全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-12-11
基金项目:国家“863”计划(2002AA241031)和农业部948项目“甘蔗良种和技术引进与推广”(2003-Q06)的一部分
作者简介:方珊茹(1978-),硕士,助理研究员,研究方向:作物遗传与分子育种
通讯作者:陈如凯,研究员
白藜芦醇(Res)是一种重要的植物抗菌素,具有多种医疗保健作用,因此,其应用前景非常广泛,已引
起多方关注。白藜芦醇合酶(RS)是 Res生物合成的关键酶之一,它催化 1分子 4-香豆酰辅酶 A和 3分子
丙二酰辅酶 A反应合成 Res。关于它的研究已广泛开展起来[1~3]。
果蔗是一种高生物产量的作物,但其面临着病虫害严重和品质较差等问题。基因工程方法可将有用的
外源基因导入果蔗,从而改善果蔗的品质,提高经济价值。同时若以之为生物反应器用于表达一些医药蛋
白将具有优越性和广阔的应用前景[4,5]。
以花生中克隆的 RS基因为基础,构建其单子叶植物表达载体和酵母表达载体,为以后的基因工程改
良果蔗品质和利用酵母生产 Res奠定基础[6~9]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
质粒 pMD18-T-RS是指在 pMD18-T载体质粒的多克隆位点 EcoRV中插入 RS基因片段(有正、反连接
两种质粒)。表达载体 pBIL-1,由农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室提供。pBIL-1含有玉米泛
激素 Ubi启动子、一个外源基因(Lfy)、胭脂碱合成酶基因终止子(Nost)和新霉素磷酸转移酶基因(NPTI)
RS基因的植物表达载体和酵母表达载体构建
方珊茹 1 阙友雄 2 林剑伟 2 陈如凯 2
(1福建省农业科学研究院水稻研究所,福州 350019;2福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室,福州 350002)
摘 要: 白藜芦醇合酶(RS)是Res生物合成的关键酶之一,它催化1分子 4-香豆酰辅酶 A和3分子丙二酰辅酶
A反应合成Res。以花生中克隆的RS基因为基础,成功构建了RS基因的以Ubi为启动子的单子叶植物表达载体pBIL-
RS,为以后的基因工程遗传转化果蔗和其他单子叶植物改良其品质提供条件。同时构建了酵母表达载体 pVT102U-RS,
为下一步研究真核表达蛋白的生物活性提供条件,并为利用酵母生产Res提供了可能。
关键词: 白藜芦醇合酶 酵母 表达载体 基因工程
MonocotyledonandYeastExpressionVectorsConstruction
ofRSGene
FangShanru1 QueYouxiong2 LinJianwei2 ChenRukai2
(1InstituteofRice,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350019;2KeyLabofEco-physiology&Genetics
ImprovementforSugarcane,MinistryofAgriculture,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002)
Abstract: Resveratrolsynthaseisanexclusivenecesaryenzymeinthepathwayofresveratrolbiosynthesis,which
catalyzesonemoleculeof4-coumaroyl-CoAandthreemoleculesofmalonyl-CoAintoresveratrol.Thepresentstudyis
forresveratrolsynthasegenecloningfrom peanut.Bothmonocotyledonandyeastexpresionvectorswereconstructedin
thestudy.Theresultswereasfolows:1.ThemonocotyledonexpresionvectorincludingUbipromoterwasconstructed,
2.Theyeastexpresionvectorwasconstructed.
Keywords: Resveratrolsynthase YeastExpresionvector Geneticengineering
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
选择标记基因。酿酒酵母菌 S78(leu2、ura3、rep4)、分泌表达型穿梭载体 pVT102U/a和大肠杆菌 TG1由福建
师范大学生物工程学院陈由强教授提供。
限制性内切酶、T4DNApolymerase、EXTaqDNApolymerase、PCR反应 bufer、dNTP购自 Takara公司;
WizardDNAClean-upSystem、RNaseA购自 Promega公司;低熔点琼脂糖、琼脂糖、Amp、Kan、YNB、Yeast
