全 文 ：不同方法提取狗脊蕨叶片总RNA的比较分析
于秀霞1 , 唐海淑2 , 彭正松1 , 赵 莉2 , 阮期平2＊
(1.西华师范大学生命科学院 ,四川南充 637002;2.绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室 ,四川绵阳 621000)
摘要　[目的] 为构建狗脊蕨叶 cDNA 文库 ,保存珍贵基因资源 ,克隆和研究与有效成分合成相关的基因等提供技术参考。[方法] 以狗
脊蕨叶片为材料 ,采用CTAB 法、一步法 、酚-SDS法和 RNA试剂盒提取分离法提取总 RNA ,通过比较分析确定最优方法。[结果] 这 4种
方法都能提取出 18、28 S的RNA ,但CTAB 法和试剂盒提取分离法的总 RNA质量较高 , CTAB 法还提取出清晰的 5S RNA。一步法和 SDS
法带型模糊 ,有降解现象。CTAB 法提取的狗脊蕨叶片总 RNA 质量较好 , 28S、18S和 5S 条带清晰 ,且无明显降解。CTAB 提取法 OD260/
OD280的值在 1.93～ 2.06 ,试验中其 OD260/ OD 280值为 2.012, 接近 2.0, 纯度较高。一步法和 SDS法 OD260/OD280>2.0, 试剂盒法 OD260/
OD280<2.0。[结论]CTAB 法适合提取的狗脊蕨叶片总RNA ,质量较好 ,可用于 cDNA合成 、文库构建等后续分子生物学试验。
关键词　狗脊蕨叶片;总 RNA;提取
中图分类号　Q503　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2007)33-10615-02
Comparative Analysis of Extracting Total RNA from Woodwardia japonica(L.f.)Sm Leaves by Different Methods
YU Xiu-xia et al　(College of Life Science , China West Normal University , Nanchong ,Sichuan 637002)
Abstract　The aim was to provide technical references for constructing cDNA library with high quality of Woodwardia japonica(L.f.)Sm leaf , preserving
valuable gene resource, cloning and studying the genes related to available component synthesis.With W.japonica leaf as material , the total RNAwas ex-
tracted by CTBA method , one step method , phenol-SDS method , extraction and separation method with RNA kit , and the optimum method was confirmed
through comparative method.The 18 S RNA and 28 S RNA could be extracted by the 4 methods , but the qualities of total RNA extracted by CTBA method
and extraction and separation method with kit were higher, and the clear 5S RNA was extracted by CTBA method.The banding patterns of RNA extracted
by one step method and SDS method were fuzzy with some degradation.The quality of total RNA extracted by CTBA method and from W.japonica leaf was
better , the bands of 28 S RNA ,18 S RNA and 5 S RNA were clearwithout obvious degradation.The OD260/ OD280 value of RNA extracted by CTBA method
was at 1.93～ 2.06 and in the experiment it was about 2.012 , near 2.0, showing higher purity.OD260/ OD280 values of RNA extracted by one step method
