全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
黄鳝 ISSR2PCR反应体系的建立及条件优化
杨浩　陈宏喜　陈欣　杨太有
(河南师范大学生命科学学院 ,新乡 453007)
　　摘 　要 : 　以黄鳝基因组 DNA为模板 ,采用正交试验设计方法 ,对各反应因子、引物退火温度和循环参数进行优化。
建立了黄鳝的最适 ISSR2PCR反应体系 , 25μl反应体系中含 2. 5 mmol/ L M g2 + , 250μmol/ L dNTPs, 0. 25μmol/ L引物 , 1.
0 U Taq DNA聚合酶 , 30 ng DNA模板。最佳反应程序 : 94℃预变性 5 m in; 94℃变性 40 s, 48～57℃复性 40 s (随引物而确
定 ) , 72℃延伸 1. 5 m in,循环次数 40; 72℃延伸 10 m in。利用所建立的 ISSR反应体系 ,获得了清晰、重复性好、多态性高的
DNA谱带。
关键词 : 　黄鳝 　 ISSR　正交设计 　反应体系
Optim ization for ISSR Reaction System of
M onopterus a lbus with Orthogonal Design
Yang Hao　Chen Hongxi　Chen Xin　Yang Taiyou
( College of L ife Sciences, Henan N orm al University, X inxiang 453007)
　　Abs trac t: 　Based on the genom ic DNA ofM onopterus a lbus, the factors influencing ISSR2PCR system were exp lored with the or2
thogonal design. The op tim ized ISSR2PCR system (25μl) was determ ined as follows: 2. 5 mmol / L Mg2 + , 250μmol / L dNTPs,
0. 25μmol / L p rimers, 1. 0 U Taq DNA polymerase, 30 ng DNA temp late. The reaction p rogram was set including initial denaturation
for 5 m inutes at 94℃, 40 cycles of denaturation for 40 seconds at 94℃, annealing for 40 seconds at 47 ～57℃, extension for 1. 5 m i2
nutes at 72℃, with a final extension of 10 m inutes at 72℃. The clear and rep roducible amp lification was obtained by the established
ISSR reaction system.
Key wo rds: 　M onopterus a lbus　 ISSR　O rthogonal design　Reaction system
收稿日期 : 2009203230
基金项目 :国家大学生创新性实验计划项目 (081047602) ,河南省教育厅自然科学研究项目 ( 2006180017) ,河南省动物学重点学科资助 ,河南
师范大学国家级生命科学实验教学示范中心资助
作者简介 :杨浩 (19882) ,男 ,汉 ,河南武陟人 ,本科生 ,专业 :生物科学