extract、Polypeptone购自 Sangon公司;其他试剂和药品均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 植物表达载体的构建(图 1)
1.2.1.1 pMD-18-T-RS-质粒和 pBIL-1质粒的酶切 菌种的活化、质粒的小量提取和酶切以及目的片段和
载体片段的回收与纯化、pBIL-1质粒的酶切、补平和大片段的回收纯化、目的片段和载体大片段的连接反
应及转化大肠杆菌主要参考“分子克隆实验指南(第 2版)”、“分子克隆(第 3版)”。
1.2.1.2 重组质粒 PCR检测和酶切鉴定[6,7] PCR引物的设计:根据花生 RS基因的碱基序列,设计上下游
引物,其序列如下:
上游引物:5-CATCCATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC-3
下游引物:5-GTATTATATGGCCATGCTGCGGAG-3
PCR反应体系、反应程序以及酶切鉴定参考“分子克隆实验指南(第 2版)”。
1.2.2 酵母表达载体的构建(图 2)
图 2 酵母表达载体构建
图 1 植物表达载体构建流程
1.2.2.1 引物的设计 据 Genebank上陈由强教授登录的 RS基因序列(AY170473),设计合成上下游引物:
上游引物:5AGTCTAGATAAAAGATCCAGCAACGGTATT3
下游引物:5GCAACGACGGTGCCTTATCTGCAGTGGTC3
在上游引物 5端引入了 XbaI酶切位点和酵母 Kex-2蛋白酶所识别的双碱性氨基酸的加工位点;下游
引物则引入 PstI酶切位点,后者为酵母偏爱密码子。
1.2.2.2 表达载体 pVT102U/a-RS的构建[8,9] pMD18-T-RS+和 pVT102U/a质粒的小量提取、酶切鉴定、载
体片段的回收纯化、连接反应及转化至大肠杆菌和重组子的酶切鉴定,以及重组质粒转化酵母主要参考
“分子克隆实验指南(第 2版)”、“分子克隆(第 3版)”。
1.2.2.3 酵母转化子的 PCR鉴定 用无菌接种环从 YSD平板上挑取长势良好的单菌落少许,悬浮于含
20μl无菌双蒸水的 0.5ml离心管中(管盖中央预先用注射器针头扎一小孔,防止盖子因受热膨胀崩开),水
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2008年第3期 方珊茹等:RS基因的植物表达载体和酵母表达载体构建
浴煮沸 10min;取 1μl悬浮液为模板进行 PCR反应。同时以 1μl无菌 ddH2O为模板设一阴性对照。PCR反
应体系和反应程序参考“分子克隆实验指南(第 2版)”。
2 结果与分析
2.1 植物表达载体的构建结果
2.1.1 pMD-18T-RS-、pBIL-1质粒酶切鉴定 由于所用的克隆载体 pMD-18T-RS-中 RS基因的两端有用
SacI、HincI的酶切位点,所以用 SacI、HincⅡ对 pMD-18T-RS-质粒进行单、双酶切检测;双酶切质粒 pMD-
18T-RS-,泳道 4显示两个条带:大条带为 2.6kb,小条带为 1.2kb,即 RS基因片段;分别用 SacI、HincⅡ单切
质粒 pMD-18T-RS-,泳道 2、3显示的是单一的条带,大小为 3.8kb,是单克隆位点,且滞后于双酶切中的大
条带,电泳结果与预计相符(图 3)。
选用 pBIL-1质粒两端的 SacI、KpnI酶切位点进行单、双酶切反应;双酶切质粒 pBIL-1,泳道 1显示 2
个条带:大的条带约为 9.4kb为所需的载体片段,小的条带为 2.6kb,为 GUS和 Lfy基因序列;用 SacI、KpnI
单切质粒 pBIL-1,泳道 2、3显示的是单一的条带大小为 12kb,且条带滞后于双酶切中的大条带(图 4),酶
切结果与预计相符。
图 3 pMD-18T-RS-质粒酶切鉴定 图 4 pBIL-1质粒酶切鉴定
1:pMD-18T-RS-质粒 2:SacI单酶切 3:HincI
单酶切 4:HincI和 SacI双酶切
1:KpnI和 SacI双酶切 2:KpnI单酶切 3:SacI
单酶切 4:pBIL-1质粒
另外 HincI和 KpnI为同尾酶,所以两种酶酶切的位点可以相互连接。
2.1.2 重组质粒 PCR和酶切鉴定结果 将纯化后的目的片段和载体大片段按 3:1浓度比进行连接,连接
产物转化大肠杆菌,长出抗性单菌落。从 LB平板上挑取了 5个抗性单
菌落进行扩增和质粒小量提取,然后对质粒进行 PCR扩增分析,其中
有 4个出现目的条带,与阳性对照(泳道 6)一致(图 5);
选用构建好的载体两端保留的 EcoRI酶切位点对重组质粒进行酶
切鉴定(图 6)。将 PCR鉴定正确的重组质粒 1、2用 EcoRI酶切,重组质
粒 2双酶切后有 2个条带(泳道 3):大条带大小为 9.4kb,位置与 pBIL-1
质粒双酶切中的大条带(泳道 4)一致;小条带大小为 1.2kb,位置与克
隆载体质粒双酶切中的小条带一致(泳道 1)。说明目的片段已连入载
体片段中。酶切鉴定结果进一步说明了载体构建成功。将鉴定正确的重
组质粒命名为 pBIL-RS2,然后进行扩增和甘油保存,并大量提取质粒,用于植物遗传转化研究。
2.2 酵母表达载体构建的结果[10]
2.2.1 pMD18T-RS+、pVT102U/a酶切鉴定 根据穿梭载体酶切位点图谱选择 pMD18T-RS+正向连接载体。
图 5 重组质粒 PCR鉴定
