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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
橄榄 ISSR-PCR反应体系的优化
刘天亮1，2 潘东明1，2 许长同3 李开拓1，2 王江波1，2 施维属1，2
(1福建农林大学园艺学院，福州 350002;2福建农林大学园艺产品贮藏保鲜研究所，福州 350002;3福州市农业局，福州 350002)
摘 要: 采用正交设计和单因素试验，以 BDB(CA)7 为引物，对 ISSR-PCR 扩增橄榄基因组 DNA 的主要影响因子进行
了筛选和分析，优化了适宜于橄榄 ISSR-PCR的扩增体系。结果表明，20 μL的反应体系中采用 40 ng的模板 DNA，0. 2 mmol /L
dNTPs，0. 25 μmol /L ISSR 引物、1 U Taq聚合酶，以及 51. 6℃ － 53℃的复性温度为橄榄 ISSR-PCR扩增的最优条件。
关键词: 橄榄 ISSR 优化 PCR
Optimization of ISSR-PCR Reaction System in Olive
Liu Tianliang1，2 Pan Dongming1，2 Xu Changtong3 Li Kaituo1，2 Wang Jiangbo1，2 Shi Weishu1，2
(1College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002;
2 Institute of Storage Science and Technology of Horticultural Products，
Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002;
3Fuzhou Agricultural Bureau，Fuzhou 350002)
Abstract: By the orthogonal design and the single factor experiment，main factors that influence olive genome ISSR-PCR were se-
lected and analyzed with BDB(CA)7 as primers ． The amplification system for olive ISSR-PCR was established． Results showed that in
20 μL action system，40 ng DNA template，0. 2 mmol /L dNTPs，0. 25 μmol /L ISSR primers，1 U Taq polymerase and 51. 6 ℃ － 53 ℃
for DNA refolding temperature were optimum conditions for olive ISSR-PCR．
Key words: Olive ISSR Optimize PCR
收稿日期:2010-01-04
基金项目:我国台湾农业新品种、新技术引进创新研究与示范项目(2007BAD07B00) ，我国台湾果树新品种与品质控制新技术引进创新研究项
目(2007BAD07B01)
作者简介:刘天亮，男，硕士研究生，从事果树分子生物学研究;E-mail:xiaoxiaoniao8303@ qq． com
通讯作者:潘东明，男，教授，博士生导师，从事园艺产品采后贮运保鲜研究;E-mail:pdm666@ 126． com
橄榄(Canavium album Raeuseh)又名黄榄、白
榄、青榄、山榄、黄榄果，属于橄榄科(Burevaceae) ，
橄榄属(Canavium)。橄榄原产中国，是我国著名的
亚热带特产果树。橄榄鲜食与加工均宜，果汁可作
饮料，橄榄果、根可入药，橄榄木可供建筑和造船用，
种子可作润滑油，是一种多用途经济效益高的果
树［1］。有关橄榄种质资源的研究，前人主要采用植
物学形态特征的比较和同工酶分析两种方法。简单
序列重复区间扩增多态性(inter-simple sequence re-
peat，ISSR)是由 Zietkiewics等［2］提出的锚定 SSR 的