通讯作者 :杨太有 ,教授 ,研究方向 :鱼类遗传标记与分类 ; E2mail: yangtaiyou@ yahoo. com. cn　　黄鳝 (M onopterus a lbus)属合鳃目合鳃科黄鳝属 ,是一种分别广泛的重要底栖淡水经济鱼类。黄鳝具有丰富的营养价值、独特的药用价值和较高的经济价值 ,是我国传统的席上珍品。近年来 ,黄鳝的养殖规模不断扩大 ,但由于人工养殖的生态环境单一和近亲繁殖机率高等因素 ,造成了基因流失、遗传多样性降低及种质退化 ;同时其栖息的自然生态环境随着农药、化肥的使用 ,日益受到污染 ,导致黄鳝的种质资源进一步减少。因此 ,进行黄鳝种质资源调查研究 ,及时采取有效措施 ,保护黄鳝资源 ,具有重要的现实意义。目前对黄鳝的研究主要集中在生 理生化和毒理学领域方面 ,对黄鳝种质资源评价、遗传育种等方面的研究较少。ISSR ( inter simp le sequence repeat)是由 Zietk2iewiez等 [ 1 ]于 1994年创建的一种分子标记。 ISSR标记多态性高、费用低、稳定性好、方便易用 ,目前已广泛应用于鱼类种质资源鉴定和遗传多样性分析等领域 [ 2～4 ]。由于 ISSR标记是基于 PCR的反应 ,其扩增结果易受 Mg2 + 、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模板 DNA等因子的影响 ,且最佳扩增条件因被测物种不同各有不同。本研究利用正交试验方法对黄鳝ISSR2PCR反应体系进行优化 ,探究 ISSR技术对黄
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
鳝遗传多样性研究的适用性。
1　材料和方法
111　材料
试验用黄鳝采集于河南省科学院地理所黄河鱔
生态养殖基地 ,共 30尾 ,均为野生。
112　基因组 DNA的提取
取 50 mg黄鳝背部肌肉 ,用酚 2氯仿法提取基因
组 DNA。采用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳进行检测 ,用
紫外分光光度计测定其浓度和纯度 ,根据各样品的
A260值进行不同倍数稀释 ,调整统一浓度 30 ng /μl,
用于 ISSR2PCR反应条件的优化试验。
113　优化 ISSR2PCR反应体系的正交设计
用于 ISSR2PCR反应的 TaqDNA聚合酶和 dNTP
购自上海生工公司 ,引物购自南京生兴生物技术有
限公司。经初步筛选 ,引物 ISSR61 ( 5′2AGAGAGA2
GA GAGAGAGGT23′)作为正交试验的引物 ,参考文
献 [ 2～4 ] ,对模板 DNA用量、Mg2 +浓度、引物浓度、
dNTPs浓度和 TaqDNA聚合酶用量等因子分别设定
5个水平 (表 1)作正交试验。选用 L25 ( 56 )正交
表 ,设计 PCR扩增体系各因子 2水平正交设计试验
(表 2)。反应体系均为 25μl,然后按照母液浓度计
算各因子用量。依据琼脂糖电泳条带的数目、强弱
及杂带的有无对结果做直观分析。
表 1　 ISSR2PCR反应的主要影响因子及水平
影响因子
因子水平
1 2 3 4 5
DNA ( ng) 15 30 45 60 75
Mg2 + (mmol/L) 1. 5 2. 0 2. 5 3. 0 3. 5
引物 (μmol/L) 0. 2 0. 3 0. 4 0. 5 0. 6
dNTPs(mmol/L) 0. 05 0. 1 0. 2 0. 3 0. 4
TaqDNA聚合酶 (U) 0. 25 0. 5 0. 75 1. 0 1. 25
114　 ISSR2PCR的扩增反应
PCR扩增在 B iometra PCR仪上进行。扩增程
序 : 94℃预变性 5 m in; 94℃变性 40 s, 48℃～57℃复
性 40 s, 72℃延伸 1. 5 m in,循环数设为 30、32、35、
38、40、45; 72℃延伸 10 m in; 4 ℃保存。扩增产物用
1. 5% (w / v)的琼脂糖凝胶电泳 (含 5 μl /100 m l
GoldV iewTM核酸染料 ) ,用 ChampGel21000型数码凝
胶图像分析仪紫外观察并照相记录。
表 2　 ISSR2PCR反应的主要影响因子2水平正交试验设计表
试验号 DNA ( ng) Mg
2 +
(mmol/L)
引物
(μmol/L)
dNTPs
(mmol/L)
TaqDNA
聚合酶 (U)
