全 文 ：第 29 卷第 4 期 齐 齐 哈 尔 大 学 学 报 Vol.29,No.4
2013 年 7 月 Journal of Qiqihar University July,2013
毛尖紫萼藓 GpPOD基因克隆及其表达载体的构建
宋璐，沙伟，张梅娟，刘博，安洪雪
（齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

摘要：本实验室已成功构建毛尖紫萼藓干旱胁迫 cDNA 文库。从中选取与抗旱相关的过氧化物酶基因，命名为
GpPOD。通过 RACE 技术克隆获得序列全长。采用 RT-PCR 方法克隆 GpPOD 基因，连接到 pMD-18T simple 载体
上，构建克隆载体 pMD18T-GpPOD，将其插入表达载体 PRI101-AN 中，构建表达载体 PRI101-GpPOD，然后将
重组质粒导入根癌农杆菌 EHA105 中。重组质粒 pMD18T-POD、PRI101-POD 的 DNA 测序结果与原序列相似性
高达 99%，证明 GpPOD 基因成功连接到 pMD-18T simple 载体上，并已克隆到表达载体 PRI101-AN 中；农杆菌
转化后的 PCR 电泳图谱在约 581 bp 左右得到清晰条带，证明重组质粒 PRI101-GpPOD 已成功转入农杆菌中。本
实验为后续研究 GpPOD 基因的遗传转化奠定了良好基础。
关键词：毛尖紫萼藓；GpPOD；克隆载体；表达载体；根癌农杆菌 EHA105
中图分类号：Q343.1 文献标志码：A 文章编号：1007-984X(2013)04-0005-05

干旱胁迫一直是制约我国农作物发展的重要问题，根据对全国干旱及灾害特征和变化分析可知,全国干
旱灾害严重程度、持续时间和旱灾发生范围都呈现出增加的趋势,在北方地区,增加趋势更为明显,因此干旱
灾害的问题不容忽视[1,2]。研究认为逆境胁迫下植物体内会产生的大量活性氧（Reactive oxygen species，ROS），
ROS 过剩积累会造成膜系统、蛋白质和 DNA 分子结构等损伤[3]。过氧化物酶是具有较高活性的一种氧化还
原类酶，广泛存在于在动物、植物和微生物体内，主要催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应，分
解生物体内的氧化物或过氧化物及其它毒素，植物过氧化物酶属于双功能酶,既可以还原细胞内积累的 H2O2,
也可以降解逆境和生长条件下产生的活性氧，是细胞抵御活性氧伤害的重要酶系统[4-7]。
苔藓植物是一类由水生向陆生过渡的高等植物，很多种类的苔藓具有独特的结构特征和耐旱性，可以
随着环境变化来调节体内的含水量，在干旱环境下，可将含水量调制最低以休眠状态继续生存[8]。毛尖紫
萼藓（Grimmia pilifera）是紫萼藓科（Grimmiace）紫萼藓属（Grimmia）中典型的旱生植物，广泛分布于
我国南北各省，生于不同海拔地区裸露光照强烈的花岗岩石上或林下石面上[9]，是进行植物抗旱性研究的
理想材料之一。
本研究从已成功构建的毛尖紫萼藓干旱胁迫 cDNA 文库中选取与抗旱相关的过氧化物酶基因，命名为
GpPOD，采用 RACE 技术克隆出 GpPOD 基因全长。将 GpPOD 基因构建到植物表达载体 PRI101-AN 中，
并转入根癌农杆菌 EHA105，为后续研究 GpPOD 基因的遗传转化奠定了良好基础。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
毛尖紫萼藓采自黑龙江省五大连池风景区，清洗干净后复水培养 5-6 d，取材，放-80℃冰箱备用。
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 菌株由本实验
室提供，克隆载体pMD-18T simple、T4 DNA连接酶、植物表达载体PRI101-AN和DNA marker均购自TaKaRa
公司，胶回收试剂盒购自北京三博远志生物技术有限公司，PCR 试剂、质粒提取试剂盒购生工生物（上海）
有限公司，逆转录酶、限制性内切酶 BamHⅠ和 NdeⅠ购自 Promega 公司，其他化学试剂等购自国内生产厂
家，均为分析纯。

收稿日期：2013-03-09
基金项目：国家自然科学基金资助（31070180，31270254）
作者简介：宋璐（1988-），女，黑龙江省齐齐哈尔人，在读硕士研究生，主要从事苔藓植物遗传学和分子生物学研究，songlulu1988@126.com。

