全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第4期
收稿日期:2007-12-17
作者简介:肖硕(1974-),女,主管药师,在读研究生,研究方向:农业害虫与生物防治
通讯作者:洪华珠,电子信箱:hzhong@mail.ccnu.edu.cn
狭义的基因工程即重组 DNA技术,其基本过
程主要包括以下的 5个方面:l)从供体细胞中分离
出基因组 DNA,用限制性核酸内切酶分别将外源
DNA(包括外源基因组和目的基因)和载体分子切
开(简称切);2)用 DNA连接酶将含有外源基因的
DNA片段接到载体分子上,形成 DNA重组分子
(简称接);3)借助于细胞转化手段将 DNA重组分
子导入受体细胞中(简称转);4)短时间培养转化细
胞,以扩增 DNA重组分子或使其整合到受体细胞
的基因组中(简称增);5)筛选和鉴定转化细胞,获
得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞
(简称检)。作为现代生物工程的关键技术,基因工
程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达,基
因工程菌(细胞)即是现代生物工程中的微型生物
反应器。
用于重组 DNA技术中的宿主细胞既有原核生
物,又有真核生物,典型的宿主细胞如:大肠杆菌
(Escherichiacoli)、酿酒酵母等。在重组基因工程菌
培养过程中,遇到的主要问题有:l)有机酸类代谢
副产物积累并抑制菌体生长和产物的表达;2)大规
模及高密度培养过程的供氧限制;3)外源基因高表
达引起宿主细胞生理负担过重;4)质粒不稳定性问
题。其中,质粒的稳定性研究尤为重要,对于一定结
构的基因工程菌而言,提高质粒的稳定性对于基因
产物的生产及科学研究具有重要意义,就基因工程
菌中影响质粒稳定性的因素及提高稳定性的策略
展开综述。
1 质粒不稳定性的定义及类型
重组质粒的不稳定性,是指重组菌在培养过程
中发生突变或丢失,结果使重组菌失去了原有的表
型特征。依据重组质粒的变化本质,质粒不稳定性
可分为结构不稳定性、分离不稳定性。质粒的结构
不稳定主要是由于 DNA的插入、缺失或重排等引
起的不稳定,使目的基因功能丢失,但对质粒主要
基因工程菌中重组质粒的稳定性研究进展
肖硕 洪华珠 彭建新
(华中师范大学昆虫学研究所,武汉 430079)
摘 要: 基因工程菌(细胞)是现代生物工程中的微型生物反应器,是基因工程的研究主体之一。获得使外源基因
高效稳定表达的基因工程菌或细胞是基因工程的核心步骤与最终目的。基因工程菌重组质粒稳定性问题是基因工程菌
工业化生产与实验研究中的最主要问题,就其在基因工程中的重要性、影响因素及提高稳定性策略方面作简要介绍并展
开综述。
关键词: 基因工程 重组质粒 稳定性 策略
ResearchProgressonPlasmidStabilityinRecombinant
XiaoShuo HongHuazhu PengJianxin
(InstituteofEntomologyCentralChinaNormalUniversity,Wuhan430079)
Abstract: Recombinantissubminiaturebioreactorinmodernbiologicalengineeringandoneofprincipalpartof
geneengineering.Toobtainsteadyheterologousgeneproductisthehardcorestepandfinalaim.Plasmidstabilityof
recombinantisthemostimportantproblem ofindustrializedproductionandexperimentresearch.Thearticleintroduced
andSummarizeditsimportance,influencingfactors,improvingstrategies.