1 15 1. 5 0. 2 0. 05 0. 25
2 15 2. 0 0. 3 0. 1 0. 5
3 15 2. 5 0. 4 0. 2 0. 75
4 15 3. 0 0. 5 0. 3 1. 0
5 15 3. 5 0. 6 0. 4 1. 25
6 30 1. 5 0. 3 0. 2 1. 0
7 30 2. 0 0. 4 0. 3 1. 25
8 30 2. 5 0. 5 0. 4 0. 25
9 30 3. 0 0. 6 0. 05 0. 5
10 30 3. 5 0. 2 0. 2 0. 75
11 45 1. 5 0. 4 0. 4 0. 5
12 45 2. 0 0. 5 0. 05 0. 75
13 45 2. 5 0. 6 0. 1 1. 0
14 45 3. 0 0. 2 0. 2 1. 25
15 45 3. 5 0. 3 0. 3 0. 25
16 60 1. 5 0. 5 0. 1 1. 25
17 60 2. 0 0. 6 0. 2 0. 25
18 60 2. 5 0. 2 0. 3 0. 5
19 60 3. 0 0. 3 0. 4 0. 75
20 60 3. 5 0. 4 0. 05 1. 0
21 75 1. 5 0. 6 0. 3 0. 75
22 75 2. 0 0. 2 0. 4 1. 0
23 75 2. 5 0. 3 0. 05 1. 25
24 75 3. 0 0. 4 0. 1 0. 25
25 75 3. 5 0. 5 0. 2 0. 5
2　结果
211　正交试验结果
正交试验结果如图 1所示 ,组合 6、7、8、18几乎
无扩增条带。其它组合均有条带 ,但存在明显差异 ,
部分组合或扩增带少 ,或条带模糊不清晰 ,难以辨
认。从整体看 ,组合 2、3、13扩增效果较为理想 ,但
组合 2和组合 13条带亮度较弱 ,综合考虑各因素 ,
组合 3号条带最清晰且亮度较高 ,为最佳组合。
212　各因子对 ISSR2PCR的影响
正交试验虽能快速确定黄鳝 ISSR2PCR的最佳
因子水平组合 ,但由于各因子均不在同一水平 ,很难
判断各因子水平对 PCR的影响。利用引物 ISSR33
( 5′2AGAGAGAGAGAGAGAGGT23′) 在最佳组合的
基础上对 5种因子的 5种水平进行 PCR,结果如图
2所示。结果显示 ,在设定的各因子水平范围内 ,模
板 DNA用量对 ISSR 2PCR的影响最小 , 5种水平几
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2009年第 7期 杨浩等 :黄鳝 ISSR2PCR反应体系的建立及条件优化
1～25. 表 1中试验号
图 1　黄鳝 ISSR2PCR反应 L25 ( 56 )正交试验电泳结果
乎没有差异 ; Mg2 +浓度有一定影响 ,浓度高时条带
渐模糊 ;引物浓度、dNTPs浓度和 TaqDNA聚合酶含
量过低或过高均对 PCR结果有影响。结合正交试
验结果 ,为保证加样的准确性及成本 ,最终确定黄鳝
ISSR2PCR的最佳反应体系 :在 25μl反应液中 ,模
板 DNA量 45 ng、Mg2 +浓度 2. 0 mmol/L、引物浓度
0. 4μmol/L、dNTPs浓度 0. 2 mmol/L、Taq DNA聚合
酶 0. 75 U。
1～5. 表 1中各因子的水平
图 2　 ISSR2PCR反应因子在不同水平的电泳图谱
213　退火温度优化结果
根据各引物的解链温度 ( Tm ) ,对每一个引物在
( Tm ±5) ℃的范围内进行优化 ,均得到最佳的退火
温度值 ,多数为 ( Tm - 2) ℃。
214　循环数对 ISSR反应的影响
在确定最佳反应条件的基础上 ,分别试验了
25、30、32、35、38、40、45个循环数对扩增反应的影
响 (图 3)。结果表明 ,随循环数的增加条带逐渐变
亮 , 25、30、32、35个循环时 ,扩增效率低 ,扩增谱带
较弱 ; 38、40个循环时 ,扩增谱带清晰、稳定 ; 45个
循环时 ,背景太强 ,扩增谱带不易辨认 ,且产物不
