全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-04
基金项目:云南省烟草专卖局(公司)资助项目(04A10)
作者简介:尚志强(1964-),男,助理研究员,研究方向:烟草育种与栽培研究;E-mail:zhqshang@yntsti.com
烟草(NicotianatobacumL.)病毒病素有“植物
癌症”之称,是一种危害严重的世界性病害,种类
多,分布广。据报道,国外已从烟草中分离出 27种
病毒,中国发现 16种[1]。中国烟草病毒主要有烟草
花叶病毒(TMV)、烟草脉斑病毒(TVMV)、烟草蚀
纹病毒(TEV)、番茄斑萎病毒(TSWV)等[2]。近年来
烟草病毒病有逐渐加重的趋势。据统计,2003年中
国烟草病毒病属轻发年,但发生总面积仍为 17.47
万 hm2,估计产量损失为 5619.185万 kg,产值损失
为 50419.459万元。目前治疗烟草病毒病的方法还
没有,其中化学药剂具有高效、简便的特点,能起到
预防的作用。但是,广泛、大量和长期使用化学农药
造成了烟叶农药残留的增加,病原物的抗药性增强
以及病毒病的再度猖獗,即造成 “三 R”(Residue,
Resistance,Resurgence)问题。而且由于含有铅、砷、
汞和有机氯等杀菌剂等化学性质稳定,不易分解,
给环境带来了很大污染[3,4]。烟草遗传病性状与其
它农艺性状难以有机结合,选育既抗病又高产、优
质的烟草品种的难度越来越大。采用传统的农艺栽
培措施进行病害防治的用工投入大,防治效果也十
分有限。因此,研究探索防治烟草花叶病毒病的新
技术、新途径已成为众多研究者普遍关注的焦点。
分子生物学的发展,特别是基因工程的发展为防治
该病毒病带来了希望。近年来,利用 RNA沉默技术
进行抗病毒研究已成为烟草病毒学家研究的新热
点。
RNA沉默(RNAsilencing)是一种结合和降解
特异 mRNA序列的形式,其发现可追溯到 1990年,
Napoli等[5]向矮牵牛花中导入更多拷贝与粉红色色
素合成有关的基因,以产生颜色更深的紫色矮牵牛
RNA沉默技术及其在烟草抗病毒研究中的应用
尚志强
(云南省烟草科学研究所,玉溪 653100)
摘 要: RNA沉默技术是一项基因沉默新技术。在抗病毒研究中,人为地将与病毒或宿主基因(宿主基因编码的
蛋白质对病毒很重要而对宿主本身作用很小或不起作用)同源的双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)导入生物体内,
引起与其同源的基因发生沉默,从而抑制病毒复制,达到抗病毒的目的。因此,RNA沉默技术技术在抗病毒研究中倍受
关注,并取得了显著成绩。主要对RNA沉默技术的相关知识及其在烟草抗病毒中的应用进展作一综述。
关键词: RNA沉默 RNA干扰 dsRNA 抗病毒烟草
TechnologyofRNASilencingandItsApplicntionin
AntivirusofTobacco
ShangZhiqiang
(YunnanTobaccoScienceResearchInstitute,Yuxi653100)
Abstract: Inantiviralresearch,byusingtechnologyofRNAsilencing,thedoublestrandsRNA(dsRNA)homologous
togeneofvirusorhostwereductedintoorganismstorepresthevirusrelication,thuskeepingorganismsformvirus.The
technologyofRNAsilencinghasbeenpaidmoreatentionintheresearchofantiviral.Thecorespondingknowledgeof
RNAsilencingtechnipueanditsapplicationinantivirusoftobaccowerereviewedinthispaper.
