全 文 ：作者简介:夏珣(1982-),女 ,重庆南川人 ,在读研究生。 ＊通迅作者 收稿日期:2009-03-02
Metalothionein克隆载体及表达载体的构建及
转化矮牵牛的初步研究
夏 珣 闫明旭 李名扬 眭顺照＊
(西南大学园艺园林学院 ,重庆市花卉工程技术研究中心 ,重庆 400715)
摘 要:Metalothionein基因位于文库克隆载体 pTriplEx2上 , 活化菌液并用限制性内切酶 SfiI酶切 , 同时酶切添加了
SfiI酶切位点的环状 pMD-18TM, 回收目的片段和载体并连接 ,经过酶切和 PCR验证 , 成功构建克隆载体;再用 XbaI
和 SmaI分别双酶切克隆载体和表达载体 pc2301,回收目的片段和表达载体并连接 , 经酶切和 PCR验证 , 成功构建含
有目的基因的表达载体 , 进而转化植物获得耐重金属的植物株系。初步验证转化后的植株具有抗击重金属的能力。
关键词:Metalothionein;克隆载体;表达载体;构建;转化;矮牵牛
中图分类号 Q814 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2009)07-85-02
金属硫蛋白(metalothionein, 简称 MT)是一类富含
半胱氨酸的低分子量蛋白质 , 广泛存在于动物 、植物和微
生物中。一般认为 MT能够通过配位键结合金属离子 , 从
而在生物体的金属代谢和重金属解毒等方面发挥重要作
用 。从本实验室构建的腊梅花 cDNA文库中 ,利用 EST技
术从腊梅中克隆了金属硫蛋白基因 ,通过生物信息学手
段 ,对基因序列进行了分析和功能预测。为了进一步验证
其可能的功能 ,构建了植物表达载体 ,通过对模式植物矮
牵牛的转化获得了一批转基因植株 ,并对转基因植株进行
了初步分析。
1 材料与方法
1.1 材料 以磬口蜡梅花的各个时期(蕾期 、露瓣期 、初
开期 、盛花期)为材料构建的混合 cDNA文库 ,由本实验室
保存。遗传转化受体材料:矮牵牛 A01、大肠杆菌 XL1 -
Blue、根瘤土壤杆菌 LBA4404、添加了酶切位点的环状
pMD-18TM及表达载体 pc2301,由本实验室保存。限制
性内切酶 SfiI、 SmaI、XbaI和 DNA连接酶均购自 TaKaRa
和 Fermentas生物制品公司。 PCR引物合成由上海英骏生
物技术有限公司合成。其他试剂均为分析纯或化学纯 。
1.2 方法
1.2.1 植物表达载体的构建 Metalothionein基因位于
文库克隆载体 pTriplEx2上 ,活化菌液并用限制性内切酶
SfiI酶切 ,同时酶切添加了 SfiI酶切位点的环状 pMD-
18TM,回收目的片段和载体并连接 ,经过酶切和 PCR验
证 ,成功构建克隆载体;再用 XbaI和 SmaI分别双酶切克
隆载体和表达载体 pc2301,回收目的片段和表达载体并连
接 ,成功构建含有目的基因的表达载体 。
1.2.2 冻融法转化农杆菌 将构建好的表达载体用常规
的冻融法转入农杆菌 ,鉴定含有目的基因的农杆菌用于转
化 。
1.2.3 叶盘法转化矮牵牛 挑取携带有 pc2301-Metal-
lothionein的 LBA4404单克隆摇菌 ,并与无菌培养切成小
片的矮牵牛叶片共培养 2 d,取共培养后的小叶片铺于筛
选培养基光照培养。 3-4周后 ,叶片边缘有小芽长出 ,将
其移人新的筛选培养基继代培养。待抗性不定芽长到 l
cm以上时 ,切下并插人生根培养基上进行培养。
2 步骤与结果
2.1 表达载体 pc2301-Metalothionein的构建 将每一
步的连接物转化大肠杆菌感受态细胞 ,从筛选的阳性克隆
小量抽提质粒 ,酶切鉴定均与插人的 DNA片段大小相等 。
以这些质粒为模板 ,用 Metalothionein基因的特异引物进
行 PCR扩增 ,根据目的基因的两端设计引物如下 P1 5-
GCAGCACCACCGAAACACTCATC-3 P2 5 -ACACTA-
CAAGCCAGCCAGCCAAC-3均扩出了大小相符的特异
条带。将构建好的 Metalothionein基因的植物表达质粒命
名为 pc2301-Metalothionein,用于随后的转化试验。
2.2 农杆菌中重组质粒的鉴定 挑取冻融法转化平板上
的单菌落 ,抽提质粒后分别进行酶切(图 1)和 PCR鉴定 ,
证明 Metalothionein已经成功的转人了农杆菌。
图 1
2.3 抗性苗的获得与鉴定 将与农杆菌共培养后的矮牵
牛叶片转入分化培养基上进行筛选 ,最后获得 23株抗性
植株 ,分别取其叶片并提取叶片的 DNA及对照组(未经任
何处理的矮牵牛植株)叶片的 DNA,进行 PCR和 GUS染
色鉴定 。
2.3.1 PCR鉴定 以获得的抗性植株的总 DNA作为模
板 ,利用 Metalothionein的特异引物进行 PCR的检测 ,结
85安徽农学通报 , AnhuiAgri.Sci.Bul.2009, 15(7)
DOI :10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2009.07.009
果有两株植物的扩增结果为阳性 ,对照组未出现任何扩增
带(图 2)。
图 2 转基因矮牵牛 PCR检测
1D2000maker 2-3质粒(阳性对照)
4-5转基因矮牵牛 6无菌双蒸水(阴性对照)
7未转化矮牵牛(阴性对照)
2.3.2 GUS染色鉴定 取 PCR鉴定呈阳性的植株的叶
片进行 GUS染色并用乙醇脱色 ,可以看到其中几株植物
的叶片呈明显兰色 。至此可以初步证明获得了带有 Met-
alothionein基因的转基因植物 。
2.4 转基因植株的抗重金属分析 对转基因植株的阳性
株和对照株进行了重金属胁迫 ,选用铜作为胁迫的重金
属 ,用 100mmol/L铜溶液分别喷施植株 ,经过 10d后 ,转基
因植株与对照株有明显差异。初步说明蜡 Metalothionein
可能具备抗击重金属的作用。
3 结语
植物生长和产量受到各种非生物胁迫的影响 ,因此 ,
本研究为了提高植物的抗逆能力 ,利用这个基因 ,运用分
子生物学手段 ,克隆和鉴定具有真正抗逆的基因 ,通过基
因工程来克服或减轻重金属对植物的伤害 。利用所构建
的抗重金属基因表达载体转化其他植物 ,如林木 、花卉 、农
作物提供了理论和实践基础 。但今后还需对基因植株的
遗传稳定性进行深入研究 。
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(责编:陶学军)
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(责编:张琪琪)
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