and SDS method were bigger than 2.0 , and that by kit method was smaller than 2.0.The CTBA method is suitable to extract total RNA of W.japonica
leaf ,with better quality and can be used in the subsequent molecular biological experiments such as cDNA synthesis and library construction.
Key words　Woodwardia japonica(L.f.)Sm leaf;Total RNA;Extraction
作者简介　于秀霞(1980-),女 ,河南开封人 ,硕士研究生, 研究方向:
抗菌肽功能与应用。 ＊通讯作者 , E-mai l:rqp2200070@ya-
hoo.com.cn
收稿日期　2007-07-30
　　狗脊蕨[Woodwardia japonica(L.f.)Sm]为乌毛蕨科多年
生草本植物 ,在中国分布广泛 。狗脊蕨的干燥带叶柄残基的
根茎又称狗脊贯众 ,临床上用于治疗感冒 、疮痈肿毒 、虫积腹
痛 、便血 、血崩等症[ 1] 。近年来国内外学者对狗脊贯众化学 、
药理及临床应用进行了大量研究 ,证实其次生代谢产物有黄
酮类 、三萜类 、甾醇类 、狗脊蕨素 、山奈鼠李糖苷类等 ,具有抗
病毒 、抗菌 、子宫抑制 、促凝血等多方面的药理作用[ 2] 。目
前 ,开发成药物的狗脊贯众有效成分主要通过人工提取 ,传
统的有效成分分析和提取技术难以胜任。利用中药生物工
程技术获取有效成分是一条有效解决限制的方法 ,包括利用
基因工程等技术对次生代谢合成的关键酶基因进行调控 ,或
将濒危的药用植物转基因药材成分进行高效表达和生产 ,以
解决药物资源短缺问题并获得更多的有效成分[ 3] 。笔者以
狗脊蕨叶的叶片组织为材料 ,获得高质量 RNA ,旨在构建高
质量的狗脊蕨叶 cDNA文库以保存珍贵基因资源 ,为克隆和
研究与有效成分合成相关的基因提供技术参考。
1　材料与方法
1.1　材料　幼嫩的贯众叶片 ,以 3 g为单位分装 ,液氮速冻
后转至-80 ℃冰箱保存。
1.2　方法　使用的玻璃器皿在 180 ℃烘烤 6 h 。枪头 、离心
管等在 0.1%DEPC水中浸泡 24 h ,再 121 ℃高压灭菌 30 min。
药品均用 DEPC水配制 。
1.2.1　按天泽基因公司公司“植物RNA抽提试剂盒”说明书
的方法。
1.2.2　CTAB法[ 4] 。将新鲜叶片置于预冷的研钵中 ,加入适
量 PVP ,然后加液氮研磨至粉末。取约 0.2 g粉末快速移入
预冷的离心管中 ,加入 600μl 65 ℃预热的CTAB 提取缓冲液
(2.0mol/L NaCl ,0.1mol/L Tris-HCl ,pH 8.0 ,20 mmol/L EDTA ,
2 %CTAB ,2 %PVP ,2 %β-巯基乙醇),立即大力震荡 30 s至
材料混匀 ,于 65 ℃温浴 5 min ,其间剧烈震荡 3 次。冷至室
温 ,加入 600 μl氯仿/异戊醇(24∶1)漩涡震荡 1 min ,室温
10 000 r/min离心 15 min;取上清 ,重复抽提一次 。转移上清
液至一新离心管中 ,加 8 mol/L LiCl ,至终浓度为 2 mol/L ,混
匀 , 4 ℃沉淀过夜。次日 4 ℃12 000 r/min离心 15 min ,弃上
清 ,用 100 μl 70 %乙醇洗涤沉淀;沉淀微干后加入 500 μl预
热的 SSTE缓冲液溶解沉淀 ,加入等体积氯仿/异戊醇再抽提
2次 。转移上清至新离心管 ,然后加入 0.25倍体积的异丙
醇 ,混匀后 ,室温静置 10 min;4 ℃12 000 r/min 离心 10 min 。
RNA沉淀用 70 %乙醇漂洗两次 ,重复上述离心 。小心弃乙
醇 ,晾干 RNA ,不能让 RNA 干透;加 50 μl 0.1 %的 DEPC 水
溶解 。
1.2.3　一步法。按Trizol 试剂盒的提取步骤。将 100 mg新
鲜贯众叶片用液氮研磨 ,加入 1 ml Trizol试剂 ,彻底匀浆后转
移至 1.5 ml的离心管中 ,颠倒混匀 ,样品体积不超过Trizol试
剂的 10 %。冰上温育匀浆样品 5 min ,每管加入 200 μl的氯
仿 ,剧烈摇荡 15 s 。冰上静置 2 ～ 3min ,4 ℃12 000×g离心 15
min。转移上层水相至一新离心管中 ,加入 0.5 ml异丙醇 ,室
温静置 10min ,4 ℃12 000×g离心 10min 。弃上清 ,加入 1 ml
预冷的 75 %乙醇 ,混匀 ,4 ℃下 7500×g离心 5 min。弃上清 ,
室温干燥 5 ～ 10 min 。将 RNA溶于无 RNA酶水中。
1.2.4　酚-SDS法[ 5] 。先向离心管加入 800 μl 抽提缓冲液
(0.18 mol/L Tris ,0.09mol/L LiCl ,4.5 mmol/L EDTA ,1%SDS ,
pH值 8.2),300μl水饱和酚和 300 μl氯仿 。将材料用液氮研