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1.2 方法
1.2.1 RNA 的提取及逆转录反应
将材料从-80℃取出，迅速放入预冷的研钵中，加入液氮快速研磨，将研磨好的材料均匀分装于 1.5 mL
离心管中，采用改良的 SDS 法提取总 RNA[10]，利用 DNA 消化酶去除总 RNA 中的 DNA，将提纯的 RNA 进
行 1%琼脂糖凝胶电泳，然后根据逆转录酶说明书进行逆转录，得到单链 cDNA。
1.2.2 GpPOD 基因的克隆
从实验室已经构建好的毛尖紫萼藓干旱胁迫 cDNA 文库中，选取与抗旱相关的过氧化物酶基因，根据
RACE 后的全长序列，用 ORF Finder 程序找到其开放阅读框，用 Primer 5.0 软件根据该基因的 CDS 区设计
引 物 ， 由 上 海 生 工 生 物 有 限 公 司 合 成 上 下 游 引 物 分 别 为 ： 上 游 引 物 F1 5’-GGAATTC
CATATGTGATACACCACTTGGGTTGCT-3’，下游引物 R1 5’- CGCGGATCCAGTAACATTCAAGAGCCACC G-3’
（划线部分分别为 NdeⅠ和 BamHⅠ的酶切位点），20 μL 反应体系：Buffer 2 μL，Mg2+ 0.6 μL，dNTP 0.3 μL，
cDNA1.5 μL，F1 0.8 μL，R1 0.8 μL，Taq 酶 0.2 μL，ddH2O13.8 μL。PCR 反应程序为：94℃5 min；94℃30 s，
57℃45 s，72℃ 1 min，35 个循环；72℃延伸 10 min。将 PCR 得到的目的片段用北京三博远志生物技术有限
公司的胶回收试剂盒进行回收。
1.2.3 构建克隆载体 pMD18T-GpPOD
将回收的目的片段与 pMD-18T simple 载体连接，5 μL 反应体系：pMD-18T simple Vector 0.5 μL，目的
片段 2 μL，SolutionⅠ 2.5 μL，16℃过夜。将连接产物转入大肠杆菌 DH5α，在含有 Amp、IPTG 和 X-Gal
的 LB 固体培养基上 37℃倒置过夜培养。蓝白斑挑选阳性菌落，用生工生物（上海）有限公司的质粒提取
试剂盒提质粒，以质粒为模板，PCR 体系同上，双酶切体系：质粒 10 μL，BamHⅠ 1 μL，NdeⅠ 1 μL，10
×D Buffer 2 μL，ddH20 6 μL，共 20 μL。37℃，酶切 4 h，回收小片段，-20℃保存。选择酶切鉴定正确的菌
液送到华大基因进行测序。
1.2.4 PRI101-GpPOD 表达载体的构建
选取含有 pMD18T-GpPOD 基因的重组质粒用 BamHⅠ和 NdeⅠ双酶切消化后回收小片段，将植物表达
载体转入大肠杆菌 DH5α 中，提取 PRI101-AN 质粒用 BamHⅠ和 NdeⅠ双酶切消化后回收大片段，将两个
片段用 T4 连接酶连接，T4 Buffer 1 μL，T4 连接酶 0.5 μL，回收的目的片段 5 μL，回收的载体片段 2.5 μL。
连接产物加入 1 μL 3M CH3COONa（pH5.2），加入 25 μL 的冷无水乙醇，-20℃放置 60 min，4℃ 12 000 r/min，
离心 10 min，70%冷乙醇洗沉淀，4℃，12 000 r/min 离心 10 min， TE 溶解沉淀。连接产物转入大肠杆菌 DH5α
感受态细胞，混匀，冰浴 30 min，42℃热激 90 s，勿摇置于冰上 3 min，加入 900 μLLB 液体培养基，37℃振
荡 60 min，5 000 r/min 离心 4 min，弃上清，加入 60 μLLB 液体培养基悬菌，涂布在含有 50 mg/L 卡那霉素的
LB 固体培养基上，筛选阳性菌落。提质粒，进行质粒 PCR、酶切及测序验证目的片段是否连接到表达载体
PRI101-AN 上。将验证连接成功的质粒 PRI101-GpPOD 通过冻
融法转入根癌农杆菌 EHA105 感受态细胞，在含有利福平和卡那
霉素的 LB 平板上筛选阳性克隆，从菌液中提取质粒并进行 PCR
鉴定。
2 结果与分析
2.1 毛尖紫萼藓 GpPOD基因 cDNA克隆
以毛尖紫萼藓为材料的总 RNA 电泳结果（图 1A）中可以清
晰看出 28 s、18 s 条带，说明总 RNA 完整性良好，可以进行后续
实验。以毛尖紫萼藓 GpPOD 基因 cDNA 为模板，通过引物 F1、
R1进行扩增，获得大小约 581 bp 的目的片段（图 1B）。
2.2 克隆载体 pMD18T-GpPOD的鉴定
2.2.1 质粒 PCR 鉴定
回收的目的片段与 PMD-18T simple Vector 连接,转化，筛选
图 1 毛尖紫萼藓 GpPOD 基因 cDNA 扩增结果
A：1-2.毛尖紫萼藓总 RNA
B：1-2. GpPOD 基因；M.DNA Marker

