全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
番茄 LeDREB1转录因子基因
RNAi载体的构建和鉴定
王迎波 单曙光 王贺 王磊 白由路 程宪国
(中国农业科学院农业资源与农业区划研究所,北京 100081 )
摘 要: 利用 rd29A基因启动子的 DRE元件从番茄 (丽春 ) cDNA文库中通过酵母单杂交技术筛选得到转录因子基因
LeDREB1。核苷酸序列测定结果表明, 该基因片段全长 1 782 bp, 具有 900 bp的 cDNA开放阅读框序列,编码 300个氨基酸。
该基因属于 AP2 /EREBP家族 [ 1] , 可能调控许多逆境应答基因的表达。运用 RNA干扰的思路,设计特异性引物, 扩增正向和
反向基因片段。将 LeDREB1正向 +反向基因片段插入到 pCAMB IA2300OCS的 35s启动子下游, 构建干扰载体 pCAMRNA i
LeDREB1,通过酶切和测序鉴定证明目的片段与载体片段连接正确。这一载体的成功构建为进一步研究 LeDREB1的功能和
调控作用机制提供有效的材料与技术支撑。
关键词: LeDREB1 转录因子 载体构建 s iRNA 番茄
Identification and Construction of RNA Interfere Vector on Tomato
Transcription Factor Gene LeDREB1
W ang Y ingbo Shan Shuguang W angH e W ang L ei BaiYoulu ChengX ianguo
( Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese A cademy of A gricultural Sciences, Beijing 100081)
Abstrac:t T ranscr iption fac to r LeDREB1, w as iso lated by yeast onehybrid sy stem through the DRE cisacting elem ent in the pro
m oter o f rd29A gene hybr id izing a cDNA expression library o f tom ato seedlings. DNA sequence analysis show ed tha t the cloned fragm ent
consisted of 1 782 bp w ith an open read ing fram e of 900 bp encod ing 300 am ino acids. L eDREB1 be long s to AP /EREBP fam ily wh ich
m ight control the expression of stress response genes. Based on the idea o f RNA inte rference, a PCR fragm ent includ ing sense and anti
sense genew as obta ined using the specific pr im ers by PCR, and constructed the recomb inant p lasm id pCAMRNA iLeDREB1, the frag
m ent o f antisense gene+ p lussense genew as inserted to the downstream of 35S prom ote r in the bina ry vecto r pCAMB IA2300OCS. It
w as proved that the connection be tw een the goa l fragm ent and the vector fragm ent was correct by identifica tion o f enzym ecutting and se
quencing. Successful construction of pCAMRNA iLeDREB1 w ould prov ide effective supports for research m ater ia ls on function and
m echan ism o f gene LeDREB1 in the future.
Key words: LeDREB1 Transcription factor Vector construction siRNA Toma to
收稿日期: 20100201
作者简介:王迎波,女 硕士研究生,研究方向:植物转录因子; Em ai:l wangyingbo8849@ 163 com
