全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
微生物果胶酶研究进展
李祖明1, 2, 3 张洪勋 2 白志辉 2 李鸿玉 3
( 1北京联合大学应用文理学院,北京 100191; 2中国科学院生态环境研究中心,北京 100085; 3北京联合大学师范学院,北京 100011 )
摘 要: 果胶酶是一类分解果胶质的酶的总称, 它能将复杂的果胶分解为半乳糖醛酸等小分子。目前果胶酶在食品、
纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等领域得到广泛应用。果胶酶主要来自微生物。综述了微生物果胶酶生产菌的菌种、
选育、鉴定、发酵方法和发酵条件优化, 酶的分离纯化、酶学性质和分子生物学方面的研究进展,并介绍了果胶酶的应用进展,
最后展望了微生物果胶酶研究的广阔前景。
关键词: 微生物果胶酶 研究现状 展望
Advance inM icrobial Pectinases Research
L iZum ing
1, 2, 3 ZhangH ongxun2 Bai Zh ihui2 L iH ongyu3
(
1
College of A rts and Sciences of B eijing Union University, B eijing 100191;
2
R esearch C enter forE coEnvironmental Sciences, Chinese A cademy of Sciences, Beijing 100085;
3
T eachersCo llege of Beijing Union University, Beijing 100011)
Abstrac:t Pectinase is heterogeneous group o f re lated enzym es that hydro lyze the pectic substances, w hich can break down com
p lex pectin into sim pler m o lecules like ga lacturon ic ac ids. Over the years, pectinases have been w idely used in m any fields, such as
food, m edic ine, tex tile, paperm aking, env ironm ent, biotechno logy and feed. M icrobes are them a in source o f pectinases. The research ad
vance in genus, screening, b reeding, identification, fermentation process and optim izing o f ferm enta tion conditions o f the pectinaseprodu
cing m icroo rganism s w as summarized, as w ell as the separation, pur ification, properties and mo lecu lar bio logy o fm icrobia l pectinases.
Key words: M icrob ia l pectinases Research advance Forecast
收稿日期: 20100120
基金项目:北京市教委科研计划项目 (KM200811417006)
作者简介:李祖明,男,副教授,博士,主要从事食品科学和生物技术方面的教学科研工作; Em ai:l zm l05666@ yahoo. com. cn
果胶质广泛存在于高等植物中, 是植物细胞间
质和初生细胞壁的重要组分,在植物细胞组织中起
着 黏合 !作用 [ 1]。果胶质主要是由 D半乳糖醛酸
以 1, 4糖苷键连接形成的直链状的聚合物 [ 2 ]。
