全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第2期
收稿日期:2007-11-16
基金项目:国家科技基础条件平台项目(2005DKA21101)
作者简介:刘丽莉,女,硕士,从事动物遗传育种研究;Tel:0732-8291416,E-mail:liulili276@yahoo.com.cn
通讯作者:叶绍辉,教授,从事动物遗传育种研究;Tel:0871-5220061,E-mail:shy@public.km.yn.cn
近年来,随着核移植、精子显微注射和胚胎干细胞等技术的深入研究以及胚胎移植技术的推广应用,
卵母细胞体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)及受精卵体外培养(IVC)等技术已成为家畜胚胎工程中的重要
研究内容。Matioli(1989)将鲜精用在体外成熟的猪卵母细胞体外受精、体外培养发育到 2~4细胞并移到受
体母猪中妊娠产仔,成为世界上首例用体外培养成熟的猪卵巢卵母细胞、鲜精体外受精移植后而产仔的
“试管猪”[1]。而在猪受精卵体外培养过程中的主要障碍是 4-细胞期的发育阻滞,能否越过阻滞期主要在于
早期胚胎在 4-细胞期是否被激活,Benjamin(1993)表明发育阻滞多发生在胚胎卵源性基因调控向胚源性
不同培养条件对猪卵母细胞IVM、IVF的影响
刘丽莉 1 叶绍辉 2 严明理 1 何艳 1
(1湖南科技大学生命科学学院,湘潭 411201;2云南农业大学动物科技学院,昆明 650201)
摘 要: 通过优化猪卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎体外发育体系,以进一步提高体外胚胎的生产效率和质
量。研究了激素存在时间、不同激素和不同血清对猪卵母细胞体外成熟的影响;共培养体系、精卵作用时间、去除卵丘细
胞的方法对猪体外受精及早期胚胎发育的影响。猪卵母细胞IVM培养48h,前24h内加入PMSG、hCG,后24h将其去除,
卵母细胞总成熟率为79.54%;培养液添加15%FCS或15%NCS,卵母细胞成熟率分别为79.48%和74.81%;PMSG、HCG和
E2配合使用后卵母细胞成熟率为81.42%。在IVF前用吹打法获得的卵裂率、桑椹胚率分别为37.89%和8.54%,精卵共孵
育 6h或 8h的卵裂率(40.52%,37.24%)、桑椹胚率(8.42%,7.85%),以及用输卵管上皮细胞共培养所获得的卵裂率
(40.84%)、桑椹胚率(9.53%)均显著高于其它各组。
关键词: 猪 卵母细胞 IVM IVF 胚胎
EfectofDiferentConditiononIVM andIVFofPorcineOocytes
LiuLili1,2 YeShaohui2 YanMingli1 HeYan1
(1SchoolofLifeScience,HunanScienceandTechnologyUniversity,Xiangtan411201;2SchoolofAnimalScienceand
Technology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201)
Abstract: TooptimizethesystemsofIVM,IVFofoocytesandIVCofembryosonporcine,andfurtherimprove
theeficiencyandqualityofporcineembryosinvitro.Westudiedsomefactorsafectonoocytesinvitromaturation,the
factorsincludediferenttimeofPMSG andhCG added,aswelasdiferenttypeofserumsandhormones;Wealso
studiedsomefactorsafectonfertilization,thisfactorsincludediferentco-culturedsystem,theremovalofcumulus,andthe
timeofsperm-eggincubation.Theresultsshowthatwhenoocytesculturedfor48hoursinvitro,theoocytesmaturation
rategot79.54%byremovingPMSG andhCG from nutrientmedium after24hours;got79.48%and74.81%byusing
culturemedium containing15%FCSor15%NCS;got81.42%byaddingPMSG,hCG andE2,respectively.Thecleavage
ratewas37.89%andmorularatewas8.54%bymanualremovalofcumulusinbeforeIVF.thebetercleavageratewas
40.84% andthemorularatewas9.53% byusingco-culturedsystem withPOEC(porcineoviductepithelialcel
monolayer)invitrofertilization.Timeoffertilizationhadimportantefectoncleavageandembryodevelopingcapacity,
whichiseitherthetimeis6hoursor8hourshasnosignificantdiferenceonembryodevelopment,but6hoursand8
hoursarebeterthantheothers.
