , 每次洗涤后 于 4℃ 、 1 2 0 0 0 “m in s m in , 干燥
R N A 沉淀 ,放在超净工作台中干燥 3m in , 然后溶解
R N A 沉淀
1.3.6 异硫氰酸肌法川 ( l) 研磨:同上述方法
(2 )抽提:加人 0 .sm l异硫氰酸肌溶液(4m ol/ L
异硫氰酸肌 , 25 m m o F L 柠檬酸钠(pH 7.0 ) , 0 . 5 % 二
烷基肌氨酸钠 , 0 . I M B 一琉基乙醇)置于冰上依次加
人 50m lZm oF L N aN e , 混匀 , 0 . s m l 水饱和酚 , 1 7 0 u l
氯仿:异戊醇(24 :1) , 混匀 , 置于冰上 巧m in 。 各管
平衡后 , 4 ℃12 00 / m in 离心 30/m in 。
( 3) 沉淀:转移上清液 70 ml 至另一新管中加
人等体积异丙醇( 一 20 ℃放置 ) , 一 70 ℃沉淀 20 mi 。 ,
4 ℃12 (X) 0/ m in 离心 20/m in , 回收 R N A 。
( 4 ) 洗涤:用 70% 乙醇洗一次 , 4 ℃ 12 000/ m in
离心 5/ m in , 吸弃乙醇 , 吹干 R NA 沉淀。
( 5) 再次抽提:用 150 ml 异硫氰酸肌溶液 , 涡旋
溶解 R N A 沉淀。
( 6) 沉淀:加人 等体积异丙 醇 , 一 70 ℃ 沉淀
20m in , 4 ℃ 12 0 0 / m in 离心 20/ m in , 回收 R NA 。
( 7 ) 洗 涤:用 70% 乙醇洗一次后 , 吹干溶于
30m l DE PC 水中 ,待电泳检测 。
1
.
3
.
7 上述所提 R N A 样品电泳检测 分别取 3闪
RN A 样品 ,在 1.0% 的非变性琼脂糖凝胶上电泳检
测 。
2 结果与分析
不同方法提取草坪草总 RN A 完整性检测 :电泳
结果显示 TRI zo l法能够从成孰的草坪草叶片中提
取出总 R N A , 2 8 5 r R N A 与 185 rR N A 条带亮度接近
于 2 :1 , 说明 RN A 未被降解 。 T RI zo l 法虽然有快速
高效的特点 ,但其价格昂贵 , 不适用于大量植物组织
提取 。 C T A B 一 L IC I 沉淀法和 SD S一酚法 , 所得 285
rR N A 和 185 rR N A 质量较好 , 条带清晰 , 因为这两
种都采用 LI CI 和无水乙醇作为沉淀剂 , 而 LI CI 沉淀
小分子 R NA 不完全[’〕, 5 5 r R N A 含量较少 , 说明所
提 R NA 完整性较好 。 C T A B 是一种去污剂 , 可溶解
细胞膜 , 并与核酸形成复合物 , 在高盐溶液中是可溶
的 。 当降低浓盐度时 , 就会将 CTA B 一核酸复合物与
蛋白质和多糖分开 , 并用氯仿/异戊醇反复抽提 、
h CI 沉淀 , 以去除蛋白质 、碳水化合物和次生代谢物
等杂质 。 S D S 则是一种蛋白质变性剂 , 能充分裂解
细胞 ,并起到抑制 R N as e 的作用 。 由于实验过程中
最后未用 D Nas e处理导致这两种方法都有 D N A 分
子的污染 ,但也可以适用于 RT 一 P C R 后续反应 。
生物杖术通很 B to te chn oldg) , B u le 枷 2008年增刊
图 l 总 R N A 电泳图从左到右依次为:nE PC 水法、 r R l z o l 法、 C T A B 一L I C I 法
SD S 一酚法、 S D S 提取液法 、异硫氛酸肌法
SD S 一酚法与SDS 一抽提液法比较相似 , 但 SDS 一抽
提液法明显缩短了提取 R N A 的时间.电泳结果显示
185 rR N A 于 28 5 rR N A 条带亮度差异不大 , 且 55
rR NA 条带较亮 , 说明 RN A 样 品部分降解 。 并且
D N A 污染较明显 。
取 D EPC 水法提取草坪草 R N A 是最简单 , 最经
济 , 不需要 SD S 、 C T A B 等化学药品 , 只需要 D EPC 处
理过的去离子水 , 大大降低了成本 , 电泳结果显示基
本无 R N A 降解 , 由于极少量的 R N as e 都会造成
R N A 降解 , 琉基乙醇虽然起到抑制 RN as e 的作用 ,
该方法仍要求严格的低温条件 , 每一操作步骤都要
在冰上进行[’”] , 避免 R N A 降解 , 此种方法运用得当
适合于大量植物组织 R N A 的提取 。 2 85 : R N A 与
185 rR N A 条带亮度接近于 2 :l , S S r R N A 含量较少 ,
条带清晰 , 说明 RN A 基本无降解 。
异硫氰酸肌法提取 R N A 的电泳条带。 2 85
r R N A 条带模糊不清 , 5 5 rR N A 条带较亮 , 说明 R N A