果胶酶 ( pect inase)是指能够催化果胶质分解的多种
酶的总称 [ 3]。果胶酶通常可以分为 3种类型: 第一
类为原果胶酶,降解不溶性原果胶为高度聚合的可
溶性果胶;第二类为酯酶, 通过切除甲基促进果胶酯
的水解;第三类为解聚酶,断开果胶物质中部分 D
半乳糖醛酸的 1, 4糖苷键,分为果胶水解酶和果
胶裂解酶 [ 46]。果胶水解酶的作用是水解果胶糖苷
键;果胶裂解酶的作用是通过 消除反应使糖苷键
断裂, 该酶攻击底物的糖苷键在邻近羧基或酯化的
羧基一边发生 消除。果胶解聚酶又有内切酶和
外切酶之分,内切解聚酶是指该酶随机地切断长链
分子内的糖苷键, 而外切解聚酶是指从链的一端逐
个切断糖苷键 [ 6, 7 ]。果胶酶按其作用最适 pH 又分
为酸性果胶酶和碱性果胶酶 [ 2, 8, 9 ]。
天然来源的果胶酶广泛存在于动植物和微生物
中,但动、植物来源的果胶酶产量低难于大规模提取
制备,微生物因具有生长速度快、生长条件简单、代谢
过程特殊和分布广等特点而成为果胶酶的重要来源,
故微生物是生产果胶酶的优良生物资源 [ 10- 13 ]。果胶
酶作为工业生产领域中的一种重要的新兴酶类,不仅
是人们生活中最早得到应用的酶类之一,而且也是世
界四大酶制剂之一,在全世界食品酶的销售额中约占
到了四分之一;它在食品、纺织、医药、造纸、环境、生
物技术、饲料等方面应用广泛 [ 1, 6, 14 - 23]。主要从以下
2010年第 3期 李祖明等:微生物果胶酶研究进展
几个方面扼要概述了微生物果胶酶目前的研究进展,
并对其发展前景进行了展望。
1 生产果胶酶的微生物
1. 1 果胶酶生产菌种
目前生产微生物果胶酶的菌种很多,来源极其广
泛,包括细菌、霉菌、酵母菌和放线菌。如芽孢杆菌属
(Bacillus)
[ 2, 9, 15, 16, 24 ]、青霉属 (P enicillum ) [ 3, 23, 25- 27]、欧
文氏菌 (E rw inia) [ 7]、根霉属 (Rhizopus) [ 8]、曲霉属 (As
p ergillus )
[ 10, 11, 14, 17, 28]、克 鲁维 酵 母属 ( K luyveromy
ces)
[ 29- 31]、侧孢霉属 (Sporotrichum ) [ 32]、多子菌属 (P ol
yporus)
[ 33]、密螺旋体菌属 (Treponema) [ 34]、酵母属 (Sac
charomyces)
[ 35]、刺盘孢属 (Colletotrichum ) [ 36]、螺孢菌属
(Sp irillospora)
[ 37]、假单胞菌属 (P seudomonas) [ 38]、毛霉
属 (M ucor) [ 39]、毕赤氏酵母属 (P ichia ) [ 40- 42]等。
1. 2 果胶酶生产菌的选育
菌株品质好坏直接关系着能否产生高质量的酶
液,优秀的菌株不仅能提高酶制剂的品质、产量以及
发酵原料的利用率,而且还能增加品种,缩短发酵生
产周期, 改进发酵和提炼工艺条件等 [ 43]。李瑜
等 [ 26]从腐烂苹果中定向分离筛选出适合液态发酵
生产聚半乳糖醛酸酶的菌株 YL9,鉴定为扩展青霉
(P enicillium expansum )。 L i等 [ 44]从碱性土壤中筛
选出一株产碱性果胶酶活力较高的菌株 Bacillus
g ibsonii S2。 Souza等 [ 45 ]从土壤样品中筛选到一株
产内切聚半乳糖酸活力较高的菌株 P eacilomyces
clavisp orus 2A. UM IDA. 1。N oomen等 [ 46]以野生型菌
株 P enicillium occitan is CL100为出发菌株,经亚硝酸
诱变育种后得到一株产果胶酶较高的突变株 P eni
cillium occitanis Po l6,其果胶酶活力高达原始菌株的
50倍。诸葛斌等 [ 47]对基因工程育种得到的产碱性
果胶酯裂解酶 ( PL )的基因工程菌 P ichia pastoris进
行了研究, 使碱性果胶酯裂解酶 ( PL )表达量达到