Keywords: Porcine OocytesIVM IVF Embyro
2008年第2期
表 1 加入激素的不同时间对卵母细胞 IVM的影响
基因调控转化,即胚源性基因激活时期[2]。Reed(1999)对猪胚胎体外培养做了大量研究,表明用小鼠输卵管
共培养使突破了阻滞期的猪胚胎效果较好[3]。目前,猪 IVM、IVF研究已经取得了一些进展,但成功率仍很
低,而卵母细胞及早期胚胎的需要量越来越大,迫切需要建立一套稳定、高效的体外受精方法和体外胚胎
培养体系,该试验主要对卵母细胞体外发育期间的形态变化、成熟及受精情况进行了研究,从而进一步改
进和完善卵母细胞体外成熟、体外受精及受精卵体外培养的条件,以达到在体外生产大量具有最佳发育能
力的胚胎。
1 材料与方法
1.1 材料
猪卵巢,由昆明市兰龙潭屠宰场采集;种公猪精液,由云南农业大学实验猪场采集。
1.2 猪卵母细胞 IVM、IVF方法
采集刚屠杀的猪卵巢,用 10ml的注射器和 18G针头,抽吸直径为 3~6mm的卵泡中外包数层紧密卵
丘——卵母细胞复合体(COCs)。体外成熟培养:随机选取胞质均匀,A、B级 COCs(含 3～5层或 5层以上卵
丘细胞)用来体外成熟培养(CO2培养箱条件:38.8℃,5%CO2,100%湿度),培养 44～46h后将成熟扩展好的
COCs移入 TCM-199+15%FCS(含 0.1%的透明质酸酶)中,选取排出第一极体的卵母细胞。体外受精及胚胎
体外培养:用 TBM液清洗成熟卵母细胞 3～5次,然后将成熟卵母细胞移入 100μl受精液微滴中,并加入
100μl经获能的精子(1×106个/ml),精卵在 CO2培养箱内共孵育 6h后,将卵子移入到 200μ1胚胎培养液中
培养,每隔 24h观察卵裂及胚胎发育情况,48h半量换液一次,换液时尽量吸去脱落的共培养细胞及退化的
受精卵。
1.3 生物统计学方法
猪卵母细胞 IVM、IVF和早期胚胎发育等实验均重复 3次,数据采用 SAS6.12软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 猪卵母细胞 IVM的结果与分析
2.1.1 激素在培养液中的存在时间对卵母细胞 IVM的影响(表 1) 将挑选好的 A、B级 COCS随机分成 4
组,对照组为不加激素组;试验组Ⅰ为添加
PMSG、HCG培养 48h;试验组Ⅱ为前 24h加
PMSG、HCG,后 24h去除激素培养;试验组
Ⅲ为前 12h内加入 PMSG、HCG,其余时间不
加激素培养。
同一纵栏中,具有不相同字母上标者差
异显著(P<0.05)
PMSG、HCG(各10IU/ml)的存在时间对卵
母细胞体外成熟与发育有着重要影响(表 1)。
试验组Ⅰ和试验组Ⅲ之间的卵母细胞总成熟
率差异不显著(P>0.05),成熟培养前 24h添
加PMSG、HCG,后24h去除激素所得到的卵
母细胞成熟率明显高于其它组,差异显著(P<
0.05)。
2.1.2 不同激素对卵母细胞 IVM的影响
(表 2) 将 A、B级 COCs随机分成 4组,分别在各组的前 24h内搭配不同激素(PMSG、HCG、FSH、LH的
剂量均为 10IU/ml,E2的浓度为 2μg/ml),试验组Ⅳ加入 PMSG、HCG、E2;试验组Ⅴ加入 PMSG、HCG;试验组
表 2 不同激素对卵母细胞 IVM的影响
同一纵栏中,具有不相同字母上标者差异显著(P<0.05)
同一纵栏中,具有不相同字母上标者差异显著(P<0.05)
刘丽莉等:不同培养条件对猪卵母细胞IVM、IVF的影响 203
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
表 4 三种培养体系对 IVF的影响
Ⅵ加入 FSH、LH、E2;试验组Ⅶ加入 FSH、LH。
结果表明,试验组Ⅳ和试验组Ⅴ的 A、B级 COCS成熟率以及总成熟率均显著高于试验组Ⅵ、Ⅶ(P<
0.05)。试验组Ⅳ的总成熟率与试验组Ⅴ差异不显著(P>0.05),而试验组Ⅵ的成熟率与试验组Ⅶ表现差异
