全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第1期
收稿日期:2007-08-21
基金项目:河北科技大学科研基金资助课题
作者简介:张燕(1987-),女,四川乐山人,硕士研究生;研究方向:铁代谢分子生物学
通讯作者:王莉,副教授,E-mail:smartli77@163.com
铁是人体重要微量元素,体内贮存铁减少,不仅引起贫血,而且含铁酶和铁依赖酶活性降低引起非造
血系统表现,对人体智力、体格发育、免疫功能、消化吸收功能、劳动能力等均有较大影响[1],已被世界卫生
组织(WHO)列为全球四大营养性疾病之一。
铁缺乏可造成贫血、智障等多种疾病。而铁过量则可促发产生大量自由基,引起神经退行性变及与许
多与老年相关的疾病[1~3]。因此,人体存在着严格的铁代谢调节机制,可以确保体内铁始终处于正常生理水
平。这种机体铁稳态(ironhomeostasis)关键依赖于小肠铁吸收和机体铁需要之间的平衡。当机体缺(或需
要)铁时,小肠铁吸收会相应增加,而机体铁含量太高时,小肠则会减少铁吸收[4]。然而,机体通过何种机制
控制小肠铁吸收,或小肠是如何感受到机体铁水平变化的信息后调节自身的铁吸收量一直没有研究透彻。
经过几十年的努力,对这一铁代谢领域中极其重要问题的理解几乎没有什么进展。直到最近,hepcidin及其
与铁代谢之间关系的意外发现才使这个问题的答案渐见清晰。研究显示 hepcidin很可能是一种控制小肠
铁吸收及调节体内铁稳态的关键物质,是一种极为重要的铁调节激素[5,6]。hepcidin表达的缺乏会导致组织
pGEM-8Hepc克隆载体的构建与序列分析
张燕 高小倩 王莉 史建红 韩美玲 刘缇 李敏
(河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄 050018)
摘 要: hepcidin是一种由肝脏合成的富含半胱氨酸的小分子肽,它的主要生物学功能是维持机体铁稳态,并且具
有抗菌活性。本实验从大鼠肝脏组织克隆出 hepcidin基因,用同尾酶法构建多拷贝串联基因克隆载体 pGEM-nHepc
(n=1,2,4,8)(单个hepcidin基因之间用一段连接肽的DNA连接),分别含有不同拷贝首尾串连的hepcidin cDNA,并在
大肠杆菌DH5α中扩增。重组体经双酶切和PCR鉴定后进行序列测定,所得结果与genbank中的大鼠序列比对,结果完
全正确,为后续进一步的表达纯化奠定了基础。
关键词: hepcidin 克隆载体 铁稳态 串联基因
ConstructionofpGEM-8HepcCloningVectorandthe
SequenceAnalysis
ZhangYan GaoXiaoqian WangLiShiJianhong HanMeiling LiuTiLiMin
(ColegeofBiosienceandBioengineering,HebeiUniversityofScienceandTechnology,Shijiazhuang050018)
Abstract: Hepcidinisalow-molecular-weight,cysteine-richantimicrobialpeptideexpresedinliverrelevantto
smalintestineironabsorptionandbodyironhomeostasis.Hepcidingenewasclonedfrom ratliverandpGEM-nHepc
(n=1,2,4,8)multicopycloningvectorswereconstructedwithisocaudamersmethodandthehepcidincodingfragment
weretandemlylinkedtoyieldaseriesofclones.AfterpolymerasechainreactioninDH5α E.coli,pGEM-nHepcwere
identifiedwith doubledigestingandPCR.Then DNA sequencingwasperformedin ShanghaiSangon Biological
EngneeringTechnology& ServicesCo.,Ltd.andthesequenceanalysisresultswerecomparedwiththoseingenbank.
Theywerematchingexactlytoeachother,sothisstudycanbeareferencetothenextexperimentofexperisionand
purification.