40. 6 U /mL。
1. 3 果胶酶生产菌的鉴定
目前, 果胶酶生产菌多采用经典法和分子生物
学方法相结合对新分离菌株进行鉴定。杨欣伟
等 [ 11]基于形态学与 ITS序列分子系统进化分析,将
新分离的高产果胶酶菌株 E IM 6鉴定为 Aspergillus
niger。L i等 [ 44]结合经典方法和分子生物学方法将
一株新分离的产碱性果胶酶活力较高的菌株 S2鉴
定为 Bacillus g ibsonii。柯崇榕等 [ 20]基于 18S rDNA
序列的系统发育进化分析将果胶酶高产菌 E IM 4
鉴定为黑曲霉 (A sp ergillus niger)。
2 微生物果胶酶的发酵
2. 1 发酵方法
目前,微生物果胶酶的发酵方法主要有 3种方
法, 包括液态发酵法、固态发酵法和固定化细胞法。
2. 1. 1 液态发酵法 Tari等 [ 48]采用 A sp erg illus so
jae ATCC 20235经液态发酵生产聚半乳糖醛酸酶。
Sharma等 [ 49]采用 Bacillus pum ilus dcsr1经液态发酵
生产高碱性和热稳定性的果胶酶。 Patil等 [ 50]以葵
花盘作为基质,分别接种 Asp erg illus niger DMF 27和
A spergillus niger DMF 45进行液态发酵和固态发酵
生产果胶酶。
2. 1. 2 固态发酵法 Botella等 [ 51]采用葡萄皮渣为
基质,接种 A spergillus aw amori 2B. 361U 2 /1经固态
发酵生产外切聚半乳糖醛酸酶。 Jing等 [ 52]采用 As
pergillus nig er经固态发酵生产果胶酶。 S ilva等 [ 23]
以农产品加工废弃物柑橘皮渣和麸皮为基质, 采用
菌种 P enicillium virid icatum RFC3经固态发酵生产
果胶酶。
2. 1. 3 固定化细胞法 A lme ida等 [ 30 ]研究显示带
循环流动填充床生物反应器更适合固定化 K luyvero
mycesmarx ianus CCT 3172细胞生产果胶酶。A lmei
da等 [ 31]研究表明在带循环流动填充床生物反应器
中, 多空玻璃载体和纤维素载体均适合固定化
K luyveromycesmarx ianus CCT 3172细胞生产果胶酶。
2. 2 发酵条件优化
发酵是菌种产生代谢产物的主要环节,除菌种
固有的遗传因素外,发酵条件是影响产酶的重要因
素。 Patil等 [ 53]以葵花盘作为基质, 分别接种 Asper
gillus niger DMF 27和 DMF 45进行液态和固态发
酵, 结果表明液态和固态发酵的适宜温度和 pH 均
分别为 34∀ 和 pH 5. 0,最佳接种量分别为 1 #105 g /
mL和 1 #107 g /mL, 最大产酶率分别为 12. 6 U内切
果胶酶 /g和 34. 2 U外切果胶酶 /g。Cavalitto等 [ 54]
采用响应面分析法对 Geotrichum klebahnii ATCC
42397产原果胶酶的发酵条件进行了优化, 结果显
示 pH和 Fe2+对原果胶酶产率有显著影响, 在较优
条件下原果胶酶产率达到 236U /mL。
43
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
3 微生物果胶酶的分离纯化
国内外学者对微生物果胶酶的分离纯化进行了
研究, 常采用的分离纯化和鉴定方法有超滤、硫酸铵
沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、聚丙
烯酰胺凝胶电泳、等点聚焦等。Yadav等 [ 55]采用硫
酸铵沉淀、DEAE纤维素和 G100凝胶过滤层析对
Asp erg illus f lavusMTCC 7589所产碱性果胶裂解酶进
行了分离纯化,经 SDSPAGE显示为单一条带; 纯化
酶的最适温度和 pH分别为 50∀ 和 8. 0, Km和 kcat