Keywords: Geneengineering PlasmidofrecombinantStability Strategy
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
遗传标记丢失影响较小[1]。质粒的分离不稳定是细
胞在分裂后分离时引起的不稳定,由于质粒在子代
细胞中的不均匀分配而使部分细胞不含质粒,是质
粒丢失的主要原因。质粒的分离不稳定性常出现在
两种情况,一是传代质粒只在许多世代之后才明显
产生丢失[2];二是带有质粒的细胞与无质粒细胞有
不同的生长速率导致。外源基因载体 DNA的存在
犹如细胞内存在多拷贝的质粒一样,对宿主是一种
代谢负担,当外源基因大量产生特异蛋白时,这种
代谢压力就变得更加严重。一般条件下,带有重组
质粒的宿主菌的生长速率低于无质粒的细菌,由
此,质粒的稳定性伴随着生长速率的不同而变化。
基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大的
影响,在连续培养时,发现在低比生长速率(0.302h-1)
下重组质粒只可以完全维持 20代。O’Kennedy等
(1995)发现,在复合培养基和基本培养基中,重组
酿酒酵母的质粒稳定性和比生长速率的关系不同。
在葡萄糖限制的复合培养基中,质粒丢失速率随稀
释率的增加而增大,但是在葡萄糖限制的基本培养
基中则相反[3]。
2 质粒不稳定性的影响因素
2.1 宿主细胞的遗传特性
重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞
遗传特性的影响。相对而言,重组质粒在大肠杆菌
中比较稳定,在枯草杆菌和酵母中较不稳定,但是
也有例外。黄立志等发现外源 NK基因的导入对宿
主 E.coliHB101与 yeastPichiaGS115DE生长没有
明显影响,重组质粒 Pbv220-NK在大肠杆菌中结构
稳定性有待提高,而在毕赤酵母中稳定性很好[4]。
2.2 质粒的特性
在重组菌细胞中,质粒载体的大小与拷贝数是
影响质粒分离不稳定的重要因素。插入 DNA片段
的大小及特性等在质粒分离不稳定性中有关系,一
般小的片段质粒比较稳定[3]。对于松弛型质粒载体,
一般情况下,伴随着细胞分裂,质粒以随机方式分
配到子粒细胞中,质粒拷贝数越高,出现无质粒载
体细胞的概率就越低,质粒就越稳定,而质粒载体
的寡聚化效应会导致质粒载体拷贝数大大降低,从
而加重质粒的分离不稳定性[5,6]。MicheleE.Gahan
等研究发现口腔减毒疫苗菌株 BRD质粒拷贝数降
低影响质粒稳定性及人类特异性免疫反应的降低[7]。
2.3 调控突变、培养条件等
外源基因的调控突变、培养条件及质粒中所携
带的外源基因性质、重组菌的生长速率、外源基因
的表达水平等因素都是影响质粒稳定性的因素,有
些需要在质粒设计和构建时仔细考虑,有些则与培
养过程有关。
3 提高质粒稳定性的策略
3.1 质粒的选择
为了构建稳定的结构体,最好利用小的质粒,
小的质粒在高密度发酵中遗传性状比较稳定,而大
的质粒往往由于发酵环境中各种因素的影响,而出
现变异的几率较高[3,8]。Kim等报道,用穿梭质粒克
隆大肠杆菌 DNA片断,转化大肠杆菌,重组质粒能
稳定地传代;而转化 Pseudomonasputida后,重组质
粒在传代过程中发生分离[9]。
3.2 选择合适的插入片段或重新构建表达载体
Bion和 Luxen报道,插入 DNA片断的大小,在
质粒分离不稳定性中有关系。他们酶切同源和外源
染色体 DNA,得到大小不同的片断,与穿梭质粒
pwB110重组。得到两个重组质粒 pLB2(3.6kb)和
pLB5(5.9kb),转入枯草杆菌后,重组质粒的稳定性
表现出和插入 DNA片断大小有关。而转入大肠杆
菌,重组质粒却不表现出这种相关性[3]。赵月娥等
对人 tPA基因进了重建,保留了 F、G和 P区并引
入突变,构建了 K1,K2区缺失突变的重组 tPA质
粒 pQE30,并在大肠杆菌 JM109菌株中成功表达。
从理论上分析与实验数据均显示,由于重建的 tPAr
基因的 DNA长度减少了 40%,克隆并导入宿主菌
后,具有更高的遗传稳定性[12]。
parDE基因的插入,可提高重组质粒稳定性。
莫志伟等将 parDE基因插入到 pST1021等质粒上
可以提高重组质粒的遗传稳定性,提高基因工程菌
的应用效果[10]。赵立平等也利用 RK2质粒的 parDE
片段提高重组质粒在生防菌成团泛菌中的稳定
性[11]。
3.3 选择适当的宿主细胞
重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞
遗传特性的影响。相对而言,重组质粒在大肠杆菌
中比较稳定,在枯草杆菌和酵母中较不稳定,但是
10
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也有例外[4]。同一宿主菌株对不同质粒的稳定性不
同,而同一质粒在不同宿主菌株中的稳定性也有差
别。因此对于不同的表达系统、外源基因表达产物
的性质、表达产物是否需要进行后加工及其复杂程
度将决定宿主菌的选择,如真核或原核生物、蛋白
酶缺陷型或营养缺陷型等的宿主菌。
3.4 添加选择压力
重组菌的稳定性受遗传及环境因素两方面的
控制,所以可以通过基因水平的控制来限制反应器
中无质粒细胞的繁殖以提高系统中含质粒细胞的
比例。在重组菌培养过程中通常采用增加“选择压
力”来提高重组菌的稳定性。“选择压力”通常包括:
1)在质粒构建时,加入抗生素抗性基因,在生物反
应器的培养基中加入抗生素以抑制无质粒细胞(P-)
的生长和繁殖;2)利用营养缺陷型细胞作为宿主细
胞,构建营养缺陷型互补质粒,设计营养缺陷型培
养基抑制无质粒细胞(P-)的生长和繁殖;3)噬菌体
抑制及转化子中自杀蛋白的表达,在含“选择压”的
培养基中培养基因工程菌可以有效地抑制 (P-)细
胞的生长和繁殖,提高质粒稳定性。这种方法对于
质粒或宿主细胞本身发生了突变,虽保留了选择性
标记、但不能表达目的产物的细胞无效。史悦等发
现质粒 PETNHM在无抗生素选择压力下,连续传
代 48代后质粒丢失的无质粒细胞开始出现,进一
步研究表明,卡拉霉素的选择压力能够保证质粒的
稳定遗传[5]。
3.5 控制培养条件
3.5.1 培养基组成 培养基组成成分及其比例对
质粒的稳定性影响较大,Jones和 Meling研究了连
续培养中 E.coli中几种质粒的稳定性,分别以葡萄
糖、磷酸盐和无机盐作为限制性基质,发现除
pBR325外的大部分质粒在以磷酸盐为限制性基质
时很快丢失[13]。周宇荀等也发现抗菌肽基因 Adeno
regulin(ADR)培养基中适当加入葡萄糖,对质粒的
稳定性及蛋白表达量有重要作用[14]。
3.5.2 氧传递和搅拌 对固定化重组工程菌菌培
养来说,氧传递受固定化胶粒屏障和胶粒表面高浓
度细胞的限制,搅拌速率影响着培养液内的氧供应
和对菌体的剪切力,强烈搅拌使固定化胶粒内细胞
浓度明显减少,质粒稳定性也显著降低,温和的搅
拌速率适于保存质粒的稳定性。在搅拌罐发酵时,
质粒拷贝数通常比摇瓶培养低,原因是搅拌罐中有
较好通气,生长速率较高,染色体复制增加,当溶解
氧强度在非选择性培养基中周期变化时,重组酵母
连续培养质粒稳定性强烈依赖于培养的生长速率,
在较低生长速率下完全稳定,提高氧压力或增加氧
浓度能引起细胞内氧化性胁迫,而过渡或稳定阶段
缺氧条件引起氨基酸生产和质粒稳定性受限制[15]。
3.5.3 温度和 pH 有的质粒属温度敏感型质粒,
如农杆菌质粒,当农杆菌培养温度超过 30℃,即引
起质粒丢失[16];KwangH.Son等也发现培养温度处
于 30℃～44℃时,巨大芽孢杆菌 PCK108质粒结构
基本稳定,而且其目的产物——纤维素酶产量比
30℃时显著提高,但 30℃时质粒稳定性较强[17]。对
于温度敏感型质粒,为了控制在生长前期其外源基
因不表达,一般采用二阶段温度培养系统,即在菌
体生长阶段,采用较低的培养温度,当菌体生长至
适宜浓度和生长时期时,提高温度进行诱导,使外
源基因表达。与一般微生物发酵相似,重组工程菌
的生长和产物合成时的 pH值往往不同,如重组
Lactococcuslactissubsp.Lactis(pIL252)对生长和质
粒稳定性的最适 pH值分别为 6.39和 6.41[18]。
3.5.4 选择合适的培养操作方式
3.5.4.1 适当采用流加操作方式 不同流加方式
对质粒的稳定性影响也较大。在研究生产重组葡聚
糖酶的枯草杆菌质粒稳定性时发现,周期性分批流
加的酶产量和质粒稳定性高于间歇培养和恒化器
培养,周期 2～4h,质粒稳定;大于 6h,质粒丢失增
多,而间歇性培养和恒化器培养时质粒很快丢失[19]。
另外,选择合适的流加方式可提高质粒在非选择性
培养基中的稳定性和工程菌的产量[20]。
3.5.4.2 连续培养 连续培养的方式很多,一种选
择性循环反应器在连续培养过程中采用诱导方法
使含质粒细胞在分离器中絮凝,而细胞生长和产物
合成在主发酵罐中进行,循环过程将目的菌株(含
质粒菌株)和非目的菌株(不含质粒或杂菌)分开,
富集重组菌或生产菌,能使含质粒细胞占优势并能
高速合成外源蛋白。连续培养的稀释速率对质粒稳
定性有显著影响。对含重组质粒 PLG669-2的酿酒
酵母研究发现,稀释速率周期变化时,周期的振幅