Keywords: Hepcidin Cloningvector IronhomeostasisTandemgene
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
铁沉积,而高表达 hepcidin的转基因鼠则出现了严重的铁缺乏。
由于天然 hepcidin为一种激素类多肽,人体正常生理状态下体内含量很低,如果通过从人尿液或是血
液中分离提取,不但成本高且获取困难;若通过化学合成法,由于 hepcidin小肽分子具有 4对二硫键,使得
合成比较困难,合成后的收率低,不易纯化且价格昂贵,并且不能保证其有效的生物活性,同样无法满足对
其生物学功能的进一步研究和临床应用的需要[7]。因此,本实验先扩增出目的基因,然后建立一种构建多
拷贝串联 hepcidin基因的方法,为小肽的串联表达、抗体制备及临床应用提供了理论和实验依据[8]。
1 材料与方法
1.1 实验材料
E.coli菌株 DH5α由本室保存,pGEM-T克隆载体购自 Promega公司,限制性内切酶 KpnⅠ,BamHⅠ,
BglⅡ,HindⅢ和 T4DNA连接酶均购自 TaKaRa生物制品公司。其他试剂均为分析纯或化学纯。
1.2 实验方法
1.2.1 目的基因的获得 首先用 Trizol一步法从大鼠肝脏中提取出总 RNA,通过 RT-PCR扩增含 hepcidin
前体肽全部开放阅读框的 cDNA序列。根据 GeneBank提供的大鼠 hepcidinDNA序列信息,应用 Omiga引
物设计软件设计扩增其全长编码序列的 DNA引物,上游引物 1(含 sacⅠ酶切位点):5-CAAGATGGCA
CTAAGCACT-3,下游引物 1(含 kpnⅠ酶切位点):5-GCTCTCTATGTTATGCAAC-3。RT-PCR的简要步
骤:应用逆转录试剂盒(ReverseTranscriptionSystem,Promega,USA)将总 RNA逆转录为双链 cDNA;随后分
别应用各自相对应的引物,用 TaqDNA聚合酶(北京鼎国生物工程公司)进行 PCR反应(94℃1min,62℃
1min,72℃1min,30个循环),大量合成 hepcidin基因片段。对 PCR反应液进行 2%的琼脂糖凝胶电泳,用
UVP-GD800凝胶分析仪观察并记录结果,切胶回收目的 DNA片段。
然后,再利用半巢式 PCR扩增出所需片段,用 8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,可观察到长度为 110
bp的清晰条带。上游引物 2(含 BamHI酶切位点):5-TGAGCTCTACAAGGATCCAGACACCAACTTC
CCCAT-3,下游引物 2(含 BglⅡ酶切位点):5-ATA(G)AGCTTGGTACCTCAATGGTGATGGTGATGA
TGGAGATCTGTTATGCAACAG-3。
1.2.2 pGEM-Hepc单拷贝克隆载体的构建 将从凝胶中回收的 hepcidin扩增产物与 pGEM-T载体在 T4连
接酶的作用下,4℃连接 12h,并转化 DH5α感受态细胞,经氨苄及蓝白斑筛选阳性菌落。挑取白色菌落扩大
培养,扩培后提取质粒,用限制性内切酶 BamHⅠ和 HindⅢ酶切做初步鉴定,并将构建好的重组体命名为
pGEM-Hepc。
1.2.3 hepcidin多拷贝克隆载体 pGEM-nHepc的构建 扩增后的序列在限制性内切酶的作用下,再进行切
割、连接、转化、筛选。整个构建过程由低拷贝到高拷贝逐步进行,最终获得八拷贝克隆载体 pGEM-8Hepc。
简要过程如下:重组体 pGEM-Hepc的上下游分别有 BamHⅠ和 BglⅡ的酶切位点,且为同尾酶,其下游还有
HindⅢ的酶切位点。将 pGEM-Hepc重组载体用限制性内切酶 BamHⅠ和 HindⅢ进行双酶切,双酶切产物经
8%聚丙烯酰胺凝胶鉴定后,回收大约 110bp的 hepcidin单拷贝基因片段;再将 pGEM-Hepc用限制性内切