新策略，是建立在 PCR反应基础上的一种新型分子
标记技术。ISSR技术不要求预知基因组序列信息，
可以揭示比 RFLP、RAPD、SSR 更多的多态性，结果
比 RAPD更加可靠。与 AFLP 相比较，ISSR 技术具
有模板 DNA需用量少，试验流程简短，操作简单，成
本低等优点［3，4］。因此，近年来 ISSR 技术已被广泛
应用于品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、
进化、系统发育、分子标记辅助育种等方面研
究［3 － 7］。本研究旨在对橄榄基因组提取方法的比较
以及适合橄榄 ISSR-PCR 反应体系的优化，为利用
ISSR分子标记技术开展橄榄遗传变异分析、辅助育
种、品种鉴定、系统进化等研究提供借鉴。
1 材料与方法
1. 1 材料
DNA提取样品为 2008 年 5 月取自福州市果树
良种场的橄榄品种惠圆的新梢嫩叶。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
1. 2 主要药品与试剂
引物为上海生工公司 Primer Name:cw32493BDB
(CA)7，dNTPs和 DNA Marker 为上海索莱宝生物科
技有限公司产品，Taq酶和 10 × Buffer(含 Mg2 +)为上
海申能博彩生物科技有限公司产品，其余为国产分析
纯试剂。
1. 3 扩增反应程序
采用 ISSR反应体系的基本条件是:采用 20 μL
PCR反应体系，PCR 反应在热循环仪 TaKaRa gradi-
ent 上进行，94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，52℃
退火 1 min，72℃延伸 1. 5 min，循环 40 次;72℃延伸
10 min，置 4℃保存，电泳检测。
1. 4 扩增反应体系的优化
1. 4. 1 单因素试验优化 为确保试验的准确性和
可重复性，在橄榄上获得稳定的 ISSR 标记，对 ISSR
反应条件逐一进行筛选，建立优化反应体系。进行
了 PCR 扩增的模板 DNA(20 ng /μL)、dNTPs(10
mmol /L)、Taq酶(5 U /μL)和引物(10 μmol /L)的用
量 4 个因素进行单因素试验，每个因素取 7 个水平
(表 1) ，以确定该因素对 ISSR结果的影响。
表 1 ISSR-PCR体系优化因素-水平
编号 1 2 3 4 5 6 7
模板 DNA(ng) 1 10 20 40 60 140 200
dNTPs(mmol /L) 0. 025 0. 05 0. 1 0. 2 0. 4 0. 5 0. 6
引物(μmol /L) 0. 05 0. 15 0. 25 0. 35 0. 45 0. 55 0. 65
Taq酶(U) 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5 3. 0 3. 5
1. 4. 2 正交设计 为排除试验中各因素之间的互
作的影响，针对模板 DNA(20 ng /μL)、dNTPs(10
mmol /L)、Taq酶(5 U /μL)和引物(10 μmol /L)4 种
因素，选用 L9(3
4)设计 PCR各反应成分的因素水平
的正交表(表 2)。
1. 5 引物退火温度的优化
使用梯度热循环仪，以引物 BDB(CA)7 的 Tm
为中心温度，设定退火温度梯度范围(12℃)。在
47. 8℃ －59. 8℃之间自动形成 12 个梯度，从中选择
47. 8℃、49℃、51. 6℃、53℃、55. 9℃、58. 6℃、59. 8℃
7 个温度对引物 BDB(CA)7 进行优化。其余条件与
反应程序均相同。
表 2 ISSR 反应体系 L9(3
4)正交试验设计
序号
浓度(μL)
DNA dNTPs 引物 Taq酶
1 0. 5 0. 2 0. 3 0. 1
2 0. 5 0. 3 0. 5 0. 2
3 0. 5 0. 4 0. 7 0. 3
4 1 0. 2 0. 5 0. 3
5 1 0. 3 0. 7 0. 1
6 1 0. 4 0. 3 0. 2
7 2 0. 2 0. 7 0. 2
8 2 0. 3 0. 3 0. 3
