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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
侧耳木霉 T2-1 植酸酶基因的序列
分析及蛋白结构预测
罗俊彩1 扈进冬1，2 吴远征1，2 李晓龙1 李纪顺1，2 杨合同1，2，3
(1山东省科学院中日友好生物技术研究中心，济南 250014;2山东省应用微生物重点实验室，济南 250014;
3山东理工大学生命科学学院，淄博 255049)
摘 要: 利用 GenBank发表的植酸酶 A编码序列设计的引物，通过 PCR 的方法对侧耳木霉(Trichoderma pleuroticola )
T2-1 基因组 DNA进行扩增，获得了一条长约 1. 7 kb的特异性 DNA 片段。序列测定结果表明，该 DNA 片段含有植酸酶编码
基因的完整序列和 3 段内含子序列，其中植酸酶基因全长 1 443 bp，编码 480 个氨基酸，5端有一段编码 23 个氨基酸的信号肽
序列，其余的 457 个氨基酸残基为成熟植酸酶的氨基酸序列。对该基因编码的氨基酸序列进行三级结构预测，发现它为磷酸
单酯酶。已将侧耳木霉 T2-1 植酸酶基因序列在 GenBank中注册(登录号:GQ325590)。这是目前中国在 GenBank注册的第一
个完整的木霉植酸酶编码基因。
关键词: 木霉 植酸酶 序列分析 磷酸单酯酶
Gene Sequencing and Protein Tertiary Structure Predicting of
Phytase from Trichoderma pleuroticola Isolate T2-1
Luo Juncai1 Hu Jindong1，2 Wu Yuanzheng1，2 Li Xiaolong1 Li Jishun1，2 Yang Hetong1，2，3
(1Biotechnology Center，Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014;2Shandong Provincial Key Laboratory for Applied
Microorganism，Jinan 250014;3School of Life Sciences，Shandong University of Technology，Zibo 255049)
Abstract: We amplified a 1. 7 kb DNA fragment from genomic DNA of Trichoderma pleuroticola T2-1 by the polymerase chain re-
action(PCR)technology with primers designed according to the sequences of the phytase A gene in GenBank． DNA sequencing showed
that the fragment contained the whole 1 443 bp coding sequence of phytase gene and three introns． The gene encoded a peptide of 480
amino acid residues，in which there is a signal peptide with 23 amino acids at the 5end and the left 447 amino acids are the mature
peptide sequences． Tertiary structure prediction for its protein product showed that it was a phosphomonoesterase，and the phytase gene
of Trichoderma pleuroticola T2-1 had been registered in the GenBank(accession number:GQ325590)． In summary，we had cloned a no-
vel gene and the phytase is the first integrated phytase encode gene of Trichoderma registered in the GenBank in China．