显著(P<0.05)(表 2)。
2.1.3 PFF和不同血清对卵母细胞 IVM的影响 将 A、B级 COCS随机分组,对照组为不加任何血清;试验
组Ⅷ为添加 15%PFF;试验组Ⅸ为添加 15%
NCS;试验组Ⅹ为添加 15%FCS(表 3)。
结果可知,对照组与试验组Ⅷ的 A、B级
COCs成熟率均未出现差异显著(P>0.05);试
验组Ⅸ与试验组Ⅹ的 A、B级 COCS成熟率同
样表现差异不显著(P>0.05),而试验组Ⅸ、Ⅹ
体外培养的猪卵母细胞总成熟率均显著高于
对照组和试验组Ⅷ(添加 PFF)(P<0.05)。
2.2 猪卵母细胞 IVF的结果与分析
2.2.1 培养体系对 IVF的影响 分别将受精卵放在 3种培养体系中培养,即为 TCM-199+15%FCS(基础
液);基础液+输卵管上皮细胞(POEC)共培
养组;基础液+颗粒/卵丘细胞共培养组,并
在不同时期内观察不同培养体系对卵裂、
胚胎体外发育的影响(表 4)。
POEC共培养组和卵丘细胞共培养组
的卵裂率(40.84%)(36.07%)显著高于基础液(14.95%)(P<0.05),而 POEC共培养组和卵丘细胞共培养组
之间的卵裂率差异不显著(P<0.05)。POEC共培养组的 4-细胞期胚胎发育率(19.46%)和桑椹胚发育率
(9.53%)显著高于卵丘细胞共培养组(10.75%)(3.67%)(P<0.05)。
2.2.2 精卵作用时间对 IVF的影响 将获能的精子加入到孵育后的受精液滴(含成熟卵母细胞)至 1×106
个/ml,精卵在 CO2培养箱中分别共孵育 4、6、8和 10h,观察卵裂及胚胎的发育情况(表 5)。
精卵孵育 6h卵裂率(40.52%)、8h卵裂率
(37.24%)和 10h卵裂率(32.03%)都明显高于
4h(23.11%),差异显著(P<0.05);精卵孵育
6h与 8h后的卵裂率差异不显著 (P<0.05);
而精卵孵育 6h和 8h获得的 4-细胞胚率、桑
椹胚率显著高于 4h和 10h(P<0.05)。
2.2.3 去除卵丘细胞对 IVF的影响 受精
前,对成熟卵母细胞采取吹打法、透明质酸酶
法去除包裹在外的卵丘细胞,使精子更容易
穿进卵母细胞达到精卵结合,不经任何处理
的成熟卵母细胞为对照组(表 6)。
试验表明,吹打法和透明质酸酶法处理
的卵裂率显著高于对照组,而吹打法获得的卵
裂率(37.89%)与透明质酸酶法(41.04%)差异不显著(P>0.05);吹打法获得的4-细胞胚率(19.21%)与透明质酸
酶法(16.50%)显著高于对照组(7.46%)(P<0.05),而吹打法处理得到的桑椹胚率(8.54%)显著高于透明质
表 3 不同血清对卵母细胞 IVM的影响
表 5 精卵作用时间对 IVF结果的影响
表 6 去除卵丘细胞对 IVF结果的影响
204
2008年第2期
酸酶组(5.21%)、对照组(1.37%)(P<0.05)。
3 讨论
3.1 激素在培养液中存在时间对卵母细胞 IVM的影响
激素在卵母细胞体外成熟过程中起着十分重要的作用。猪卵母细胞发育的不同阶段加入激素对体外
成熟培养的结果是不同的,Funahashi和 DelosReyes研究表明,猪卵母细胞体外成熟培养的前 20h加入激
素,后 20h将激素去除,可增加卵母细胞体外成熟率和促进卵母细胞的减数分裂和细胞质成熟[4,5]。试验中
不加 PMSG、HCG培养时,卵丘细胞大量并很快出现粘壁生长,很少扩展,在培养后期出现胞质不均匀和退
化现象,卵母细胞成熟率极低;而在培养液中加入 PMSG、HCG,卵丘细胞体外培养 24h后便陆续开始扩展,
且卵母细胞悬浮于培养液中,卵母细胞成熟率高,说明猪卵母细胞成熟前期需要促性腺激素的支持,而成
熟后期去掉激素也不影响卵母细胞成熟。该试验仅在 IVM的前 12h内加入 PMSG、HCG的卵母细胞成熟率
(68.73%)与连续培养 48h内添加 PMSG、HCG的成熟率(71.20%)作比较,差异不显著(P>0.05)。可见 IVM