降解 。 并且胶孔处有明显亮带 , 蛋白质污染严重 。
异硫氰酸肌法是 目前提取 R N A 常用的方法之一 。
其基本原理是异硫氰酸肌与琉基乙醇共同作用抑制
R N as e 活性 , 异硫氰酸肌与十二烷基肌氨酸钠作用
使蛋白质变性 ,从而释放 RN A , 酸性条件下 D NA 极
少发生解离 , 同蛋白质一起变性被离心下来 , R N A
则溶于上清中 。 R N A 降解可能是 由于植物材料与
抽提液之比过大 , 导致内源 R N as e 释放降解 R N A ,
由于植物材料过多造成多糖及蛋白质污染较严重 。
上述 6 种方法的进行都可以分成研磨 、抽提 、沉
淀 、洗涤四个步骤 。 六种方法所用的研磨和洗涤步
骤完全相同 , 只是在抽提和沉淀过程中有所不同 。
表 1 不同草坪草总 R N A 提取法操作程序概览
TRIzol法 C TA B 一 L I C I 法 SD S 酚法 SD S 一 法 DE PC 水法 异硫氰酸肌法
研磨 + + + + + +
抽提 氯仿一次 氯仿
/异戊醇(24 :
l) 三次
苯酚和氯仿一 次 ,
氯仿 一次
酚:氯仿 :异戊 醇
(25 :24 :l )一次 ,
氯仿一次
1:1 酚仿一次 , 氯
仿两次
氯仿/异戊醇 (24 : l)
和水饱和酚一次
沉淀 异丙醇一次
LI CI 和无水 乙 醇
各一次
口Cl 和无水 乙醇
共同一 次 , 无水乙
醇一次
无水 乙 醇 两 次 ,
75
% 乙醇一次
U CI 和无水乙 醇
共同一次 异丙醇(
一 20 ℃ )两次
洗涤
时间 约 lh30m in 约6h3 0m in 约 s h 约Zh 约 3 h 约 3 h
实验结果表明:D EPC 水法 , C T A B 一且Cl 沉淀以
及 SD S一酚法效果较好 , 适用于大量草坪草 R N A 提
取 ,但从时间上考虑 , C T A B 一LI CI 沉淀法提取所需时
间较长 , 不建议使用 。 D E PC 水法是较适合的提取
年增刊 李聪等:草坪草总 RN A 几种提取方法的比较 223
方法 。 要想缩短提取时间可以选用 TRI zo l试剂盒
法 ,该方法简易可行 , 但由于试剂昂贵 , 不适于大量
提取 。 S D S 一提取液法和异硫氰酸肌法虽然提取时间
较短 , 但是 R N A 都有不同程度的降解 , 不建议使用 。
3 讨论
本实验根据所提取 R N A 的完整性进行综合比
较 , 选择出适于提取草坪草 R N A 的方法 。 草坪草是
构成草坪的物质基础 , 草坪有观赏 、保健 、运动 、休养
等多种用处 , 与人类活动密切相关 , 因而被广泛用于
庭园 、公园 、运动场等场地[川 。 我们可 以通过分子
生物学实验方法优化其生物学特性和遗传特性 。 提
取高质量的总 R NA , 作为 cD N A 文库构建 , N o rt he m
印迹杂交分析及选择分离 m R N A 等实验的基础 , 我
们应该根据不同植物的特点 , 选择最适合的 R N A 提
取方法 。 就草坪草而言 , 我们在 R N A 的提取过程
中 , 首先一定要选择新鲜的植物材料 , 取样后迅速在
液氮中研磨 ,避免液氮挥发干净 , 因为液氮可以充分
抑制 R Nas e , 一旦液氮挥发净就会导致内源或外源
R Nas e 降解 R NA 。 所有提取 R NA 所用到的耗材和
器皿都要进行 R N as e 清除处理 。 另外实验人员的
手上 , 唾液中后会有大量的 R Nas e 存在 , 所以在进
行 R N A 提取实验时最好戴上 口罩 , 并及时换手套。
每种实验方法都分别加人了 R Nas e抑制剂 , 如 SDS ,
E D T A
,琉基乙醇 , 异硫氰酸肌等试剂 , 它们均有抑制
RN as e 的作 用 , 防止实验操作 不 当引起 的外源
RN as e 降解和植物材料过多导致的内源 RN as e 降解
RN A , 因此实验 中一定要有足够的抑制剂起作用 。
实验中所用试剂在提 RN A 中起到重要作用 , 如 LICI
为沉淀剂 , 与无水乙醇共同作用能起到很好的沉淀
作用 , LI CI 还可以去除胶质和多糖类物质 ,有效防止
多糖物质对 R N A 提取和纯化的干扰 。 氯仿/异戊醇
为抽提剂 , 有效去除蛋白 。 酸酚不但抑制 RNas e 的
活性 , 而且在酸性条件下 , 使蛋白质进人有机相 , 而
RN A 则进人水相 , 达到纯化的目的 。 洗涤沉淀用
75 % 的乙醇 , 目的是去除盐离子的干扰。 此次实验
通过比较选择出操作步骤简单 , 实验时间较短 , 不需
要特殊试剂和贵重仪器设备等优点的方法来进行草
坪草总 R N A 的提取 , 为后续实验做好充分准备。
参 考 文 献
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