稳定有非特异性扩增。本试验确定的最佳循环次
数为 40。
215　优化体系的应用
利用确立的优化体系 ,以引物 ISSR261对 30尾
黄鳝的基因组 DNA进行扩增 (图 4)。结果显示 ,该
引物对 30尾黄鳝材料均能扩增出清晰、重复性好、
多态性高的 DNA 谱带 ,表明本试验建立的 ISSR2
PCR反应体系稳定可靠 ,可用于黄鳝遗传多样性分
析、种质资源鉴定等研究。
1～7分别代表 25、30、32、35、38、40、45个循环
图 3　不同循环数的 ISSR2PCR电泳图谱
M. 分子量标记 ; 1～30. 不同黄鳝个体
图 4　引物 ISSR261对 30尾黄鳝 D NA的扩增图谱
3　讨论
以黄鳝基因组 DNA为模板 ,利用正交试验设计
方法 ,建立了黄鳝的 ISSR2PCR最佳反应体系 ,在此
基础上 ,确定不同引物的最适退火温度和最佳循环
次数。结果表明 ,采用正交试验设计方法 ,通过一次
试验就能得到 ISSR2PCR的最佳反应体系 ,与单、双
因素设计比较 ,不仅简便快速、试验成本低 ,而且试
验效果良好。
影响 ISSR2PCR反应的因素多 ,且各因素之间
又存在互作效应。DNA 模板的质和量影响扩增产
物的稳定性和特异性 ,模板中含有一定量的 RNA和
少量蛋白质不会对扩增结果产生明显影响 ,但模板
的纯化可以避免模板中含有 Taq酶抑制剂 [ 5 ]。本试
验基因组 DNA 经电泳和分光光度计检测 ,质量较
好 ,在 25μl的反应体系中 ,模板 DNA量在 15～75
ng之间进行扩增的结果基本相同 ,说明 ISSR2PCR
对模板用量的要求并不严格 ,这与张志伟等 [ 6 ]对半
滑舌鳎的 ISSR反应体系的优化结果相一致。Mg2 +
是 TaqDNA聚合酶的辅助因子 ,其浓度对 PCR扩增
的特异性和产量有显著的影响 ,又它的有效浓度与
PCR体系中的模板用量、dNTPs用量等有关 ,尤其受
dNTPs浓度的影响 ,因为 dNTPs分子中的磷酸基团
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
能定量地与 Mg2 +结合 ,使实际反应中 Mg2 +的浓度
下降 [ 7 ]。例如 ,王伟继等 [ 8 ]在对对虾 ISSR2PCR研
究中发现 , Mg2 + 浓度过高时电泳图谱有明显的背
景 ,而适当降低 Mg2 +浓度可有效消除背景。本试验
中 ,Mg2 +浓度在 1. 5～2. 5 mmol/L范围内时扩增结
果清晰 ,浓度增高后 ,条带变淡。引物和 dNTPs的
影响表现为 ,浓度过低会降低合成效率 ,而浓度过高
会导致 PCR错配 ,造成非特异产物的合成 ; Taq酶的
用量对 PCR扩增也有很大影响 , Taq酶浓度过高不
仅提高了试验成本 ,而且也容易产生非特异性扩增
产物 ,扩增条带的背景模糊 ,不易辨认 ,而 Taq酶浓
度过低时 ,聚合酶的催化能力不够强 ,导致产物的合
成效率低 [ 9 ]。本试验结果显示 ,引物浓度、dNTPs浓
度和 Taq DNA聚合酶含量过低时 ,条带模糊 ,说明
合成效率较低 ,而浓度过高时 ,并未出现非特异性扩
增 ,这可能与模板 DNA及引物的选择有关。
另外 , ISSR2PCR还受到退火温度、退火时间 ,延
伸时间及循环次数等的影响。较低的退火温度扩大
了引物在基因组中的错配 ,出现杂带 ,而较高却会影
响引物与模板的结合 [ 10 ]。本试验根据各引物的 Tm
值 ,进行 ( Tm ±5) ℃优化 ,均获得理想的退火温度 ;
循环次数决定着扩增程度 ,过多的循环会增加非特
异性扩增产物的数量和复杂性 [ 7 ]。在本试验设置
的 25～45个循环次数中 ,最佳循环次数为 40。
本研究利用正交试验方法对 ISSR2PCR反应的
各因子和循环参数进行优化 ,建立了适合黄鳝的 IS2
SR反应体系 ,为进一步研究黄鳝的遗传多样性和种
质资源评鉴奠定基础 ,并为其他鱼类 ISSR反应体系
的建立提供参考。
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