通讯作者:程宪国,研究员,研究方向:植物营养与抗逆分子机制; Em ai:l chengxianguo@ tsinghua org cn
非生物胁迫因子如干旱、盐渍和低温,严重影响
着农作物的正常生长发育, 制约农作物的产量和质
量 [ 2]。而我们在抗旱、抗盐和抗低温冻害方面所取
得的进展并不如人意, 这就要求我们从提高农作物
本身的抗逆性角度出发, 改良作物品种 [ 3]。植物体
内逆境应答相关基因很多 [ 4, 5]。而目前对植物逆境
信号转导的研究中发现, 转录因子是一个很关键的
因素 [ 6- 8]。当转录因子感受到胁迫刺激后立即与基
因启动子区域的特异性顺式作用元件结合, 激活
RNA聚合酶 转录复合物, 增强下游基因在逆境胁
迫下的转录表达 [ 9] , 引起植物生理生化的改变 [ 10] ,
外界信号得到了传递与放大。由此可知,通过操纵
一个转录因子就可调控下游的多个与同类性状有关
的基因发挥作用。
2010年第 9期 王迎波等:番茄 LeDREB1转录因子基因 RNA i载体的构建和鉴定
通过 LeDREB1基因的生物信息学分析可知,番
茄 LeDREB1转录因子具有 DREB转录因子家族的
典型特征, 属于 AP2 /EREBP家族,该家族产物可激
活许多逆境应答基因的表达。 ProtFun预测表明,
LeDREB1蛋白的主要功能有参与植物的细胞周期、
生长发育以及生物和非生物胁迫相关的基因的表达
调控。
RNA干扰是指由双链 RNA ( dsRNA )介导, 特异
性降解内源性或外源性 mRNA, 导致靶基因的表达
沉默, 产生相应的功能表型缺失的现象。RNA干扰
属于转录后的基因沉默机制 ( posttranscriptional
gene silencing, PTGS), 故而注射该基因的内含子或
者启动子顺序的 dsRNA都没有干涉效应 [ 11- 13 ]。本
试验在设计特异性引物时避开了基因的启动子区域
和保守区域,期望使 RNA干扰效率达到最高。
本试验在分析了 LeDREB1蛋白结构的基础上,
选取 LeDREB1基因的一段大小为 260 bp非保守编
码序列为干扰片段来设计特异性引物, 提高 RNA i
载体的干扰效率及其干扰的特异性, 避免 LeDREB1
的同源基因沉默,符合本试验 RNA i片段的设计要
求。目前关于番茄 DREB基因的报道较少, 本试验
通过构建植物 pCAM RNA iLeDREB1载体, 为进一
步了解 LeDREB1基因的表达与调控机制提供技术
与材料支撑。
1 材料与方法
11 材料与试剂
质粒及菌株: pMD19T, 植物表达载体 pCAM
B IA2300, RNA i中间载体 pRNA i1017, 大肠杆菌
DH5等菌株均由本实验室保存。酶及主要试剂:
限制性内切酶 Xho I、Bgl II、Sal I、BamH I、P st I和
T4连接酶购自 NEB公司; 琼脂糖凝胶回收 K it和
Easy PureM in iP lasm id Purificat ion K it购自北京全式
金生物技术有限公司;氨苄青霉素 ( Amp)、卡那霉
素 ( K an)和利福平 (R if)抗生素购自 Sigma公司。引
物合成及测序工作由北京三博远志生物技术有限公
司完成。
12 LeDREB1基因的生物信息学分析
利用生物信息学数据库和因特网上的软件对
LeDREB1基因及其蛋白加以分析。用 Protparam分
析 LeDREB1蛋白的氨基酸序列组成、相对分子质量
和等电点等理化性质 ( http: / /auexpasyo rg / too l/
protparahtm l); 利用 SOPMA预测 LeDREB1蛋白的
二级结构组成 ( http: / /npsapb il ibcp fr /cg ib in /
npsa_automatp?l page= /NPSA /npsa_sopmahtm l);
利用 Scanprosite搜索 LeDREB1蛋白的 Motif ( ht
tp: / /us expasyorg /prosite / ) ; 用 ProtFun分析预测
LeDREB1蛋白的功能 ( http: / /www cbsdtudk /
serv ices/ProtFun / )。
13 大肠杆茵的活化和质粒的提取
取 1 mL含有质粒 LeDREB1pMD19T的大肠
杆菌菌液加入到 50 mL添加了 100 mg /mL氨苄青
霉素的新鲜液体 LB培养基中, 37! , 200 r /m in摇床
培养 10 h。参照全式金生物技术有限公司质粒提取
试剂盒说明书操作流程,提取质粒 LeDREB1pMD19
T。测定所提质粒的 OD260以确定其浓度。DNA浓
度 ( ng /L) = OD260 ∀ 50 ∀稀释倍数。
14 LeDREB1中间干扰载体 ( pRNA i1017LeDREB1)