值分别为 0. 59 mg /mL和 52. 2 S- 1, 酶的分子量为
38 ∃ 01 kD, 具有良好的脱胶能力。 Schnitzhofer
等 [ 56]从 Sclerotium rolf sii CBS 350. 80所产聚半乳糖
醛酸酶粗酶液中经等点聚焦制备电泳得到两个聚半
乳糖醛酸酶分别为 PG1和 PG2, 它们的分子量和等
电点分别为 39. 5 kD和 pI 6. 5与 38 kD和 pI 5. 4,
它们性质非常相似,都是内切聚半乳糖醛酸酶。
4 微生物果胶酶的性质
国内外学者对微生物果胶酶的性质进行了研
究,为果胶酶的深入研究和应用奠定了基础。 Ce
lestino等 [ 57]纯化了 Acrophialophora nainiana所产胞
外果胶酶,纯化酶经 SDSPAGE和质谱得到分子量
分别为 35. 5 kD和 30. 749 kD,最适温度和 pH分别
为 60∀ 和 8. 0, Km 值为 4. 22 mg /mL, 能被 L色氨
酸、DEPC、DTT、DTNB、DTP、L半胱氨酸、巯基乙
醇激活, 却被 NBS、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、A l3+、
Ca
2+抑制, 其 N端氨基酸序列分别与来自 Bacillus
licheniform is和 Xanthomonas campestris的果胶盐裂
解酶有 66和 68%的相似性。Lei等 [ 58]研究发现固
定化果胶酶和未固定化酶的最适温度和 pH相同,
分别均为 65∀ 和 6. 0。
5 微生物果胶酶的分子生物学
近年来, 国内外果胶酶的分子生物学研究进展
很快, 已从许多种属微生物中克隆了果胶酶基因并
测序, 并对果胶酶基因的结构、功能、调控及其表达
产物结构与性能等方面进行了深入探讨。 T jaard
等 [ 59]研究了 Thermotoga maritima所产外切聚半乳
糖乳糖酸酶的晶体结构, 通过对酶活性部分结构的
研究可以解释酶促反应的外切方式及其对非还原端
非甲基化饱和聚半乳糖醛酸的专一性。 Liu等 [ 60]在
P ichia Pastoris中实现了 Bacillus subtilis XZ2产原果
胶酶基因的真核表达。Gonza%lez等 [ 61]研究了 61株
Saccharomyces cerevisiae产酒菌株中的聚半乳糖醛酸
酶活性,寻找其中含有表达内切聚半乳糖醛酸酶的
基因 ( PGU1 )并研究其表达的聚半乳糖醛酸酶活
性, 从中筛选出菌株 S. cerevisiae UCLM S39, 并对其
表达内切聚半乳糖醛酸酶的基因 ( PGU1)进行了克
隆测序。W alker等 [ 62] 对菌株 Treponema pectinovo
rum ATCC 33768中编码果胶盐裂解酶的基因 pelA
进行了克隆和表达,重组酶蛋白的性质与其他细菌
果胶盐裂解酶有相似之处, 它们的最适作用 pH 均
为碱性范围, 酶活对钙离子有依赖性, 锌离子抑制
酶活。
6 微生物果胶酶的应用
6. 1 食品工业
6. 1. 1 饮料加工 Delgado等 [ 63]将果胶酶用于生
产速溶咖啡,发现 Pectinase 444L能有效释放糖类物
质,将底物水解为甘露糖和半乳糖;而 Rohapect B1L
和 Ga lactom annanaseACH分别在浓度为 0. 3和 0. 1
mg /g(蛋白质 /底物 )时对咖啡提取物中沉淀的降
低效果最为理想。Landbo等 [ 64]研究发现提高果胶
酶的浓度、延长反应时间和升高反应温度有利于提
高接骨木果汁的产率,提高果胶酶浓度和升高反应
温度还能够增加接骨木果汁中花色苷类物质的产
率; 进一步采用响应面分析研究发现采用果胶酶
Pectinex BE 3L在较优的处理条件下,接骨木果汁的
最高产率达到 77% (w /w ), 酚类物质最大产率达到
2 380mg /kg(新鲜果泥 )。
6. 1. 2 食品发酵 Ducasse等 [ 65]考察了果胶酶处
理对墨尔乐红葡萄酒中多酚类物质和多糖类物质组