第 4 期 毛尖紫萼藓 GpPOD 基因克隆及其表达载体的构建 ·7·
阳性菌落，提取重组质粒，进行质粒 PCR，电泳图谱（图 2）显示在
约 581 bp 左右处出现条带，条带大小与目的片段大小一致。
2.2.2 重组质粒酶切鉴定
酶切结果显示在约 3 273 bp、581 bp 左右出现条带（图 3），并且
条带大小与目的片段大小一致，说明已成功构建克隆载体
pMD18T-GpPOD。将 PCR、酶切鉴定正确的菌液，邮到华大基因测序
部，测序结果显示克隆载体序列与原序列相似性高达 99%。
2.3 表达载体 PRI101-GpPOD的鉴定
2.3.1 重组质粒 PRI101-GpPOD 基因 PCR 鉴定
重组质粒 pMD18T-GpPOD 与表达载体 PRI101-AN 连接后，转化、
筛选阳性菌落，提取质粒，对重组质粒进行 PCR 鉴定，琼脂糖凝胶电
泳图谱显示约 581 bp 左右出现条带（图 4）。
2.3.2 重组质粒 PRI101-GpPOD 酶切鉴定
对 PCR 鉴定正确的质粒进行酶切验证，看是否存在假阳性。将
表达载体 PRI101-AN 与重组质粒进行 BamHⅠ和 NdeⅠ双酶切消化
进行凝胶电泳，结果显示在约 11000 bp 和 581 bp 左右出现清晰条带
（图5），证明GpPOD基因已被成功克隆到表达载体PRI101-AN中。
将 PCR、酶切验证含有目的片段的菌液，邮到华大基因测序部测序，
结果显示重组质粒表达载体序列与原序列相似性高达 99%。
2.4 根癌农杆菌 EHA105 转化子的 PCR鉴定
提取农杆菌 EHA105 转化子质粒，进行 PCR 鉴定，1%琼脂糖
凝胶电泳结果显示，PCR 产物在约 581 bp 处有条带（图 6），证明
PRI101-GpPOD 已成功转入农杆菌 EHA105 中。

3 讨论
过氧化物酶是植物细胞内重要的组成成分，不同的过氧化物酶基因具有不同的表达模式。目前已报道
多种植物的不同类型过氧化物酶的研究[11,12]。如 Kornyeyev 等（2001）将 SOD、tAPX、谷光甘肽还原酶基因
分别转入棉花中，外源基因得到过量表达，所有转基因棉花具有较高的 PSnⅡ光化学活性和抗氧化能力[13]。
HushPulian 等（2003）将烟草离子型过氧化物酶基因编码区构建到原核表达载体 pET40b 中，获得了烟草
离子型过氧化物酶重组蛋白[14]。林玲（2006）将葡萄抗坏血酸过氧化物酶（APx）的 cDNA 克隆到原核表达
载体中，在大肠杆菌中进行表达，获得了高纯度、高活性重组蛋白，制备了抗体蛋白，证明过氧化物酶具