酶 BglⅡ和 HindⅢ进行双酶切,双酶切产物经 8%聚丙烯酰胺凝胶鉴定后,回收大于 2000bp的载体片段。
按照载体和目的基因摩尔比 1:4的比例,加入 T4连接酶,于 16℃连接过夜。将重组子转化 DH5α感受态细
菌,培养观察。将构建好的重组体命名为 pGEM-2Hepc。同样方法依次构建四,八拷贝的重组体,依次命名
为 pGEM-4Hepc和 pGEM-8Hepc。随机挑取转化成功菌落,并抽提质粒进行双酶切及 PCR鉴定。将含有插
入目的基因的阳性克隆送上海生物工程公司进行序列测定。
2 结果
2.1 大鼠肝脏总 RNA的提取及 hepcidin基因的扩增
用 Trizol一步法从大鼠肝脏中提取出总 RNA,经 2%的琼脂糖凝胶鉴定得到明显的两条亮带,分别为
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28s和 18s。并且 28s的更亮一些,说明 RNA提取成功。以此为模板制备的 hepcidin基因片段经 PCR扩增得
到大约 110bp的条带(图 1、图 2)。
图 1 RNA提取鉴定结果图 图 2 pGEM-HepcPCR结果
M为 marker 1为 hepcidin单拷贝,长度为 110bp
2.2 pGEM-2Hepc重组载体的构建及酶切和 PCR鉴定
重组体 pGEM-2Hepc的上下游分别有 BamHⅠ和 HindⅢ的酶切位点,用这两种酶进行重组体的双酶
切,产生大约 200bp的条带。经过 PCR鉴定,获得的二拷贝目的条带约 250bp(图 3、图 4)。
图 3 pGEM-2Hepc质粒的酶切鉴定 图 4 pGEM-2Hepc的 PCR鉴定
1、2、3、4分别为 pGEM-2Hepc的 1、2、3、4号质粒 M为 marker
2.3 pGEM-4Hepc和 pGEM-8Hepc重组载体的构建和酶切及 PCR鉴定结果(图 5、图 6)
把构建好的质粒转化大肠杆菌,经过抗性初步筛选后,随机挑取单克隆菌斑培养,提取质粒。重组体
pGEM-4Hepc和 pGEM-8Hepc的上下游同样分别有 BamHⅠ和 HindⅢ的酶切位点,根据双酶切重组体鉴
定:pGEM-4Hepc的酶切目的条带约 350bp,pGEM-8Hepc的酶切目的条带约 700bp。经过 PCR鉴定,通过
DNA标准分子质量显示,目的基因的相对分子质量分别为:四
拷贝扩增出 400bp的条带,八拷贝扩增出 750bp的条带,与目
的基因片段大小一致,说明为阳性克隆。
2.4 序列测定
克隆重组质粒pGEM-2Hepc经上海生物工程公司(Shanghai
SangonBiologicalEngineeringTechnology&ServiceCo.Ltd)测序
分析,目的基因片段与 genbank中的大鼠序列比对结果完全正
确,说明此连接方法在本实验设计中是可行的。具体序列如
下:GAGCTCTACAAGGATCCAGACACCAACTTCCCCAT
ATGCCTCTTCTGCTGTAAATGCTGTAAGAATTCCTC
图 5 pGEM-4hep和 pGEM-8hep双酶切结果
M为 marker 1、2为 pGEM-4Hepc的双酶切结果
3、4为 pGEM-8Hepc的双酶切结果
张燕等:pGEM-8Hepc克隆载体的构建与序列分析 119
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CTGTGGTCTCTGTTGCATAACAGATCCAGACAC
CAACTTCCCCATATGCCTCTTCTGCTGTAAATGCTG
TAAGAATTCCTCCTGTGGTCTCTGTTGCATAACAGA
TCTCCATCATCACCATCACCATTGAGGTACCAAGCT
TAT。
pGEM-8Hepc经上海生物工程公司测序分析,目的基
因片段与 genbank中的大鼠序列比对同样序列完全正确。