的构建
141 PCR扩增获得正向和反向基因片段 设
计引物克隆 LeDREB1的一段特异 DNA ( 260 bp)
作为干扰片段。正向序列引入 Xho I和 Bgl II酶
切位点 (下划线部分 ) , 上游引物 LeDREB1RNA i
P1: 5# ccCTCGAGATggCTATTATggATgAA 3#; 下
游引物 LeDREB1RNA iP2: 5#gaAGATCTACAC
CgCCAATTTTCT3#。反向序列引入 Sal I和 BamH
I酶切位点 (下划线部分 ) , 上游引物 LeDREB1
RNA iP3: 5#gcGTCGACATggCTATTATggATgAA3#;
下游引物 LeDREB1RNA iP4: 5#cgGGATCCACAC
CgCCAATTTTCT3#。PCR 扩增目的片段, 反应体
系: LeDREB1pMD19T 05 L; LeDREB1RNA iP1 /
LeDREB1RNA iP3 1 L; LeDREB1RNA iP2 /Le
DREB1RNA iP4 1 L; 10 ∀ PCR buffer 5 L; dNTP
4 L; Taq酶 05 L; ddH 2O补至 50 L。反应程
序: 94! 预变性 3m in; 94! 变性 30 s, 56! 退火30 s,
72! 延伸 60 s; 30个循环; 72! 延伸 10 m in, 4! 保
温。引物合成及测序由北京三博远志生物技术有限
公司完成。
142 PCR产物酶切纯化 将测序鉴定正确的
PCR产物分别用内切酶 Xho I、Bgl II和 Sal I、BamH
I进行酶切, 载体 pRNA i1017用 Xho I和 Bgl II酶
107
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
切,酶切产物用凝胶回收试剂盒回收。
143 正向和反向基因片段与中间载体 pRNA i1017
的连接反应 将两端带有 Xho I和 Bg l II位点的 Le
DREB1正向片段插入到经相同酶切的 pRNA i1017
干扰载体上,构建重组质粒 pRNA i1017LeDREB1a。
10 L连接反应体系: pRNA i1017 DNA 1 L; Le
DREB1 DNA 4 L; 10 ∀ L igase Buffer 1 L; T4 DNA
L igase 05 L; ddH 2O补至 10 L。反应条件: 16!
过夜连接 (约 12 h)。连接产物转入大肠杆菌
DH5,附加 100mg /mL的氨苄青霉素的 LB固体培
养基上选择培养,挑取单菌落, 摇菌活化, 提取重组
质粒。用 Xho I和 Bgl II双酶切鉴定 LeDREB1基因
干扰片段是否正向连到 pRNA i1017载体上。
两端带有 Sal I和 BamH I位点的 LeDREB1反向
片段插入到经相同酶切的 pRNA i1017LeDREB1a重
组质粒上, 构建含有 LeDREB1正反向基因片段的
RNA干扰载体 pRNA i1017LeDREB1。 10 L连接反
应体系: pRNA i1017LeDREB1a DNA 1 L; LeDREB1
DNA 4 L; 10 ∀L igase Buffer 1 L; T4 DNA L igase 05
L; ddH 2O补至 10 L。反应条件: 16! 过夜连接 (约
12 h)。连接产物转入大肠杆菌 DH5,挑取单菌落,
附加 100mg /mL的氨苄青霉素的 LB固体培养基上
选择培养, 摇菌活化, 提取重组质粒。用 Sal I和
BamH I双酶切鉴定 LeDREB1基因是否反向插入到
pRNA i1017LeDREB1a重组质粒中。
144 中间干扰载体 pRNA i1017LeDREB1的酶切
验证 为便于形成发夹结构,正反向片段中间隔有
载体的内含子,该内含子大小有 250 bp。故我们用
内含子两端的内切酶 Sal I和 P st I进行双酶切后,
旨在切下包含内含子在内的约 750 bp的条带。先
用 Sal I进行单酶切 5 h,使其充分酶切, 然后用 P st I
酶切。酶切体系为 buffer2 2 L; pRNA i1017Le
DREB1 2 L; Sal I 1 L; ddH 2O补至 20 L, 5 h后
加入 P st I 1 L,酶切 2 h。将重组质粒 pRNA i1017
LeDREB1送北京三博远志生物技术有限公司测序。
15 植物转基因干扰载体 ( pCAM RNA iLeDREB1)
的构建
151 酶切纯化载体 pCAMB IA2300OCS和中间干
扰载体 pRNA i1017LeDREB1 将载体 pCAMBIA2300
OCS和中间干扰载体 pRNA i1017LeDREB1用 Sal I
和 P st I进行双酶切,得到相匹配的粘性末端片段,
