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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
藏红花细胞悬浮培养动力学研究
陈书安1，2 王晓东1 袁晓凡1 赵兵1 王玉春1
(1中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室，北京 100190;
2中国生物技术发展中心，北京 100036)
摘 要: 基于已经建立的藏红花细胞悬浮培养体系，研究了其悬浮培养动力学。结果表明，悬浮培养时细胞的生长周
期约为 20 d，在 20 d时生物量达到最大，为 12. 3 g DW/L，但是藏红花素的合成周期大约为 28 d，在 28 d时藏红花素的含量和
产量达到最大，分别为 95. 8 mg /g和 0. 92 g /L。藏红花素的积累与细胞的生长之间的关系为半生长偶联型，为其生物反应器
放大培养提供了参数等理论依据。
关键词: 藏红花 悬浮 培养体系 动力学 生物反应器
Investigation on the Kinetics of Crocus sativus L. Cell in
Suspension Culture System
Chen Shu-an1，2 Wang Xiaodong1 Yuan Xiaofan1 Zhao Bing1 Wang Yuchun1
(1National Key Laboratory of Biochemical Engineering，Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，
Beijing 100190;2The China National Center for Biotechnology Development，Beijing 100036)
Abstract: Based on the established cell suspension culture system of Crocus sativus L．，its kinetics was investigated． The highest
biomass reached 12. 3 g DW/L on 20th d，and the highest crocin content and production were obtained on 28th d，both of which were
95. 8 mg /g and 0. 92 g /L，respectively． The process of croin biosynthesis was semi-associated with the cell growth of Crocus sativus L． ．
This research could provide references for the scale-up culture of Crocus sativus L． cell by bioreactor．
Key words: Crocus sativus L． Suspension Culture system Kinetics Bioreactor
收稿日期:2010-09-13
基金项目:中国科学院“西部行动高新技术项目”(KGCX-YW-509)
作者简介:陈书安，男，博士，副研究员，研究方向:生化工程和微生物工程;E-mail:chenshu@ cncbd. org. cn
通讯作者:赵兵，研究员，博士生导师，E-mail:bzhao@ home. ipe. ac. cn;王玉春，研究员，博士生导师，E-mail:ycwang45@ yahoo. com
藏红花(Crocus sativus L．)被誉为“植物黄金”，
是一种名贵的妇科良药，其柱头含有具有良好抗癌
作用的藏红花素等活性成分，有望成为理想的抗癌
药物［1 － 3］。由于藏红花主要是柱头入药、种植条件
苛刻、适宜栽培的地区有限、田间栽培过程易感染病
毒、产量极低，致使其资源短缺，价格昂贵。通过植
物细胞培养体系生产藏红花素等，是解决藏红花资
源短缺的有效途径之一［3，4］。
为建立藏红花细胞培养体系，本实验室从诱导
的 229 株藏红花愈伤组织中筛选出一株藏红花素含
量较高、生长快速的细胞系［5，6］，经脱毒处理，该细
胞系无国内外报道的侵染藏红花的病毒［7］;通过摇
瓶法，建立其固体和液体培养体系［8，9］。本试验研
究藏红花细胞悬浮培养过程中细胞的生长和次生代
谢产物的积累，以及细胞的生长速率等由摇瓶放大
到生物反应器培养的关键参数，为其生物反应器放
大培养提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
藏红花细胞系:球茎 1 细胞系，黄色，质地疏松，
不透明［5，6］。
1. 2 培养基
以 B5［10］为基本培养基，添加 1 mg /L 6-苄氨基
嘌呤(6-benzyladenine，6-BA) ，2 mg /L a-萘乙酸
(naphthaleneacetic acid，NAA) ，吲哚乙酸(indole-3-
acetic acid，IAA)和 300 mg /L 水解酪蛋白(casein
2011 年第 4 期 陈书安等:藏红花细胞悬浮培养动力学研究
hydrolysate，CH) ，以下简称 M2B5 培养基。
1. 3 生物量的测定方法
将藏红花细胞悬浮培养液，经 3 500 r /min 离心
20 min，取离心沉淀的细胞置于烘箱，60℃烘干至恒
重，称得其干重即为生物量。
1. 4 藏红花素含量测定方法
将藏红花细胞悬浮培养液，经 3 500 r /min 离心
20 min，回收上清液;将离心沉淀的细胞用 20 mL
50%的甲醇在室温下振荡(100 r /min)提取 2 h 后，
经 3 500 r /min 离心 20 min，回收上清液;将二次离
心沉淀的细胞再用 10 mL 50%的甲醇在室温下振荡
(100 r /min)提取 1 h，3 500 r /min离心 20 min，回收
上清液。合并上述 3 次离心回收的上清液，经真空