1. GpPOD 基因；M.DNA Marker
图 4 质粒 PRI101-GpPOD PCR 产物电泳图

1. PRI101-GpPOD 的双酶切；M.DNA Marker
图 5 重组质粒 PRI101-GpPOD 双酶切产物电泳图

M.DNA Marker；1. GpPOD 基因
图 6 农杆菌转化子中 GpPOD 基因 PCR 电泳图

1.GpPOD 基因；M.DNA Marker
图 2 pMD18T-GpPOD 质粒 PCR 产物电泳图

1. pMD18T-GpPOD 的双酶切；
2.pMD18T-GpPOD；M.DNA Marker
图 3 重组质粒 pMD18T-GpPOD 双酶切电泳图

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有免疫原性[15]。Kim 等（2008）研究发现，甜薯过氧化物酶基因（swPa4）可以被不同的非生物胁迫和病原
菌所诱导，将该基因转入到烟草中能够提高烟草的胁迫耐性，并推测该基因在过氧化氢调控的胁迫响应信
号通路中可能起到一个有利的防御信号的作用[16]。但对藓类植物的过氧化物酶基因研究鲜有报道，因此，
本实验的研究也进一步丰富了植物过氧化物酶的基因资源。
本研究从毛尖紫萼藓中克隆过氧化物酶 GpPOD 基因，采用 pMD-18T simple 载体成功构建克隆载体
pMD18T-GpPOD，并将其构建到表达载体 PRI101-AN 上，经过抗性筛选，PCR、酶切以及测序鉴定，证
明已成功构建毛尖紫萼藓 GpPOD 基因的植物表达载体，命名为 PRI101-GpPOD。将携带有 PRI101-GpPOD
基因的重组质粒转入根癌农杆菌 EHA105，通过 PCR 方法检测农杆菌转化子，证明植物表达载体
PRI101-GpPOD 成功转入根癌农杆菌 EHA105 中，为后续研究 GpPOD 基因的遗传转化奠定了基础。
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Cloning and expression vector construction of GpPOD gene from Grimmia pilifera
SONG Lu，SHA Wei，ZHANG Mei-juan，LIU Bo，AN Hong-xue
（College of Life Sciences and Agriculture and Forestry，Qiqihar University，Heilongjiang Qiqihar 161006，China）

Abstract：cDNA library was succeed constructed with Grimmia pilifera drought stress in the laboratory. A
peroxidase gene was selected to drought resistance and named GpPOD. The full-length sequence was obtained by
using rapid amplification of cDNA ends(RACE).The GpPOD gene was cloned by using RT-PCR method and

第 4 期 毛尖紫萼藓 GpPOD 基因克隆及其表达载体的构建 ·9·
connected it with pMD-18T simple Vetcor to construct cloning vector pMD18T-GpPOD. It was inserted into
expression vector PRI101-AN for constructing expression vector PRI101-GpPOD, and recombinant plasmid was
carried into Agrobacterium tumefaciens EHA105. The DNA sequencing result of recombinant plasmid
pMD18T-GpPOD、PRI101-GpPOD had 99% similarity with the original sequence, which indicated that GpPOD
gene was connected to clone vector pMDl8-T successfully and had been cloned into expression vector PRI101-AN;
There were bands appeared at about 581 bp in electrophoregram of PCR of Agrobacterium transformer，indicating
that PRI101-GpPOD had been introduced into Agrobacterium tumefaciens.The experimental provided an essential
basis for genetic transformation of Grimmia pilifera GpPOD gene.
Key words：Grimmia pilifera；GpPOD；clone vector；expression vector；Agrobacterium tumefaciens EHA105
（上接第4页）
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Cloning, expression vector construction of GpPER1 gene from Grimmia pilifera
and its sequence analysis
AN Hong-xue，SHA Wei，ZHANG Mei-juan，LIU Bo，SONG Lu
（College of Life Sciences and Agriculture and Forestry，Qiqihar University，Heilongjiang Qiqihar 161006，China）

Abstract：A drought-restance relative gene was cloned from a drought cDNA library of Grimmia pilifera，namely
1-Cys peroxiredoxins gene or GpPER1，GenBank login number is GU989314，The full cDNA length of GpPER1 is
1040 bp，The ORF is 666 bp，encoding 221 amino acid. PCR primer were designed according to the ORF of
GpPER1，using RT-PCR method，we amplified GpPER1 gene sequence and construct the expression plasmid pRI
101-GpPER1，for further exploring drought resistant mechanisms of Grimmia pilifera in molecular level，and laid a
foundation for finding and exploitation of resistant genes from stress-tolerant plant.
Key words：Grimmia pilifera；1-Cys peroxiredoxins (PER1) gene；peroxiredoxin；plant expression plasmid