酶切产物用凝胶回收试剂盒回收。
152 pCAMB IA2300OCS空载体和带有内含子的
目的基因正反向序列的连接 用 Sal I和 P st I酶切
中间干扰载体 pRNA i1017LeDREB1,切下带有内含
子的目的基因正反向序列, 将其插入到经相同酶
切的 pCAMB IA2300OCS空载体上, 10 L连接反
应体系: 带有内含子的目的基因正反向片段 4 L;
pCAMB IA2300OCS 1 L; 10 ∀ Ligase Buffer 1 L; T4
DNA Ligase 05 L; ddH 2O补至 10 L。连接产物
转入大肠杆菌 DH5, 附加 100 mg /mL的卡那霉素
LB固体培养基上培养, 挑取单菌落,摇菌活化,提取
重组质粒 pCAM RNA iLeDREB1。
153 干扰载体 pCAM RNA iLeDREB1酶切和测
序鉴定 用 Sal I和 P st I双酶切鉴定 LeDREB1基
因正反向干扰片段是否连到 pCAMB IA2300OCS载
体上。用 Sal I和 P st I对卡那霉素抗性筛选得到的
重组质粒 pCAM RNA iLeDREB1双酶切。酶切体
系: buffer2 2 L; pCAM RNA iLeDREB1 2 L; Sal I 1
L; P st I 1L; ddH2 O补至 20 L。将重组质粒
pCAM RNA iLeDREB1送北京三博远志生物技术有
限公司测序。
2 结果与分析
21 LeDREB1蛋白质结构与功能预测
所得的 LeDREB1基因编码 300个氨基酸,理论
分子量为 333 kD,等电点为 49。PSORT II Pred ic
tion软件分析预测表明, LeDREB1为细胞质蛋白
( 478% )。 Scanprosite软件分析表明, LeDREB1基
因编码的蛋白含有高度保守的 DNA结合区 AP2 /
ERF结构域, 这是 DREB转录因子家族的典型特
征。 SOPMA二级结构预测表明, LeDREB1基因编
码的蛋白含 螺旋 ( 29% ), 转角 ( 8% ), 延伸链
( 1033% )和无规则卷曲 ( 5267% )。 ProtFun预测
表明, LeDREB1蛋白的主要功能有参与植物的细胞
周期、生长发育以及生物和非生物胁迫相关的基因
的表达调控, 其 N末端有碱性氨基酸序列, 起核定
位信号的作用。
22 大肠杆茵的活化和质粒的提取
测定所提质粒的 OD260, 以确定其浓度。测定结
果为 OD 260 ( LeDREB1pMD19T ) = 0071, 计算出
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2010年第 9期 王迎波等:番茄 LeDREB1转录因子基因 RNA i载体的构建和鉴定
LeDREB1pMD19T浓度为 350 ng /mL。
23 PCR扩增获得正义和反义基因片段
LeDREB1pMD19T 质 粒 为 模 板, LeDREB1
RNA iP1, LeDREB1RNA iP2, LeDREB1RNA iP3 和
LeDREB1RNA iP4为特异性引物, 进行 PCR扩增,
PCR产物琼脂糖凝胶电泳得到大小约为 260 bp的条带
(图 1),与实际长度相符,说明引物设计及 PCR反应程
序设计均符合扩增要求。测序正确,无基因突变。
1, 2.分别为正反向基因片段 PCR; M. m arker
图 1 PCR产物电泳图谱
24 PCR产物和载体 pRNA i1017酶切纯化
送去测序的 8个 PCR样品测序全部正确, 说明
模板、Taq酶、引物设计和 PCR程序均符合要求。将
测序鉴定正确的 PCR产物分别用内切酶Xho I、Bgl II
和 Sal I、BamH I进行酶切, 载体 pRNA i1017用 Xho I
和 Bg l II酶切,以得到具有相匹配的粘性末端的基因
片段与载体片段,酶切产物的电泳图谱 (图 2)。
1.载体 pRNA i1017酶切纯化; 2, 3.分别为正反向
片段酶切纯化; M. m arker
图 2 正反向片段和载体 pRNA i1017酶切纯化图谱
25 中间干扰载体 pRNA i1017LeDREB1酶切验证
两端带有 Xho I和 Bg l II位点的正向基因片段
用内切酶 Xho I、Bg l II进行酶切后,连接到经相同酶
切的载体 pRNA i1017上。转化培养, 提取重组质粒
后, 用内切酶 Xho I、Bg l II进行酶切,切下约 260 bp
大小的条带 (图略 )。说明正向基因片段连到了
pRNA i1017载体上。两端带有 Sal I和 BamH I位点
的反向基因片段用内切酶 Sal I和 BamH I酶切后,
连接到经相同酶切的载体 pRNA i1017LeDREB1a
上。转化培养,提取重组质粒后,用内切酶 Sal I和