浓缩直至 1 mL以下，膜过滤(0. 22 "m)后于 HPLC
测定。
藏红花素的检测色谱柱:Nucleosil C18(3. 9 #
150 mm，5 "m 粒度) ;紫外可见光检测器(波长范围:
190 －800 nm) ;检测波长:440 nm;流动相:53%甲醛
溶液;流速:0. 7 mL/min，进样量:10 "L。
2 结果与分析
2. 1 藏红花细胞悬浮培养时细胞的生长和藏红花
素的合成曲线
按 5%的接种量将藏红花细胞接入 M2B5 液体
培养基，放置 120 r /min 的摇床上，(22 ± 0. 3)℃全
时暗培养，藏红花细胞悬浮培养的生长和藏红花素
的合成曲线如图 1 所示。
图 1 表明，和微生物细胞的生长曲线相似，藏红
花悬浮细胞的生长周期也分为延滞期、对数生长期、
稳定期和衰亡期。在 0 － 8 d这一阶段，细胞处于延
滞期，生长缓慢，藏红花素的合成代谢也没有开始，
在此阶段细胞主要进行初级代谢，为细胞的进一步
分裂、增殖做准备。第 8 天后藏红花细胞开始进入
对数生长期，生物量快速增长，到第 20 天时达到最
大，生物量为 12. 3 g DW/L;此阶段的16 － 20 d，藏
红花素的合成也开始。藏红花细胞的平衡期很短，
第 20 天后很快就进入到衰亡期，细胞逐渐褐化、死
亡，但是藏红花素的合成还在继续，到 28 d 时藏红
花素的产量达到最大，为0. 92 g /L。
图 1 悬浮培养时藏红花细胞的生长和合成曲线
2. 2 细胞生长速率和比生长速率
藏红花细胞悬浮培养过程中生长速率和比生长
速率如图 2 所示。
图 2 藏红花细胞悬浮培养过程中细胞
生长速率和比生长速率的变化曲线
培养过程中细胞的生长速率 γx = dX /dt≈△X /
△t，比生长速率 μ = 1 /X·dX /dt≈1 /X·△X /△t，
其中 X表示细胞浓度(g /L) ，t 表示培养时间(d)。
从图 2 可见，在延滞期(0 － 8 d) ，细胞的生长速率和
比生长速率较低;到对数生长期，生长速率和比生长
速率迅速增加。第 16 天时达到最大，生长速率和比
生长速率分别为 0. 9 g /(L·d)和 0. 123 /d，然后迅
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
速降低。
2. 3 藏红花素生成速率和藏红花素比生成速率
培养过程中藏红花素生成速率为 γp，比生成速
率 Yp /x = γp /X。藏红花细胞悬浮培养过程中的藏
红花素生成速率和比生成速率变化如图 3 所示。
在细胞延滞期(0 － 8 d)和对数生长的前期
(8 － 12 d) ，藏红花素的生成速率和比生成速率基
本上为 0;在细胞进入对数生长后期(12 － 16 d)时，
藏红花素的生成速率和比生成速率开始增加;当在
细胞进入稳定期和衰亡期(20 － 24 d)时，藏红花素
的生成速率和比生成速率继续增加，并在第 24 天藏
红花素生成速率达到最大，为 0. 079 g /(L·d) ;在
第 28 天藏红花素比生成速率达到最大，为
0. 007 /d。
图 3 藏红花细胞悬浮培养过程中藏红花素
生成速率和比生成速率变化曲线
2. 4 细胞生长和藏红花素生成的关系
产物生成和细胞生长之间的关系可表述为产物
比生成速率和细胞比生长速率之间的关系:Yp /x =
αμ + β，式中 α为与生长相关的产物生成系数，β 为
与生长非相关的产物生成系数。
藏红花细胞的比生长速率与藏红花素的比生成
速率之间的关系见图 4。直观分析图 4，藏红花细胞
的比生长速率与藏红花素的比生成速率之间的关系
不是十分清楚，为了更加清楚地了解它们之间的关
系，将藏红花比生长速率与藏红花素的比生成速率的
曲线分成两个时期分别绘制，一个是稳定期以前(4 －
20 d)的曲线(图 5) ;另一个是稳定期以后(20 －28 d)
的曲线(图 6)。
图 4 藏红花细胞比生长速率和
藏红花素比生长速率的关系
图 5 表明，在稳定期以前(4 － 20 d)藏红花素的
比生成速率(Yp /x)随着藏红花比生长速率(μ)的
增加而增加，在此期间它们之间关系可以用以下公
式表示:
Yp /x = 0. 01643μ － 6. 2139 × 10 －4(R2 = 0. 935)
(式 1)
从式 1 可知，与生长相关的产物生成系数 α
(0. 01643)大于与生长非相关的产物生成系数 β
(－ 6. 2139 × 10 －4) ，因此在 4 － 20 d 藏红花素的合
成与细胞生长相关。
图 5 稳定期前藏红花细胞比生长速率和
藏红花素比生长速率关系的模拟曲线
图 6 表明，在稳定期以后(20 － 28 d)藏红花素
的比生成速率(Yp /x)随着藏红花比生长速率(μ)
的增加而减少，在此期间它们之间关系可以用以下
公式表示:
Yp /x = － 0. 0064μ + 0. 0065(R2 = 0. 990)
(式 2)
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从式 2 可知，与生长相关的产物生成系数
α(－ 0. 0064)小于与生长非相关的产物生成系数 β
(0. 0065) ，因此在 20 － 28 d藏红花素的合成与细胞
生长非相关。
图 6 稳定期后藏红花细胞比生长速率和
藏红花素比生长速率关系的模拟曲线
3 结论
根据对藏红花细胞悬浮培养过程中的生物量、藏
红花素含量随时间变化情况的分析，可以得出细胞悬
浮培养的动力学。悬浮培养时细胞的生长周期约为
20 d，在 20 d时生物量达到最大，为12. 3 g DW/L，但
是藏红花素的合成周期大约为 28 d，在 28 d 时藏红
花素的含量和产量达到最大，分别为 95. 8 mg /g和
0. 92 g /L。在细胞生长的稳定期以前，藏红花素合成
与细胞的生长相关，在稳定期以后藏红花素的合成和
细胞的生长非相关，因此藏红花素的积累与细胞的生
长之间的关系为半生长偶联型。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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