3 讨论
hepcidin是哺乳动物体内一种重要的铁调素,对维持
机体内的铁稳态有着重要的作用。它参与机体铁稳态的调
控,在铁代谢方面主要的生物学功能为抑制肠道铁吸收和
抑制单核巨噬细胞系统铁释放。在维持机体铁稳态和 ACD发病机制中起着关键作用。
将外源基因串联在一起进行表达,是增加基因剂量的一种方法。由于天然 hepcidin为一种激素类多
肽,人体正常生理状态下体内含量很低,单拷贝在细菌中的表达量也不高。为了能高效的表达 hepcidin基
因构建了 hepcidin的八拷贝片段。质粒载体的高拷贝数常与目的基因的剂量相对应。许多报道表明,质粒
拷贝数的增加可使目的蛋白产量提高,这种相应的关系甚至在质粒拷贝数大于 300时还存在。然而,在正
常情况下,特定的质粒在某一宿主中的拷贝数不是可以无限增加的,从而使基因剂量的增加受到限制。
构建多拷贝基因,目前最常用的方法是先合成单拷贝基因,然后自身随机串联,一次连接便可得到不
同拷贝数的串联体[9]。方法步骤简便,但偶然性较强,单体的串联方向与拷贝数均难以人为控制,且往往最
终得不到串联体,不适合低拷贝串联基因的构建。另一种常用的方法是将多拷贝的基因片段分成数段一次
性合成,然后通过化学拼接,连成 1个完整的多拷贝基因片段。此种方法虽然解决了串联方向难以控制的
问题,但增加了基因合成成本,限制了基因片段的拷贝数。也有文献报道用 PCR法,多次扩增可获得不同
拷贝数的串联基因[10],但同样存在无法控制拷贝数的问题,不适合低拷贝串联基因的构建。本实验采用同
尾酶法[11],连入单个基因的同时形成完整的连接肽基因序列,并且形成的位点不会被先前的内切酶识别,
便于进行下一轮的酶切、连接。虽然每增加 1个拷贝就得做 1次克隆,但对于 1~8拷贝的串联基因,实验过
程并不复杂,而且可以人为控制拷贝数,在构建低拷贝串联基因方面更优于前面提到的几种方法[12]。
利用限制性内切酶对目的基因进行双酶切,产生互补的粘性末端,在 T4连接酶的作用下,二者之间能
够形成磷酸二酯键,从而目的基因和载体片段就可以连接到一起。在连接时,载体和目的基因之间的比例
约为 1:4比较合适。但连接效率还受到多种因素的影响,如温度,连接时间的长短等。
大鼠 hepcidin目的基因仅为 75个碱基,片段较小,串联比较容易。目前国内外尚无类似实验。因此,本
实验中通过将 hepcidin单拷贝基因串联而成多拷贝,并且与 pGEM-T载体连接,成功构建了 pGEM-8Hepc
重组载体,为 hepcidin在医学或其他方面的应用奠定了坚实的基础。另外,pGEM-8Hepc克隆载体的成功构
建也为后期 hepcidin串连基因的表达、纯化以及抗体的制备等实验提供了理论及实验数据的参考,在临床
开发 hepcidin药物(海魄喜定在制药中的应用,国家专利号:ZL02146309.3,Nov.3,2004)研究方面具有重要
意义。
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图 6 pGEM-4Hepc和 pGEM-8HepcPCR结果鉴定
M为 marker 1为 pGEM-4Hepc的 PCR结果图
2为 pGEM-8Hepc的 PCR结果图
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件分析了两种银染照片的色阶图,结果发现虽然 Sanguineti法的背景色较深,但在色阶图上出现背景色和
扩增带两个峰,而 Bassam法的背景和扩增带在色阶图上混为一个较大的峰。上述结果表明,Sanguineti法
的背景色和扩增带区别非常明显,从而应用 Sanguineti法更容易判读 PCR扩增带,这与以往通过感观判断
得出的结论有所不同,同时也说明,利用计算机技术等现代化检测分析手段,可以使我们的认识更加深入,
研究结果更加精确。
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