磨至粉末 ,取约 100 mg粉末转移至装缓冲液的离心管 , 50 ℃
安徽农业科学, Journal of Anhui Agri.Sci.2007, 35(33):10615-10616　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　罗芸　责任校对　李洪
水溶温育 30 min。于 4 ℃下 12 000 r/min离心 20min ,转移水
相至新离心管中 ,加入 1/ 3体积水饱和酚和 1/ 3 体积氯仿 ,
混匀。重复上述步骤 ,至无界面物质。取水相至新的离心管
中 ,加入 8mol/L LiCl ,至终浓度 2 mol/L , 4 ℃沉淀过夜。用 2
mol/L LiCl洗沉淀 1次。然后沉淀加入 340 μl DEPC 水溶解
和 1/ 3体积的 8 mol/L LiCl沉淀 , 4 ℃、12 000 r/min 离心 20
min。再用 2mol/L LiCl洗沉淀 1次 ,并干燥样品。适量DEPC
水重悬沉淀 ,并加入 1/10体积 NaAc和 2倍体积无水乙醇 ,
-20 ℃沉淀 2～ 3 h。4 ℃、12 000 r/min离心 15 min ,去上清 ,
加适量DEPC水溶解 RNA 。
2　结果与分析
2.1　总 RNA经分光光度法检测分析　从表 1可见:4种方
法提取 RNA得率差别不大 ,但是 RNA纯度不同。一步法和
SDS法 OD260/OD280 >2.0 ,说明存在酚类污染 ,且 RNA有褐
变现象;试剂盒法 OD260/OD280<2.0 ,说明酚类 、多糖 、胍盐等
污染;CTAB 法提取的总 RNA OD 260/OD 280为 2.012 ,纯度较
高 ,可用于进一步的分子生物学实验。
　　表 1 不同方法对提取狗脊蕨叶片总RNA质量的影响
方法 OD260 OD280 OD260/OD280 含量∥μg/μl
CTAB法 1.664 　　0.827 　　2.012 　　52.27
试剂盒法 0.186 0.101 1.841 47.40
一步法 0.288 0.134 2.149 63.03
SDS法 0.212 0.099 2.141 67.75
　注:表内数据为 3次重复的平均值。
注:1.CTAB 法;2.天泽基因
公司试剂盒提取法;3.
SDS法;4.Trizol 试剂法.
图 1　总 RNA的电泳
2.2　总 RNA的电泳鉴定分析　
由图 1可见 ,这 4种方法都能提取
出 18 S、28 S的RNA ,但是CTAB法
和天泽基因公司试剂盒法提取的
总RNA质量较高 ,条带清晰 ,带型
整齐一致 ,RNA无明显降解 ,完整
性较好。而且 CTAB 法还提取出
清晰的 5 S RNA ,一步法和 SDS法
带型模糊 ,有降解现象。
3　讨论
从植物组织中提取高质量
RNA是进行植物分子生物学研究的前提。要进行 Northern
杂交 , cDNA文库 ,RT-PCR及mRNA差示分析等分子生物学
实验 ,都需要高质量的 RNA[ 6] 。由于贯众中含蛋白质 、多糖
及酚类 、萜类 、黄酮类等次生代谢物较多 ,这些物质易与 RNA
结合 ,形成沉淀使 RNA不易分离 ,大大增加了提取高质量
RNA的难度。
经过比较几种提取方法发现 ,天泽基因公司试剂盒法提
取的 RNA 条带清晰 ,纯度较高 ,但是不能完全除去酚类 、多
糖及蛋白质的污染 ,还存在褐化现象;Trizol 试剂法能快速从
组织细胞中提取总 RNA ,用高浓度的异硫酸氰胍裂解细胞 ,
并抑制RNase的活性 ,通过氯仿去除蛋白质 ,用异丙醇沉淀
RNA ,但是不能去除色素的污染 ,也不能抑制酚类的氧化 ,导
致提取的RNA出现褐变现象 ,氯仿抽提不能完全去除蛋白
质的污染;SDS法主要是去污剂 SDS能使核蛋白与核酸复合
物分离 ,利用氯仿异戊醇抽提去除蛋白质 ,但是氯仿异戊醇
的多次抽提会降低 RNA提取量 ,且此法不能除去色素污染
以及抑制酚类氧化 ,导致提取的 RNA褐变;CTAB 是一种阳
离子强去垢剂 ,利用较高浓度的CTAB 能对植物细胞有较好
的裂解作用且能有效地分离核蛋白与核酸的复合物。笔者
在液氮研磨时加入抗氧化剂PVP阻止了酚类的氧化 ,避免了
RNA褐变现象;加入 β-巯基乙醇使蛋白质变性 ,抑制 RNase
的活性 ,使用无水乙醇或异丙醇沉淀总核酸 ,利用高浓度的
LiCl溶液除去多糖选择性地分离出 RNA 。
试验表明 ,CTAB提取法操作简单 ,能快速有效地提取贯
众总 RNA ,得到的总 RNA条带完整 、分明 、清晰 ,OD260/OD280
值 1.93～ 2.06 ,说明提取的总 RNA质量较好 ,纯度很高 ,完整
性很好 ,既未被降解也没有被多糖及蛋白质污染。为日后进
行 RT-PCR 、构建 cDNA文库 、cDNA克隆打下了坚实的基础 。
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10616 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2007年