Key words: Trichoderma pleuroticola Phytase Sequence analysis Phosphomonoesterase
收稿日期:2010-09-15
基金项目:国家“863”计划项目(2006AA10A211) ，济南青年科技明星计划项目(20080220)
作者简介:罗俊彩，女，硕士研究生，研究方向:生化与分子生物学
通讯作者:杨合同，男，博士，研究员，硕士生导师，研究方向:资源微生物研究;E-mail:yanght@ keylab． net
植酸酶(phytase)在原核生物、原生生物、真菌、
动物和植物中都有发现［1，2］，饲料中使用的植酸酶
主要来自真菌。目前研究的植酸酶产生的真菌主要
为曲霉，对其植酸酶的生化性质，糖基化以及酶的改
造和晶体结构等都有研究。在木霉植酸酶方面，国
内福建农林大学汪世华等［3，4］报道了产植酸酶木霉
菌株的选育、固态产酶条件和液态发酵产酶条件、酶
的分离纯化和性质初探等;在国外，至今在 GenBank
发表的木霉植酸酶基因仅 AJ543399(2003) ，以及一
项专利(patent US 7510831) ;另外，Nsi等［5］比较了
黑曲霉植酸酶(APhy)和瑞氏木霉植酸酶(TPhy)在
玉米 －大豆饲料和大麦 －大豆饲料中植酸磷利用上
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
的差异，结果表明瑞氏木霉植酸酶比黑曲霉植酸酶
效果略高。
本实验室自行分离、筛选出的植酸酶产生菌侧
耳木霉(Trichoderma pleuroticola)T2-1 出发，通过同
源序列设计的引物进行 PCR扩增，并对其核酸序列
以及蛋白三维结构进行预测和分析，研究情况报道
如下。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株及主要试剂和仪器 试验菌株:侧耳
木霉(T． pleuroticola)T2-1 为本实验室保存菌种。
主要试剂:Taq DNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司，植
酸钠购自 Sigma 公司，DNA Marker、琼脂糖凝胶电
泳回收试剂盒购自天根公司。其他为国产分析纯
试剂。
1. 1. 2 培养基 PDA 培养基，用于培养木霉。平
板筛选培养基:植酸钙 0. 5%，葡萄糖 2%，硝酸铵
0. 5%，氯化钾 0. 05%，硫酸镁 0. 05%，硫酸亚铁
0. 01%，硫酸锰 0. 001%，琼脂粉 2%，pH自然，倒平
板时加 0. 1% Triton X-100。液体植酸钙培养基:植
酸钙 0. 5%，葡萄糖 2%，硝酸铵 0. 5%，氯化钾
0. 05%，硫酸镁 0. 05%，硫酸亚铁 0. 01%，硫酸锰
0. 001%，pH 自然，装液量 1 /5。
1. 2 方法
1. 2. 1 植酸酶活性的测定
1. 2. 1. 1 平板法植酸酶活性定性测定 将侧耳木
霉 T2-1 接种到平板筛选培养基上，6 d后观察。
1. 2. 1. 2 植酸钙培养基中木霉发酵液的植酸酶活
性 用接种环取适量孢子悬浮于装有 1. 4 mL 无菌
水的 1. 5 mL离心管中，用移液器吹打均匀，制成孢
子悬液。液体培养基接孢子悬液 0. 25 mL，30℃、
180 r /min 培养 5 d;平板接孢子悬液 0. 1 mL，30℃
培养 5 d。
采用植酸测定国标法测定在培养过程中上述含
植酸钙发酵样品的植酸含量及其变化。并据此测定
计算试样中的植酸酶活性。(1)原理:植酸与三氯
化铁 －磺基水杨酸混合液作用，产生褪色反应，植酸
含量与褪色程度成正比，用分光光度计在波长 500
nm处测定吸光度，计算试样植酸含量。(2)试剂:
三氯化铁 －磺基水杨酸反应溶液:称取 1. 5 g 三氯
化铁和 15 g磺基水杨酸，加水定容至 500 mL，使用
前以水稀释 10 倍。植酸标准溶液:称取 1. 7347 g
植酸钠标准样品，精确至 0. 0001 g，加水溶解并定容
至 100 mL。使用前，吸取 5 mL用水定容至500 mL，
其浓度为 0. 1 mg /mL。(3)标准曲线的制作:精确
吸取植酸溶液 0. 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0 和 5. 0 mL于 6
支试管中，用水补足至 5 mL，加入三氯化铁—磺基
水杨酸反应溶液 4 mL，摇匀，3 000 r /min离心 10
min，放置 10 － 20 min后，将上层液于 500 nm 处测