9 2 0. 4 0. 5 0. 1
2 结果与分析
2. 1 DNA检测
对本试验提取的 DNA进行比较，电泳检测其完
整性，结果(图 1)显示，提取的 DNA，无弥散的荧光
出现，加样孔清晰，条带整齐。表明所提取的 DNA
样品较纯，基本没有多糖等杂质，无降解和 RNA 污
染。DNA样品在 Tu-1810 紫外可见光分光光度计
测定 OD260、OD280、OD260 /OD280在 1. 73 － 1. 81 之间，
符合 PCR的要求。
M． DL 2000 marker;1-3．橄榄样品
图 1 橄榄 DNA电泳图
2. 2 ISSR-PCR反应体系的优化结果
2. 2. 1 模板 DNA 浓度对 ISSR-PCR 反应的影响
PCR反应中对模板 DNA 浓度要求的范围通常较
宽。但最佳的 DNA 模板浓度范围取决于物种基因
组大小及 DNA 模板纯度。在 20 μL 的反应体系中
设置 7 个梯度 1、10、20、40、60、140 和 200 ng，对不
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2010 年第 7 期 刘天亮等:橄榄 ISSR-PCR反应体系的优化
同量的模板 DNA分别进行了 PCR 扩增。结果如图
2 所示，在其它条件一致的情况下，模板用量在 40 －
60 ng之间时扩增带数多而且清晰。故 40 ng 模板
DNA用于橄榄 ISSR-PCR扩增为最佳选择。
M． DL 2000 marker;1 － 7． DNA模板浓度梯度(ng)1、10、
20、40、60、140、200
图 2 DNA模板浓度对 ISSR反应的影响
2. 2. 2 dNTPs浓度对 ISSR-PCR反应的影响 dNTPs
是 ISSR-PCR反应的原料，dNTPs 浓度过高，会导致
PCR错配，从而使扩增出现非特异性条带;反之则
影响合成效率，甚至会因过早的消耗而使产物单链
化，影响扩增效果［8］。将最佳模板 DNA 浓度代入
dNTPs单一因素试验，在 20 μL 的反应体系中设
0. 025、0. 05、0. 1、0. 2、0. 4、0. 5 和 0. 6 mmol /L 7
个梯度，结果如图 3 所示，dNTPs 的合适浓度定为
0. 2 mmol /L。
1 － 7． dNTPs 浓度梯度(mmol /L)0. 025、0. 05、0. 1、0. 2、
0. 4、0. 5、0. 6;M． DL 2000 marker
图 3 dNTPs浓度对 ISSR反应的影响
2. 2. 3 引物浓度对 ISSR-PCR 反应的影响 引物
浓度偏高或偏低所得到的 PCR结果均不可靠，引物
浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增
加引物之间形成二聚体的几率，浓度过低则无法测
出所有 ISSR 位点［8 － 12］。选择 0. 05、0. 15、0. 25、
0. 35、0. 45、0. 55 和 0. 65 μmol /L共 7 个梯度进行单
因素试验。图 4 中的第 3 泳道扩增结果最好，因此
选定引物的合适浓度为0. 25 μmol /L。
M． DL 2000 marker;1 － 7．引物浓度梯度(μmol /L)
0. 05、0. 15、0. 25、0. 35、0. 45、0. 55、0. 65
图 4 引物浓度对 ISSR反应的影响
2. 2. 4 Taq酶浓度对 ISSR-PCR 反应的影响 Taq
酶使用量直接影响扩增反应的成功与否，使用高浓
度的 Taq酶不仅提高了成本，而且也容易产生非特
异扩增产物;而 Taq酶浓度过低时，则会导致产物的
合成效率下降。试验采用 0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3 和
3. 5 U共 7 个梯度。结果(图 5)表明，在 20 μL的反
应体系中，Taq酶用量在 1 － 3. 5 U 范围内均可以得
到清晰稳定的扩增效果，且无特异性扩增。从经济
角度考虑，选择 1 U /20 μL为适宜 Taq DNA 聚合酶
浓度。
2. 2. 5 橄榄 ISSR-PCR 反应体系优化正交试验结
果 以单因素试验结果为基础，采用 L9(3
4)正交