成的影响,结果表明,果胶酶处理能有效降解葡萄果
实的细胞壁,改善了酒中多糖类物质的分子量分布;
经果胶酶处理的红葡萄酒中多糖类物质中鼠李糖半
乳糖醛酸聚糖 &含量较多, 阿拉伯糖和半乳糖含量
较少;果胶酶处理还能改善红葡萄酒中多酚类物质
的组成。Angayarkann i等 [ 66 ]分别从茶叶产品中茶黄
素、茶红素、高聚物、茶汤色泽、干物质含量、可溶性
固形物含量等方面考察了果胶酶粗酶液和纯化酶液
对改善茶叶发酵性能的影响, 结果表明果胶酶粗酶
液的效果明显优于纯化酶液。
44
2010年第 3期 李祖明等:微生物果胶酶研究进展
6. 1. 3 油脂提取 Sowbhagya等 [ 67]研究发现经果
胶酶等酶处理后, 芹菜籽油产率为 2. 2% - 2. 3% ,
而未酶处理芹菜籽油的产率为 1. 8% ; 经 GCMS分
析芹菜籽油的成分表明, 经酶处理后萜烯的主要成
分萜二烯的含量由 63%提高到 82%, 芹子烯含量
为 16% - 17%。N ajaf ian等 [ 68]分别考察了橄榄种
类、果胶酶种类及酶浓度对轻榨优质橄榄油提取的
影响, 结果表明酶浓度对油的产率、多酚类物质、浑
浊度、色泽有显著影响,而对酸度、过氧化值、碘价影
响不明显;油的产率经酶处理后明显提高,由 0. 9%
提高到 2. 4%。
6. 1. 4 绿色食品生产 果胶酶可诱导植物产生抗
病性, 用作生物农药,可用于绿色食品生产, 有利于
食品安全和环境保护。Ba i等 [ 28]将黑曲霉 ( Asp erg il
lus niger )果胶酶用于诱导黄瓜和番茄抗病的研究,
取得良好效果。 Peng等 [ 69 ]研究了草酸青霉 ( Peni
cillium oxalicun )果胶酶诱导黄瓜抗黑星病的作用, 效
果明显。黑曲霉 (Asp ergillus niger )果胶酶在pH3. 0和
37∀ 下酶解壳聚糖得到分子量范围在 20- 50 kD的
低分子量壳聚糖,它们可诱导植物产生抗病性 [ 70]。
6. 1. 5 生物活性成分提取 木犀草素和芹菜苷配
基具有广泛的药理性能,普遍存在于黄酮类物质中。
采用果胶酶等酶制剂水解木豆叶的细胞壁促使木犀
草素和芹菜苷配基从中释放出来, 结果发现果胶酶
提取木犀草素和芹菜苷配基的产率明显高于纤维素
和 葡萄糖苷;在较优酶提条件 (酶浓度 0. 4mg /mL、
pH3. 5- 4、温度 30- 35∀ 、反应时间 18 h)下, 木犀草
素和芹菜苷配基的提取产率分别 0. 268和 0. 132 mg /
g,分别较未处理的提高 248%和 239% [ 71]。
6. 1. 6 食品添加剂生产 瓜尔半乳甘露聚糖解聚
得到的分子量较小和粘度较低的物质可作为可溶性
膳食纤维用于功能保健食品。 Shobha等 [ 72]将黑曲
霉 (A sp erg illus niger )果胶酶用于解聚瓜尔甘露聚
糖,结果发现天然瓜尔甘露聚糖的分子量可达 240
kD,半乳糖与甘露糖的比值 ( G∋M )为 1∋1. 6;经果胶
酶解聚 60 m in后主产物分子量可达 70 kD, 半乳糖
与甘露糖的比值 ( G∋M )为 1∋2. 8, 室温 30 m in后水
中溶解度可达 98%, 而天然瓜尔甘露聚糖的溶解度
只能达到 60%。
6. 2 医药工业
Guan等 [ 73]基于酶解法和色谱分析研究了 9种
不同中药中多糖的图谱并进行比较鉴别,采用的酶
有果胶酶、纤维素酶、葡聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、木聚
糖酶、半乳聚糖酶等,结果表明 9种不同中药中多糖
的特征图谱差异显著,可用于改进中药多糖产品的
质量控制。
6. 3 纺织工业
6. 3. 1 棉纤维的生物精炼 H ebe ish等 [ 74]研究发
现生物精炼的棉织物性能与传统碱液精炼相当,
EDTA和 环状糊精结合果胶酶和纤维素酶对棉织
物进行生物精炼效果更好, 对环境友好。 Shafie
等 [ 75]研究发现采用过乙酸漂白结合果胶酶或纤维