定吸光度，以吸光度为横坐标，植酸含量为纵坐
标，绘制标准曲线并求回归方程。(4)试样测定:
取适量液体发酵样品于试管中用水稀释至 5 mL
(约含植酸 0. 3 mg) ，加入三氯化铁 － 磺基水杨
酸反应溶液 4 mL，摇匀，其余步骤同标准曲线制
作，测其吸光值，通过标准曲线计算试样中的植
酸含量。
1. 2. 2 木霉细胞总 DNA的提取 用接种环挑取少
量木霉分生孢子接种于 PDA培养基表面，28℃黑暗
条件下培养 1 周，待完全产孢后，用无菌 0. 2%
吐温 － 80溶液制成孢子悬液。将上述分生孢子悬液
立即接种到 200 mL 的 PDA 液体培养基内，28℃、
180 r /min摇振培养 48 h，过滤收集菌丝以提取总
DNA，操作方法参照参考文献［6 － 8 ］。
1. 2. 3 木霉植酸酶 phyAT基因的 PCR扩增
1. 2. 3. 1 引物设计 根据同源性，参照 GenBank下
载的哈茨木霉植酸酶 phyA 基因序列 AJ543399，用
Primer Premier 5. 0 软件设计、分析、筛选出下列 1 对
引物，用于扩增侧耳木霉植酸酶基因序列。正向引
物:5-CGATGATTGCCGCCCGCATATA-3;反 向 引
物:5-CGCTCACTTTCTCGGAGCCCGAC-3。引物合
成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1. 2. 3. 2 植酸酶 phyAT 基因的 PCR 扩增 以木霉
细胞总 DNA 为模板进行植酸酶 phyAT 基因扩增。
PCR 反应体系:10 × Taq DNA buffer 5 μL，上、下游引
物 20 μmol /L，dNTP 100 μmol /L，模板DNA 10 ng /μL，
Taq DNA聚合酶 3 U，ddH2O 补足到 50 μL。反应程
序:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 1 min，52℃退火
1 min，72 ℃ 延伸 2 min，30 个循环;72 ℃ 延伸
10 min。采用 DNA纯化试剂盒进行目的 DNA 片段
(植酸酶 phyAT 基因 PCR 产物)的纯化，纯化产物
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2011 年第 4 期 罗俊彩等:侧耳木霉 T2-1 植酸酶基因的序列分析及蛋白结构预测
由上海生工生物工程技术服务有限公司进行扩增片
段的 DNA序列测定。
1. 2. 4 木霉植酸酶 phyAT 基因序列分析软件及方
法 用分子生物学软件 BioEdit V7． 0． 1、DNAMAN
V6． 0 分析核苷酸序列;通过分子生物学分析软件
DNAMAN V6． 0，采取邻近法构建进化树;使用 Ge-
no3D网络服务器对侧耳木霉 T2-1 phyAT 基因编码
的氨基酸序列进行三级结构的预测，返回的 pdb 文
件用生物大分子三维结构的可视化分析软件 Ras-
Mol软件输出结果。
2 结果和讨论
2. 1 植酸酶活性测定
2. 1. 1 植酸酶平板活性测定 将侧耳木霉 T2-1 接
种到平板筛选培养基上，3 d 后观察，发现产生了很
明显的水解圈(图 1) ，说明侧耳木霉 T2-1 具有产植
酸酶的能力。
图 1 侧耳木霉 T2-1 水解植酸钙产生的透明圈图
2. 1. 2 植酸钙培养基中木霉发酵液的植酸酶活性
根据国标法植酸测定原理，即植酸含量与褪色程度
成正比，以不含植酸的试样即 5 mL 水和 4 mL 三氯
化铁 －磺基水杨酸反应液的混合液做调零对照，植
酸含量越高，其吸光度绝对值越大。植酸钠浓度及
对应吸光度标准曲线如图 2。
图 2 植酸标准曲线
液体植酸钙培养基接菌共 6 瓶 6 个平行，培养
6 d，期间每天定时从其中的一瓶取样，以不加植酸
钙的培养基不接菌样品为调零对照，样品稀释 40
倍，根据标准曲线测定植酸含量(表 1)。由表 1 可
知，植酸钙液体培养基在接菌后，植酸的含量不断减
少，进一步表明木霉具有产植酸酶利用植酸的能力。
T2-1 菌株在液体植酸钙培养基上植酸减少量 2． 16
mg /6 d ·mL，平均 0. 36 mg / d·mL，若定义植酸减
少量 1 μg / h·mL为一个酶活单位 U，则 T2-1 菌株
的酶活单位为 15 U。
表 1 植酸含量每天测定结果
第 n 天样品 OD500差值 植酸含量(mg /mL)
0 － 0. 21 2. 21
1 － 0. 19 2. 05
2 － 0. 13 1. 38