试验设计。进行 4 因素 3 水平正交试验(表 1)。
结果(图 6)表明，第 1、第 2、第 6 和第 9 泳道能扩
增出比较清晰稳定的条带，其中第 9 泳道的组合
条带多而清晰，无背景，且与单因素试验的结果基
本吻合。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
2. 2. 6 退火温度对 ISSR-PCR 反应的影响 退火
温度与 ISSR指纹的稳定性至关重要。退火温度不
同，产生错配的程度也不同，通常较低的温度在保证
引物与模板结合稳定性的同时，也会使引物与模板
之间未完全配对的一些位点得到扩增，即产生一定
的错误扩增。因此，在允许的范围内，选择较高的退
火温度可减少引物和模板之间的非特异性结合，提
高 PCR反应的特异性［13］。图 7 中从左往右依次为
47. 8℃、49℃、51. 6℃、53℃、55. 9℃、58. 6℃、59. 8℃
7 个温度梯度，结果可以看出引物 BDB(CA)7 的适
宜退火温度为 51. 6℃ －53℃。
2. 2. 7 优化反应体系的确定 综合单因素试验和
正交试验设计得出的结果，最终确定在 20 μL 的反
应体系中，采用 40 ng 的模板 DNA，0. 2 mmol /L
dNTPs，0. 25 μmol /L ISSR 引物、1 U Taq DNA 聚合
酶，以及 51. 6℃ －53℃的复性温度为橄榄 ISSR-PCR
扩增条件的最佳选择。
利用此优化系统，使用引物 BDB(CA)7，在
51. 6℃的退火温度下，对橄榄样品进行 ISSR-PCR
扩增，得到清晰、多态性高的 ISSR谱带，并具有较好
的重复性(图 8)。表明优化确立的 ISSR-PCR 反应
体系稳定可靠，可应用于橄榄品种的分子鉴定和遗
传关系的分析等研究。
M． DL 2000 marker;1 － 7． Taq酶浓度梯度(U)
0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3、3. 5
图 5 Taq酶浓度对 ISSR反应的影响
M． DL 2000 marker;1 － 9． 正交体系
图 6 橄榄 ISSR正交试验电泳图
M． DL 2000 marker;1 － 7．退火温度梯度(℃)
47. 8、49、51. 6、53、55. 9、58. 6、59. 8
图 7 退火温度对 ISSR扩增的影响
M． DL 2000 marker;1 － 12． 12 个不同品种的橄榄样品
图 8 引物 BDB(CA)7 对橄榄 12 个样品的
ISSR扩增结果
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2010 年第 7 期 刘天亮等:橄榄 ISSR-PCR反应体系的优化
3 讨论
目前 ISSR标记技术已应用于玉米、小麦、马铃
薯、柑橘、羽扇豆、水稻和葡萄等种质资源的鉴
定［14］。聂珍素［15］对橄榄进行 RAPD 了鉴定，但是
还没有相关的 ISSR标记研究报道，有必要加快确立
ISSR反应体系，为利用 ISSR 分子标记技术，合理开
发、利用橄榄种质资源提供理论参考。
ISSR扩增步骤与 RAPD 技术相似，但不同引
物，不同材料的扩增条件有差异。所以，对一种新植
物材料进行 ISSR标记分析前，要先建立相应的优化
体系，特别是对扩增效果影响较大的因素的优化，以
获得清晰、可重复、易统计的条带。采用单因素试验
进行优化，可以设置较多的水平梯度，以得到比较精
确的单因素最优水平。同时，进行正交试验设计，可
以排除各因素之间互作对最终体系的影响。
4 小结
本试验通过单因素和正交试验对 ISSR-PCR 扩
增橄榄基因组 DNA 的主要影响因子进行筛选和分
析，优化了适宜于橄榄 ISSR-PCR 分析的扩增体系:
20 μL的反应体系中含 40 ng 的模板 DNA、1 U Taq
DNA 聚合酶、0. 25 μmol /L引物、0. 2 mmol /L dNTPs
以及引物 BDB(CA)7 的最佳退火温度为 51. 6℃ －
53℃。试验结果为今后利用 ISSR-PCR 技术对橄榄
种质资源的研究与利用提供了可靠的依据。
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