Keywords: RNAsilencing RNAinterference DoublestrandRNA Virusresistanttobacco
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
花,结果许多花朵的颜色不但没有加深,反而变成
白色或花白色。因为导入的基因和其同源的内源基
因同时都被抑制,所以被称为共抑制(co-suppression)
现象。另外,这种共抑制现象被确认是发生在转录
后水平,所以又被称为转录后基因沉默(post-transc
rip-tionalgenesilencing,PTGS)。随后发现在真菌中
的消除(queling)现象以及动物的 RNA干扰(RNA
interference,RNAi)现象都属于 RNA沉默。另外,
Makarova等[6]在最近的研究发现,在原核生物中同
样存在着类似真核生物的 RNA沉默机制。
RNA沉默自发现以来,迅速地成为生物学研
究的热点。不论对其机制的研究还是作为一种基因
表达抑制技术的应用,RNA沉默都取得了巨大的
成功。简要介绍了 RNA沉默的产生机制及烟草
RNA沉默的特异性、RNA沉默的技术特点等研究
热点,并系统论述了 RNA沉默技术在烟草中的应
用;还对 RNA沉默技术的操作技术和应用领域进
行了阐述,并对 RNA沉默在烟草中的应用前景进
行了展望。
1 RNA沉默技术原理
1.1 RNA沉默的产生及其基本机制
RNA沉默是存在于生物中的一种古老现象,
是生物抵抗异常 DNA(病毒、转座因子和某些高重
复的基因组序列)的保护机制,同时在生物发育过
程中扮演着基因表达调控的角色,它可以通过降解
RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用[7]。
RNA沉默存在两种既有联系又有区别的途径:
siRNA(smalinterferenceRNA)途径和 miRNA(micro
RNA)途径。siRNA途径是由 dsRNA(double-stranded
RNA)引发的,dsRNA被一种 RNaseⅢ家族的内切
核酸酶(RNA-inducedsilencingcomplex,Dicer)切割
成 21~26nt长的 siRNA,通过 siRNA指导形成
RISC蛋白复合物 (RNA-inducedsilencingcomplex)
降解与 siRNA序列互补的 mRNA而引发 RNA沉
默。而在 miRNA途径中,miRNA是含量丰富的不编
码小 RNA(21~24个核苷酸),由 Dicer酶切割内源
性表达的短发夹结构 RNA(hairpinRNA,hpRNA)形
成。miRNA同样可以与蛋白因子形成 RISC蛋白复
合物,可以结合并切割特异的 mRNA而引发 RNA
沉默[8]。尽管引发沉默的来源不同,但 siRNA和 mi
RNA都参与构成结构相似的 RISC,在作用方式上
两者有很大的相似性。
1.2 RNA沉默在植物与其他生物中的差异
尽管不同生物的 RNA沉默机制相似,但植物
与其他生物相比有其特异性。首先,在植物中存在
系统性沉默(systematicRNAsilencing)现象。RNA沉
默不会局限于单个细胞内,可以在细胞与细胞之
间、甚至由诱导部位向更远的组织传播。其次,植物
中存在转移性沉默(transitiveRNAi)。对于转基因植
物中的外源基因,如果 dsRNA诱导的 RNA沉默区
域对应于基因的中间区域,能检测到与其侧翼区段
对应的 siRNA,但内源基因缺乏转移性沉默,表现
出沉默区域的保守性[7,9]。这两种现象在线虫中也有
发现,在哺乳动物和昆虫中却没有发现类似的现
象。最后,植物中的 RNA沉默跟两种不同大小的
siRNA有关:21nt和 24ntsiRNA。21nt由 RISC指导
切割目的 mRNA,而 24nt则引发了系统性沉默和
甲基化;在动物中仅发现 21nt的 siRNA。
1.3 RNA沉默与其他基因表达抑制技术的比较
RNA沉默属于一种基因表达抑制技术,能够使
基因的表达受到抑制甚至完全不表达。基因表达抑
制技术从作用机理上可分为 DNA水平上的抑制
(基因打靶、转座子标签和 T-DNA插入等)、转录水
平上的抑制(调控区甲基化等)和转录后水平上的
抑制(反义 RNA和 RNA沉默等)。在基因功能研究
中,RNA沉默与其它几种基因表达抑制技术相比
有明显的优越性。首先,它比反义 RNA技术效率更
高,能在低于反义 RNA几个数量级的浓度下使目
标基因表达降到极低的水平甚至完全“剔除”,因此
更容易产生功能降低甚至缺失的突变。其次,与 T-
DNA和转座子标签技术相比,不存在插入位点随
机性的问题,理论上任何基因都可被针对性的
dsRNA特异性沉默。最后,应用同源重组进行的基
因敲除效率非常低,且打靶载体构建所需的同源序
列较长,而 RNA沉默高效并且需要的同源序列则
较短。Wesley等[10]利用 hpRNA载体产生的 RNA沉
默,98bp长的同源序列即可产生有效地 RNA沉默。
2 RNA沉默技术在烟草抗病毒研究中的应用
将病毒的某一序列设计成双链结构导入植物
体使之表达,可诱发 RNA沉默强化植物体内天然
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2008年第5期
的 RNA沉默抗病毒能力,这使得高抗病毒性的转
基因植物的获得成为可能。Waterhouse等[11]利用马