素酶生物精炼对棉织物进行处理效果很好, 产品湿
润性和白度等性能良好。
6. 3. 2 植物韧皮纤维的脱胶 可采用果胶酶等酶
制剂及其微生物对麻类中植物韧皮纤维进行脱胶,
目前由于酶法脱胶成本较高限制了其推广应用 [ 76]。
Evans等 [ 77 ]采用聚半乳糖醛酸酶对麻类韧皮纤维进
行脱胶,结果发现 Asperg illus niger聚半乳糖醛酸酶
处理后优质纤维同未处理相比提高 62%, 而纤维强
度没有差异。
6. 4 造纸工业
果胶酶可以将果胶或聚半乳糖醛酸降解, 减少
阳离子聚合物的消耗量,提高纸浆的质量 [ 78]。Dhi
man等 [ 79]研究发现在 70∀ 、pH 9. 5、酶浓度 5U /g条
件下,果胶酶和木聚糖酶结合的酶法漂白与化学漂
白相比可降低 20%的 C l2消耗量,可节省 35. 71%的
C lO2消耗量, 并且纸浆的性能也得到明显改善。
6. 5 环境领域
E lSheekh等 [ 80] 采用 Aspergillus carneus NRC1
利用柑橘皮渣废弃物经液态发酵生产果胶酶, 得到
较优的产酶条件为:温度 30- 55∀ 、pH5. 0- 5. 5、发
酵时间 5 d,柑橘皮渣废弃物 ( 6%, w /v)是较优的惟
一碳源;硫酸铵作为惟一氮源可明显促进果胶酶的
生产。W ilk ins等 [ 81]考察了果胶酶等酶制剂酶解葡
萄皮渣废弃物生产葡萄糖, 结果表明, 5 mg果胶酶 /
干基、2 mg纤维素酶 /干基和 2. 1 mg 葡萄糖苷
酶 /干基可获得较大的葡萄糖产率。
45
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
6. 6 生物技术领域
M ielenz等 [ 82]采用菌株 Saccharomyces cerevisiae
D5A以豆皮为原料经同步糖化发酵工艺生产燃料
酒精, 结果发现不必进行预处理就能获得较高的酒
精产率,果胶酶、纤维素酶和 葡萄糖苷酶的合适
添加量为生物质的 15%, 可得到 25- 30 g /L的酒精
浓度; 而豆皮中蛋白质含量达 25%, 显著高于原始
豆皮的 10%。
6. 7 饲料工业
添加饲用酶制剂能补充动物体内酶源的不
足, 增加动物自身不能合成的酶,从而促进畜禽对
养分的消化、吸收, 提高饲料的利用率, 促进生
长 [ 83]。果胶酶是降解饲料抗营养因果胶的有效
酶, 它作为一种绿色饲料添加剂在畜牧业生产中
的应用越来越广泛 [ 84]。张礼星等 [ 85]研究表明果胶
酶的添加可显著提高全期增重, 降低料肉比, 干物
质、粗蛋白、有机物和粗纤维的消化率提高了 11% -
22. 5%。
7 展望
随着经济的发展, 人们生活水平的提高, 健康、
环境、资源和能源越来越受到人们的重视,现代分子
生物学和酶工程在现代生活中的作用越来越突出。
微生物是果胶酶的重要来源。微生物果胶酶种类繁
多、来源广泛、结构复杂、性能各异、生产条件和作用
方式多样、分离纯化手段灵活多变、应用领域十分广
泛、发展前景极为广阔。近年来国内外许多学者对
果胶酶生产菌株的筛选、育种、鉴定、发酵、酶的分离
纯化与酶学性质以及酶的分子生物学特性与应用等
方面进行了大量的研究, 这极大地促进了果胶酶的
深入研究及其在包括食品和纺织工业在内的许多领
域的广泛应用,从而使资源得到循环利用,有利于环
境保护、人体健康和减缓能源危机,具有极大的经济
和社会效益。以后有关果胶酶分子生物学和酶工程
的研究将成为热点, 通过蛋白质工程技术和定点突
变使果胶酶在不同的研究和应用环境中保持良好的
活性和稳定性, 以满足研究和应用的实际需要。将
来在分子水平上果胶酶分泌的调节机制以及不同果
胶酶作用于不同果胶物质的作用机理将成为果胶酶
研究的重要方向。
参 考 文 献
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科学出版社新书
核酸酶学 ∗ ∗ ∗ 基础与应用
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