3 － 0. 105 1. 05
4 － 0. 05 0. 55
5 － 0. 03 0. 34
6 － 0. 018 0. 05
2. 2 隆片段的 DNA序列测定及分析
测序结果表明，PCR 产物全长 1 719 bp，Gen-
Bank 登录号为 GQ325590。在 http:/ /blast． ncbi．
nlm． nih． gov /Blast． cgi上进行核苷酸序列相似性比
较，用分子生物学软件 BioEdit V7． 0． 1 分析核苷酸
序列，发现侧耳木霉 T2-1 phyAT基因编码区从 PCR
产物的第 106 个核苷酸开始。根据同源性及内含子
特征保守序列［9］:供体序列(Donor)-GT及受体序列
(Acceptor)-AG，该序列包含 3 段内含子，分别为
PCR产物 841 － 898 bp，1 043 － 1 090 bp，1 471 －
1 526 bp处。去除内含子，编码基因为 1 443 bp，用
软件 BioEdit V7． 0． 1 对克隆序列翻译，相应的氨基
酸序列共有 480 个。
有报道表明，在密码子第三位碱基上高频使用
G和 C碱基是曲霉中高效表达蛋白编码序列所具有
的特征之一［10］，而侧耳木霉 T2-1 phyAT 基因中，密
码子第三位碱基的 G + C含量高达 60. 2%。在 NC-
BI 上进行同源比对，结果表明该片段与 GenBank 中
登录号为 AJ543399 的哈茨木霉(Trichoderma harzi-
anum)植酸酶基因同源性较高，达到 93 %以上。绿
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
木霉(Trichoderma virens)和黄绿木霉(Trichoderma
atroviride)基因组序列已经公布(GenBank) ，由于基
因组没有注释，将该序列与全基因组序列进行同源
性比对，发现 T． virens Gv29-8(gbABDF01000239． 1)
中的 61 647 － 63 346 bp 和 T． atroviride IMI 206040
(gbABDG01000087． 1)200 408 － 202 116 bp 两个基
因片段与该序列具有很高的同源性，分别达到 85%
和 80%，说明这两个未知片段很有可能也是植酸酶
基因。
2. 3 侧耳木霉 T2-1 phyAT基因编码的氨基酸序列
分析
侧耳木霉 T2-1 phyAT基因编码 480 个氨基酸，
用网络服务器 http:/ /www． cbs． dtu． dk /serv-ices /
SignalP /进行信号肽分析，并结合已知的植酸酶氨基
酸序列分析，信号肽切割位点位于第 23 个氨基酸残
基之后，其余的 457 个氨基酸残基为成熟植酸酶的
氨基酸序列。
由于植酸酶基因属于组氨酸酸性磷酸酶(histi-
dine acid phytase，HAP)家族，随机选取 10 种丝状真
菌的组氨酸酸性磷酸酶基因相对应的蛋白序列，用
分子生物学分析软件 DNAMAN建立进化树(图 3) ，
从图 3 可以看出，该蛋白在不同的种属之间遗传距
离都比较远，也就是氨基酸序列相似性很低，这与酸
性磷酸酶家族的特性相似，组氨酸酸性磷酸酶除活
性部位之外，其他部位氨基酸几乎没有相似性。但
是物种进化关系相近的，遗传距离也越近，氨基酸序
列相似性也越高。从图 3 中可以看出，侧耳木霉
T2-1 与同是半知菌纲的 Pyrenophora tritici-repentis
Pt-1C-BFP和 Phaeosphaeria nodorum 的酸性磷酸酶
的遗传距离较近。
分枝处数值表示分支长度，即遗传距离
图 3 组氨酸酸性磷酸酶基因相对应的蛋白序列进化树
所有的 HAP 成员都具有共同的活性部位和催
化机理。组成微生物 HAP 活性部位的氨基酸序列
包括 1 个 N-末端基元 RHGXRXP(X 代表任意氨基
酸)和 1 个 C-末端基元 HD。所选取的 10 种丝状真
菌的氨基酸序列的活性部位(图 4，图 5)N-末端基
元都为 RHGXRXP，其中除 Aspergillus flavus NR-
RL3357 和 Aspergillus terreus NIH2624 外，其余菌种
的 N-末端基元都为 RHGARYP。C-末端基元，A． fla-
vus NRRL3357、A． terreus NIH2624、phytase(EC 3． 1．
3． 26)和 Postia placenta Mad-698-R为 HD，侧耳木霉
T2-1 和其他 4 种丝状真菌为 HE。目前对木霉植酸