铃薯 Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段构建 IRS载体
进行烟草转化,获得抗性植株。Kalantids等[12]在转
黄瓜花叶病毒 (Cucumbermosaicvirus,CMV)cDNA
反向重复序列的再生烟草植株中检测到一个完全
抗性的株系,并且证实烟草病毒抗性直接与 siRNA
的产生相关。同时接种病毒的转化植物体表现出敏
感型、恢复型(表现症状但新长出的叶片无症状)及
完全抗性 3种表型。其中的敏感型尽管对病毒敏
感,但症状要比对照轻得多。这 3种表型除了说明
RNA沉默信号在植物体内可以扩散产生系统性沉
默外,还说明利用 RNA沉默手段获得的抗性植株
的抗性强度大小并不完全一致。
在RNA沉默抗病毒的方法研究上,Tenlado等[13]
观察了以直接注射和农杆菌介导转化 2种方式将
病毒 dsRNA导入植物叶片细胞后的结果发现,2种
方式都成功阻止了烟草蚀刻病毒 (Tobaccoetch
virus,TEV)、辣椒轻斑驳病毒 (Peppermildmotle
virus,PMMoV)和苜蓿花叶病毒(Alfalfamosaicvirus,
AMV)的侵染。同时,他们将用于直接注射的
dsRNA进行稀释处理发现,dsRNA诱导的植物病毒
抗性是 dsRNA剂量依赖的,这与在动物身上得出
的结论一致。而 Pandolfini等[14]的试验结果表明,即
使导入烟草的李痘病毒(Plumpoxvirus,PPV)基因
组片断含有可剪切的内含子序列,在转化体中也可
以检测到转化片断 siRNA的存在,并表现出对 PPV
侵染的系统抗性。在 dsRNA双螺旋区域的长短设
计方面,针对糖原合成酶激酶 (Glycogensynthase
kinase,GSK)基因进行的 RNA沉默结果表明,在
19nt的基础上再增加 siRNA配对区域的长度,不能
增强 RNA沉默表现出来的干扰作用。因此,载体可
以只表达 21nt(19nt的双链区和 3突出的两个碱
基)的 siRNA来达到 RNA沉默的目的。然而,同一
基因不同区域的 siRNA产生的沉默效应可能不同,
所以,在试验时应该比较多个不同序列的 siRNA,
然后确定干扰效果最好的 siRNA序列。另外,通过
在 siRNA的正义链 3端增加 1~4个不配对的核
酸,强化 siRNA的双螺旋结构,可能也是提高培养
细胞中 RNAi活性的一种手段[15]。
牛颜冰等[16]研究发现,瞬时表达黄瓜花叶病毒
部分复制酶基因和番茄花叶病毒移动蛋白基因的
dsRNA能阻止相关病毒侵染。赵明敏等[17,18]以烟草
花叶病毒基因组为靶位,设计合成表达小干扰
RNA(siRNA)的寡核苷酸,亚克隆到植物双元表达
载体 Pbi121中,直接转化根癌农杆菌。通过根癌农
杆菌介导的瞬时表达法,研究了靶向于 TMV基因
组的 siRNA对 TMV侵染的干扰作用。首次将
siRNA技术与瞬时表达系统相结合用于干扰 TMV
病毒的侵染及其分子机理的研究。研究结果表明,
瞬时表靶向 TMV复制酶基因、外壳蛋白基因的
siRNA均能特异性干扰 TMV侵染,而且这种干扰
作用可被 PVA的 HC-Pro蛋白所抑制。因此,RNA
干扰技术可望成为新的基因水平植物抗病毒研究
的新方法,同时为病毒的快速诊断提供新的手段。
3 问题与展望
生物体基因组对入侵的外源核苷酸序列相当
敏感,在长期的进化中,生物体内形成了一套有效
的防御措施,RNA沉默就是其中之一。许多研究已
证实 RNA沉默参与了病毒的清除,这为众多学者
利用 RNA沉默进行抗病毒治疗提供了理论依据。
目前的研究主要集中在设计相应的 siRNA,诱发特
异的 mRNA降解,从而发挥有效的抗病毒作用。
RNA沉默技术有 2个重要特点,高效性,以及严格
的序列特异性。目前已证实,几个分子的 siRNA就
可以有效地抑制同源性基因的表达。另外,siRNA
有严格的序列特异性。可以针对那些融合基因,或
者带有突变、插入或缺失等变异的基因,设计特异
性 siRNA分子,异常的基因被沉默,而正常基因不
受影响,从而达到抗病毒的目的。与其它抗病毒策
略相比,RNA沉默技术具有许多优点。首先,抗病
毒效应具有高度特异性,对非同源基因的表达同有
影响。其次,RNA沉默途径的中间物,siRNA能够高
效抑制病毒复制。即使病毒在 siRNA作用的特定区
域发生突变,相应的病毒粘附受体的表达,从而切
断病毒侵染途径。对已整合入宿主细胞基因组织的
前病毒及无复制活性的病毒,RNA沉默也可以起
到有效的抑制效应,这是通常抗病毒药物无法做到
的。因此,利用 RNA沉默技术与根癌农杆菌瞬间表
达渗入相结合,可快速测定重组表达质粒的抗病毒
尚志强:RNA沉默技术及其在烟草抗病毒研究中的应用
(下转第102页)
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
(上接第83页)
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效应,势必在烟草抗 TMV基因工程研究中具有巨
大的应用潜力,有助于推动植物抗病毒基因工程的
发展。但是,RNA沉默作为一项新兴的分子生物学
技术,其发展仅数年之久,其效应对整个生物体的
影响仍不明确。对不同的作用靶位,RNA沉默效应
存在差异。目前,仍然不清楚 RNA沉默这种干扰作
用是否可以在植物内遗传给后代。因此,RNA沉默
技术的安全性和稳定性等问题仍有待进一步深入
研究。
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