BamH I进行酶切反应, 切下余约 260 bp大小的条
带 (图略 )。说明反向基因片段连到了 pRNA i1017
LeDREB1a载体上。
正反向片段中间隔有载体的内含子, 该内含子
大小有 250 bp,用内含子两端的内切酶 Sal I和 P st I
进行双酶切后,切下包含内含子在内的约 750 bp的
条带 (图 3), 说明正反向基因片段均构建到了载体
pRNA i1017上。构建的 pRNA i1017LeDREB1图谱
如图 4所示。
1. pRNA i1017LeDREB1酶切; M. marker
图 3 pRNA i1017LeDREB1酶切图谱
图 4 LeDREB1基因正反向中间干扰载体构建示意图
26 干扰载体 pCAM RNA iLeDREB1酶切验证
用 Sal I和 P st I对阳性克隆的质粒双酶切, 切
下了约 750 bp大小的条带 (图 5) ,说明正反向基因
片段及内含子均构建到了载体 pCAMBIA2300OCS
上,可以用于后续的转基因试验。构建好的植物干
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
扰载体 pCAM RNA iLeDREB1图谱如图 6所示。
上述酶切验证和测序鉴定, 说明已成功构建植
物干扰载体 pCAM RNA iLeDREB1, 为研究 Le
DREB1的功能和调控机制提供了材料。
1. pCAMRNA iLeDREB1 Sa l I和 P st I双酶切; M. m arker
图 5 pCAM RNA iLeDREB1酶切图谱
图 6 RNA干扰载体 pCAM RNA iLeDREB1
3 讨论
本试验通过对 LeDREB1蛋白的结构分析, 选取
合适的 LeDREB1基因非保守的编码序列,设计合理
的引物和 PCR程序, 扩增 LeDREB1的正反向基因
片段。正向基因片段两端引入 Xho I和 Bg l II酶切
位点,反向基因片段两端引入 Sal I和 BamH I酶切
位点。用 Xho I和 Bg l II分别酶切正向片段和中间
干扰载体 pRNA i1017,成功构建载体 pRNA i1017Le
DREB1a。用 Sal I和 BamH I分别酶切反义片段和
载体 pRNA i1017LeDREB1a, 成功构建中间干扰载
体 pRNA i1017LeDREB1。由图 4可知, 正反向基因
片段之间隔有 250 bp左右的内含子,此设计是为了
使其形成发夹结构 [ 14] , 高效表达 dsRNA [ 15]。 dsR
NA被核酸酶切割成 21- 25 nt的小干扰 RNA ( sma ll
interference RNA, siRNA ), 由 siRNA介导识别并靶
向切割同源性靶 mRNA分子引起基因转录后沉默。
由于构建好的 pRNA i1017LeDREB1载体的正反义
基因片段两端均含有 P st I酶切位点, 故酶切回收正
反向和内含子片段时,需先用 Sal I酶切 5 h,使其充
分酶切消化后, 再加入 P st I, 这样可产生不同的粘
性末端。Sal I和 P st I具有通用 buffer,酶切时不用
更换 buffer。如果同时加入 Sal I和 P st I进行酶切
反应,很可能产生相同的 P st I酶切粘性末端, 这样
会使正反向和内含子基因片段不能连接到干扰载体
pCAMB IA2300OCS上。
酶切和测序鉴定表明, 本试验成功构建了干扰
载体 pCAM RNA iLeDREB1, siRNA体系的建立对进
一步研究 LeDREB1的功能和调控机理提供了技术
支撑与材料保障。
参 考 文 献
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(下转第 122页 )
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
HA101、BoAHA102基因在 mRNA水平的一致性分
别为 992%、951%、935%、939%、992%、
954%, 因此从理论上推导干扰载体 pFGC5941M
BAHA10I也可用于甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等多个
芸薹属物种的转基因,介导 AHA 10基因家族的高效
沉默。AHA基因大家族非常保守, 拟南芥的 11个
成员在 mRNA水平的同源性很高, BAHA10 I基因位
于编码区的终止密码子之前即蛋白的 C端, 此外干
扰片段与其它功能的 AHA 基因的同源性低, 为
AHA 10基因的特异性保守区,因此该载体不会引起
对 AHA10基因以外的其它 AHA基因的非靶向
沉默。
参 考 文 献
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