酶基因研究较少，至今在 GenBank 公布的木霉植酸
酶基因仅 AJ543399(2003)和 patent US 7510831
(2009) ，我们实验室扩增的一些其他木霉菌株的植
酸酶基因片段在 GenBank 中的登录号:FJ515693、
FJ515694 和 FJ515695，对应的氨基酸序列 C-末端相
应位置上也都为 HE。由图 3 可见，除木霉外，其他
4 种真菌的 C-末端基元也是 HE。由于天冬氨酸
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2011 年第 4 期 罗俊彩等:侧耳木霉 T2-1 植酸酶基因的序列分析及蛋白结构预测
(D)和谷氨酸(E)都是酸性氨基酸，在木霉中很可
能由 E代替了 D，因此，HE 是一个与 HD 不同的末
端基元，这个基元的改变很有可能会影响 HAP 的
活性。
图 4 十种丝状真菌植酸酶活性部位
N-末端基元比较
图 5 十种丝状真菌植酸酶活性部位
C-末端基元比较
在黑曲霉 PhyA中，有两个关键的结构组件对其
维持正常的生理生化性质起到了重要的作用。其中
的一个是蛋白的糖基化。Yanming 等［11，12］的研究表
明，来源于黑曲霉的植酸酶 PhyA 蛋白的糖基化对
PhyA的生物合成和热稳定性至关重要。在黑曲霉
phyA基因编码的氨基酸序列上，发现 10个潜在的 N-
糖基化位点(N-X-S /T，X为任意氨基酸)［14］，有试验
证明其中 6个位置存在糖基化［15］。本研究在侧耳木
霉 T2-1 phyA基因编码的氨基酸序列中发现了 13 个
潜在的 N-糖基化位点，比曲霉 phyA基因编码的氨基
酸序列上的 N-糖基化位点个数多出 3 个，且位置也
不尽相同，但这些位点是否是真正的糖基化位点还需
要试验的进一步证实。
PhyA的另一个关键结构组件为二硫键。二硫键
在维持酶正确的 3-D结构、确保其催化活性上起重要
作用［16］。有研究显示，将含有 4 个二硫键的 E． coli
植酸酶通过定点突变去除其中一个二硫键，能使其酶
活性显著提高，表明其结构域弹性增强会使得酶的催
化效率提高［17］;相比之下，A． niger 和 A． fumigatus
PhyA的 10个半胱氨酸残基形成 5 个二硫键，而侧耳
木霉 T2-1 PhyAT的 8 个半胱氨酸形成 4 个二硫键，
这表明侧耳木霉 PhyAT 的结构域弹性较强，其酶催
化活性可能会比前者更高。
2. 4 侧耳木霉 T2-1 PhyAT蛋白三级结构预测分析
使用 Geno3D 网络服务器(http:/ / geno3d －
pbil． ibcp． fr /cgi － bin /geno3d_automat． pl?page = /
T2GENO3D /geno3d_home． html)对侧耳木霉 T2 － 1
PhyAT 氨基酸序列进行三级结构的预测，返回的
pdb文件用生物大分子三维结构的可视化分析软件
RasMol软件输出结果，见图 5。该三维模型是以
pdb1ihpA-0 为模板，将氨基酸序列的第 24 － 466 位
氨基酸建立起来的模型，E 值为 1． 000000e-104，注
释为磷酸单酯酶(phosphomonoesterase)。从图中可
以看出，一级结构相距甚远的两个活性部位残基
折叠成三维结构后，紧靠在一起，组成了植酸酶
的活性部位，三维结构预测图进一步证明了侧耳
木霉植酸酶与已经确立的植酸酶具有同源性，可
作为进一步构建植酸酶 phyAT 基因表达载体的
材料。
图中侧耳木霉 T2-1 植酸酶 PhyAT 是以结构为着
色模式的飘带模型，该蛋白的活性部位残基 RH-
GARYPT和 HE以空间填充模型显示
图 6 侧耳木霉 T2-1 PhyAT蛋白三维结构预测图
3 结论
在本研究中，我们在国内首次对侧耳木霉 T2-1
植酸酶基因进行了探讨，通过对侧耳木霉 T2-1 植酸
酶基因进行 PCR扩增，获得了含有植酸酶 phyAT编
码基因的完整序列并对其进行基因序列分析、氨基
酸序列分析、信号肽分析、进化树的构建以及其所编
码蛋白的三级结构预测。这为今后用基因工程技术
对微生物植酸酶基因进行研究与开发提供了理论
帮助。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
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(责任编辑 狄艳红)
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