1～5:重组质粒 6:pMD18T-RS质粒
7:空白对照(H2O)
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生物技术通报Biotechnology Bulletin2008年第3期
据 RS基因序列设计了一对引物,并在上游引物的 5′端引入了 XbaI酶切位点和酵母的 Kex-2蛋白酶识别
的双碱性氨基酸的加工位点,以使表达产物能顺利分泌到培养物上清液中;下游引物则引入了 PstI酶切位
点和酵母偏爱密码子。
以 pMD18T-RS+质粒为模板进行 PCR反应,经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收 PCR产物进行纯化,然后用
XbaI与 PstI进行酶切分析。电泳结果显示(图 7),双酶切的小条带为 1.2kb(泳道 6),与 pMD18T-RS的 PCR
产物电泳条带位置一致(泳道 5)。
提取 pVT102U/a质粒,选用载体上的单克隆位点 XbaI和 PstI进行酶切分析。结果显示(图 7),泳道 4
是 pVT102U/a质粒,大小为 13kb;2个酶切位点均为单克隆位点;双酶切结果只有 1个条带,是因为 XbaI
和 PstI酶切位点只相差 6个碱基,条带大小为 13kb。
图 6 重组质粒酶切鉴定 图 7 两种质粒的酶切鉴定
1:P质粒 XbaI和 PstI双酶切 2:P质粒 XbaI单酶切 3:P质
粒 PstI单酶切 4:pVT102U/a质粒(即 P质粒) 5:pMD18T-RS+
质粒 PCR产物 6:纯化后的 PCR产物 XbaI和 PstI双酶切
1:克隆载体质粒 SacI、HincII双酶切 2～3:重组
子 1、2 EcoRI酶切 4:pBIL-1质粒 KpnI、SacI
双酶切 5:pBIL-1质粒
2.2.2重组子的酶切鉴定和酵母转化子的 PCR验证 根据载体的酶切结果,进行大体积酶切,回收载体
片段,并进行纯化。然后将目的片段和载体片段按 3:1浓度比进行连接,连接产物转化至大肠杆菌 TG1,挑
白斑菌落培养,提取质粒,用 XbaI和 PstI进行酶切鉴定重组子。电泳结果显示(图 8),泳道 4的未酶切重
组质粒滞后于泳道 6的载体质粒;重组质粒 2双酶切(泳道 3)的大条带与 pVT102U质粒双酶切(泳道 5)
条带位置一致,大小为 13kb;小条带与 pMD18T-RS质粒双酶切(泳道 1)的小条带位置一致,大小为 1.2kb,
说明目的片段已连接入穿梭载体 pVT102U/a中,酵母表达载体构建成功,记为 pVT102U-RS。
将酶切鉴定正确的已连入 RS基因的 pVT102U-RS质粒转化酵母 S78菌株,然后涂布于 YSD选择性培
养基中培养。待长出单菌落后,挑取 6个单菌落提取质粒,进行 PCR扩增,结果 3个有目的条带,大小约为
1.2kb,说明 RS基因已整合到酵母中(图 9)。
图 8 重组子的酶切鉴定
图 9 酵母转化子的 PCR鉴定
1:pMD18T-RS PstI、XbaI双切 2:重组质粒 XbaI单切
3:重组质粒 PstI、XbaI双切 4:重组质粒 5:pVT102U
质粒 PstI、XbaI双切 6:pVT102U质粒
1~6:重组质粒
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2008年第3期
3 讨论
3.1 植物表达载体的构建
目的基因经分离后,必须经过修饰才能应用于植物基因工程。因此,构建植物表达载体就是在目的基
因的 5端加上启动子,在 3端加上终止子,以便外源基因能在植物中表达,充分发挥其功能。在甘蔗的基
因工程中,Ubi启动子是几种常见强启动子中表达效率最高的。因此,构建以 Ubi为启动子的表达载体,将
RS基因导入具有高光效、高生物产量、经济价值也较高的果蔗中,使之表达,并利用其为高附加值产品
(Res)的生物反应器及提高果蔗抗病性等方面具有深远意义[4,5]。目前,还未见 RS基因转化果蔗的报道。
3.2 酵母表达载体的构建
一般来说,选择合适的载体和受体菌,对表达外源基因非常重要。原核表达系统的翻译后加工修饰体
系不完善,表达产物的生物活性较低。因此,利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。酵母表达
系统是应用较为广泛的真核表达系统,其蛋白表达水平高,生产成本低,产生的蛋白质也比较接近于天然
蛋白质[9]。更重要的是,酵母的细胞组分和代谢产物对人体是无毒的。酿酒酵母作为一种模式生物,在实验
系统研究方面具有许多内在的优势,可使某些蛋白质糖基化而更加稳定,还能把外源基因产生的蛋白质分
泌到培养基中,便于产品的分离纯化;容易繁殖,可控制其生长;繁殖速度快,周期短,能够进行大规模的生
产,具有降低基因工程产品成本的潜力[9,10]。
4 小结
构建了以 Ubi为启动子的单子叶植物表达载体 pBIL-RS,为遗传转化果蔗或其它单子叶植物作准备,
并为进一步研究 RS基因在植物体内的表达奠定基础。
构建了酵母表达载体 pVT102U-RS,用于进一步研究 RS基因在酵母中的表达,为下一步研究真核表达
蛋白的生物活性提供条件,并为利用酵母生产 Res提供了可能。
参考 文献
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