在前 12h内加入 PMSG、HCG并未起到很好的效果,可能是由于激素存在时间过短对卵母细胞作用不完全
的结果;或者是激素的早期加入使得猪卵母细胞中的雌激素水平开始逐渐上升,而在卵母细胞正值所需的
高激素水平时将其雌激素去除,使卵母细胞的雌激素水平骤然下降,这些变化都很大的影响了它的成熟。
3.2 不同激素对卵母细胞 IVM的影响
Funashashi(1993)认为,加入 PMSG配合 HCG对猪卵母细胞的减数分裂和细胞质成熟是有益的[6]。试
验中发现,在培养液中添加 PMSG+HCG+E2或 PMSG+HCG对促进卵母细胞成熟差异不大,说明 E2的存在
并未对卵母细胞的成熟起到显著效果;培养液中加入 PMSG、HCG、E2对卵母细胞成熟率明显要高于加入
FSH、LH、E2组。因此,PMSG和 HCG是猪 IVM培养过程中较为理想的激素添加物,这可能是由于不同动物
的种属差异而需要不同种激素的配合来促进其卵母细胞的成熟。
3.3 PFF与不同血清对卵母细胞 IVM的影响
在培养液中添加血清对卵母细胞成熟有很大促进作用。Downs等指出,血清是卵母细胞体外成熟与受
精所必需的物质[7],其机理可能是由于血清能为 COCS提供所需的蛋白质,或因为血清与卵丘细胞一起能
够防止透明带变硬,有利于精子穿入。Martino提出在培养体系中添加血清能强烈的改变细胞功能,使颗粒
膜和膜细胞对卵母细胞减数分裂恢复的抑制失去效果[8],同时也能够为卵母细胞的成熟提供所需蛋白质,
以促进卵丘细胞层扩散和卵母细胞发育成熟。Naito报道,在卵母细胞培养液中添加 PFF能促进猪卵母细
胞受精后雄原核的形成[9];而 Tsafri研究却表明,培养液中不添加激素时,加入 PFF则抑制了猪卵母细胞的
体外成熟[10]。本次试验中添加 15%PFF的成熟率(57.77%)与对照组(52.98%)并没有显著变化,而添加 15%
FCS、15%NCS能明显地提高卵母细胞的体外成熟率。
3.4 培养体系对 IVF的影响
体外胚胎的活力很大程度上受到培养液成分的影响。Durnford等表明,输卵管细胞单层支持早期胚胎
的发育,在受精和卵裂过程中,输卵管起到关键性作用[11]。Kane和 Watson认为,体外培养的输卵管上皮细
胞分泌蛋白多肽与体内相似,对胚胎发育有促进作用[12,13]。试验发现基础液、颗粒细胞共培养和输卵管上
皮细胞共培养均能支持猪胚胎到 4-细胞期的发育,其卵裂率分别为 14.95%、36.07%和 40.84%,在培养液
中添加输卵管上皮和颗粒细胞的卵裂率显著高于基础液培养(P<0.05)。这可能由于共培养模式能改善精
卵受精环境,增强精子活力或阻止多精受精,从而明显增加卵裂率和桑椹胚率。TCM-199+15%FCS未能促
使猪胚胎克服 4-细胞的阻滞和胚胎的进一步发育;基础液+颗粒细胞或输卵管上皮细胞均能使猪胚胎发
育至桑椹胚,这表明添加输卵管上皮细胞的培养液更适用于猪早期胚胎的体外发育,这可能是单一培养体
系无法满足胚胎在各个发育阶段的营养需求,而共培养体系除了提供必要的营养外,还产生了促有丝分裂
因子,促使细胞分化并对胚胎有毒性物质进行清除,使胚胎能够顺利穿越发育阻滞。
刘丽莉等:不同培养条件对猪卵母细胞IVM、IVF的影响 205
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
3.5 精卵作用时间对 IVF的影响
成功的体外受精与精卵共孵育时间、精卵比例密切相关。在体外受精时,精卵作用时间太短,卵母细胞
不能与精子充分结合,受精率会大大降低,而精卵作用时间太长,异常受精现象增加,其虽能卵裂,但发育至
桑椹胚、囊胚阶段能力差。肝素诱导的获能被认为是一种接近于体内获能的生理性方法[14]。精卵结合并完成
受精过程需要一定的时间,该试验发现精子和成熟卵孵育 2h后,便观察到大量精子附着于卵子的表面,并
有少部分精子穿入,但精子头部的膨大不明显;而在孵育 6~8h左右,观察到卵子穿透率显著上升,大部分精