肖硕等:基因工程菌中重组质粒的稳定性研究进展 11
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
和频率是质粒稳定性的重要参数[21]。
3.5.4.3 固定化培养 细胞固定化是在固定化酶
技术的基础上发展起来的,细胞的固定化方法可以
分为吸附法、包埋法、交联法及共价法等。由于大部
分细胞在固定化后仍可以保持生长繁殖能力,因
此,大多数研究工作都集中在吸附法和包埋法。固
定化细胞的主要优点是:细胞可以重复或连续使
用,可以提高生产效率;另外,细胞固定化后,可以
为细胞创造一个适宜的局部环境 (如温度、pH、剪
切力等),有利于细胞的生长和产物表达。对于基因
工程菌而言,相对于游离细胞悬浮培养,固定化细
胞培养可以有效克服或减少质粒不稳定现象,特别
用非选择性培养基时,固定化细胞培养系统可提高
反应器产率,得到高细胞浓度和高产物。在固定化
细胞培养体系中,重组质粒稳定性得到提高,但其
机理还不是很清楚,主要原因可能有:l)固定化细
胞的生长速率下降;2)细胞的区域化分布;3)固定
化材料的物理结构和化学性质影响质粒稳定性,使
得质粒的分离不稳定性得到改善,不含质粒细胞的
生长优势减少,使质粒稳定性高于游离细胞培养[6]。
在细胞固定化方法及固定化细胞反应器的研究中,
应该注意尽可能地应用最简单的固定化方法及与
其相匹配的最优生物反应器。中空纤维反应器、固
定床反应器、三相流化床反应器等就是其中的典型
例子,这些反应器有些己经工业化应用,有些还处
于实验室或工业化实验研究阶段。
4 存在的问题及展望
虽然提高质粒稳定性的研究有了很多成功实
例,但因基因工程菌的培养与发酵受诸多因素与条
件的影响,而且随机性和可变性大,要在实验条件
下使基因工程菌的质粒保持稳定的遗传性状,仍存
在各种工程问题有待于解决。由于基因工程菌的多
样性,所采用的手段常缺乏通用性,研究的特定体
系,一般要采取具有针对性的措施,才能获得较好
的效果。随着基因工程及分子生物学技术的进一步
发展,将会从根本上解决基因工程菌中质粒稳定性
的问题,为外源基因高效稳定表达提供坚实的基
础。
参考 文献
1 SeoJH,BaileJE.BioteehnolBioeng,1985,27:1688~1675.
2 邱晓颖,朱红惠,卢秋雁,等.高技术通讯,1998,6:52~55.
3 夏诏杰.提高重组质粒稳定性和蛋白质产率的培养策略研究
[硕士论文].西安:西北大学,2002,3~4.
4 黄志立,罗立新,杨汝德,等.广东药学院学报,2001,17(4).
5 史悦,于慧敏,田卓玲,等.中国生物工程杂志,2005,25(8):
70～75.
6 ClaireBalding,IanBlaby,DavidSummers.PlasmidVolume,2006,
56:68~73.
7 MicheleE,Gahan,DianeE.Webster,StevenL.Wesselingh,Vaccine,
2007,25:1476~1483.
8 陆国谨.北京轻工业学院学报,1995,13(2):40~43.
9 KimSH,RyuDDY.BioteehnolBioeng,1984,26:497~502.
10 莫志伟,张燕,张紫莱,等.应用与环境生物学报,2002,8(5):
528～531.
11 赵立平,张丽,李艳琴,等.中国生物防治,1999,15(2):49～
53.
12 贺石汉.武汉大学学报(理学版),2003,49(4):497~500.
13 陈新爱.基因工程菌培养若干重要问题的研究 [博士学位论
文].杭州:浙江大学,2002.
14 周宇荀,曹巍,魏东芝,等.生物工程学报,2005,7(4)21.
15 KongJO,KingJ,CooneyCL.BiotechnologyProgress,1998,14(3):
393～409.
16 林栖凤.植物分子育种.北京:科学出版社,2004,223~259.
17 KwangHSon1,JongHJang1,JungH.BiotechnologyLeters,1987,
9:821~824.
18 BealC,DAngioC,CorieuG.BiotechnologyLeters,1998,20(7):
679～682.
19 ArgyropoulosD,LynchHC.BiotechnologyTechniques,1997,56(1):
23～31.
20 刘志伟,郭勇.微生物学通报,2001,28(2):86~89.
21 KhasarS,PaulFG,DavidAM.JournalofBiotechnology,1996,
45(3)205～210.
12