子聚集在卵子周围。由结果可知,精卵孵育在 6、8h后,其卵裂率、桑椹胚数均表现差异不显著(P<0.05)。而
精卵孵育6~8h的卵裂率要比4h或10h高得多,其差异显著(P<0.05)。因此,适当的精卵作用时间对卵裂和早
期胚胎发育具有重要的影响,一方面能有效使精卵结合,另一方面则可避免受精液处理过长而出现多精受
精的现象。
3.6 去除卵丘细胞对 IVF的影响
在 IVF前使用透明质酸酶去除卵丘细胞与吹打法去除卵丘细胞作比较,发现这两种方法获得的卵裂
率并没有差异,但比对照组(16.15%)要高得多(P<0.05)。结果表明,透明质酸酶和吹打法均能有效地除掉
卵丘细胞,以方便精子穿入卵内使之卵裂;而在对照组中,成熟卵母细胞外周包裹着尚未脱落的卵丘细胞,
增加了精子穿卵的难度,故卵裂率较低。本次试验从克服 4-细胞阻滞期来看,经吹打法处理后得到的 4-细
胞胚率和桑椹胚数最高,透明质酸酶处理的次之,对照组最差。透明质酸酶去除卵丘细胞较为方便,但是在
一定程度上会影响胚胎通过 4-细胞阻滞期和进入桑椹胚期;吹打法处理后的卵裂率固然与透明质酸酶处
理相当,虽能较好越过 4-细胞阻滞期,获得了相对较多的桑椹胚数;但是其操作复杂,也有可能对卵母细
胞造成机械性损伤。
4 结论
从猪的中等卵泡(φ=3~6mm)中获得 COCS,并在培养的前 24h内加入 PMSG、HCG(各 10IU/ml)和 15%
FCS,后 24h去除激素能提高卵母细胞的成熟率;使用吹打法去除卵丘细胞、精卵共孵育 6~8h以及在输卵
管上皮细胞共培养条件下,能获得较好的胚胎发育率。对于猪卵母细胞 IVM、IVF、IVC机理有待进一步研
究,预期不久将彻底揭示卵子发育的本质机理和更有效地提高卵母细胞体外成熟率和早期胚胎的发育能
力,并能按各种需要准确提供大量不同细胞期的卵母细胞、受精卵和附植前胚胎,从而实现家畜胚胎的工
厂化生产,这对加速畜牧业的发展有着重要而深远的意义。
参考 文献
1 MatioliM,GaleatiG,BacciML,etal.Theriogenology,1989,31:1201～1207.
2 BenjaminG,Bracket.Theriogenology,1993,39:43～64.
3 ReedML,IleraMJ,PetersRM.Theriogenology,1999,37:95～109.
4 FunahashiH,CandeyandT,DayBN.ReprodFert,1994,101:159～165.
5 DelosReyesM,LapiereL,SaenzL,eta1.Theriogenology,2001,55(1):468.
6 FunahashiH.ReprodFert,1993,99:97～103.
7 DownsSM,SchroederAC,EppigJJ.GameteRes,1986,15:115～122.
8 MartinoA.Theriogenology,1994,42:859～873.
9 NaitoK,FukudaY.GameteResearch,1988,21:289～295.
10 TsafririA,DekelN,Bar-amiS.ReprodFertil,1982,64:541～551.
11 DurnfordR,StubblingRB,AinsworthL,etal.Theriogenology,1994,42:261～272.
12 KaneMT.Theriogenology,1992,38:297～318.
13 WasonAJ,WastonPH,WarnesD,etal.BiolReprod,1994,50:715～724.
14 ParishJJ,Susko-parishJL,HandrowRR,etal.BiolReprod,1989,40:1020～1025.
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