全 文 ：植物病理学报
AC T P AH刃 T OP打川 OL OI G以 S I NI以 3) ( 2 3: 18 7一 18 ( 2) X ( 3)
香石竹斑驳病毒 (Ca r MV)云南分离物
C P基因的克隆和序列分析
孔宝华` , 李文君 “ , 常胜军“ , 蔡 红 ` , 刘进元“ , 陈海如 ` ’
(
’云南农业大学 云南省植物病理重点实验室 , 昆明 65仪刃 l ; 2清华大学生物科学与技术系 , 北京 l仪刃84 )
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文章编号 : 以12 一 09 1 4 (2叨 3 ) m 一 01 87 一01
香石竹斑驳病毒 ( C a lr 城V )是侵染香石竹的主要
病毒 。 关于该病毒的株系和不同地区分离物的病毒
核酸序列研究报道较少 。 我们根据 uG il ey 报道的该
病毒的核酸序列设计引物 ,对香石竹斑驳病毒云南分
离物的 C P基因进行了 RT ` CP R 扩增和序列分析 。
1 材料与方法
1
.
1 R N A 提取
采用 iG bc o BRL 公司的 irT olz 试剂盒 ,提取感病
植物总 RN A 和提纯病毒总 RN A o
1
.
2 引物的设计
根据 iuG l ey 报道的 C aI M y 病毒的 C P 基因序列
设计 CP 基因的 5 `及 3 ’ 端引物 。 引物序列为 : 1P 5 `端
引 物 : 5 ` 一〔 CA叹犯九心叭卫妙叭 GC AG儿心LA G 〕一 3’ , 与
C ar MV RNA 的 2 6 6 8 一 2 6 9 0同源 。 P 2 3 ’ 端互补引物 :
5
` 一〔C T CA C们℃C T A毛甘LA CAA C CA TT〕一 3 , ,与伪朋 V R到A
的 369 2 一 371 6 对应 。
1
.
3 c DN A 的合成及 P C R 扩增
c D NA 合成反应体系组分为 :感病材料总 RN A 或
健康植物总 RN A 各 2 匹 , 20 脚 o U沙 引物 2P 1 沙 , 5
x M MVL 缓冲液 4 汕 , ddH 2 0 7 匹 , 该混合液于 8 ℃
处理 or 而 n 后冰上迅速冷却 ,加人 10 ~ F L 出们T
s l
拼L , 40 U/ 匹 nR as in 0 . 5 沙 , 10 ~ F L I刀T Z 拼L
, 20
U小 L M MvL 逆转录酶 l 汕 ,混合后经 42 ℃处理 l h ,
合成 cD NA 。 取上述的 cD NA 各 0 . 5 腮 , 分别加入 10
、
CP R 缓冲液 5 “ L , 20 }朋O F汕 引物 lP 和引物 咒 各
收稿日期 : 2X() 1一 12 一04 ; 修回日期 : 2X( 犯拐一 27基金项目 : 云南省院省校合作研究项目 ( 98 Y卯伪 )
, 通讯作者
l 拜L , 10 In l o F L 〔IN I乳 l 汕 , 8 8℃ 10 面 n 之内加 Z U /
拼L T a q DNA 聚合酶 l 拜L , 加 d dH Z o 至 5 0 汕 后进行
如下 P CR 循环 : 94 ℃ 3 而 n , 60 ℃ l 而 n , 7 2℃ l 而 n ,
l 次循环 ; 9 4℃ 40 5 , 60 ℃ 1 而 n , 72 ℃ 1 而n , 3 5次循
环 ;最后 72 ℃延伸 10 而 n 。 CP R 产物用 1% 琼脂糖凝
胶电泳检查 ,并回收目的片段 。
1
.
4 P C R 片段的克隆和序列分析
克隆载体 p G E M 一T 一 e asy 与回收的目的片段平端
连接并转化大肠杆菌 MJ 109 , 经选择性培养基筛选 ,
碱法提取质粒 , 电泳和酶切鉴定外源片段的插人情
况 。 挑选含有目的片段的克隆 ,放人含有 10 拼g/ mL
氨卞青霉素的 BL 培养液振荡过夜 , 用碱法提取质粒
并用 PE G 法进行纯化 ,采用 BA B 7 全 自动测序仪进
行序列测定 。
2 结果与分析
2
.
1 R’ T. P C R 扩增
1% 琼脂糖凝胶电泳检查 CP R 扩增产物 ,从感病
材料中可扩增出约为 l 〔以〕 b p 目的片段 ,这与预期片
段的大小一致 ,而健康材料未扩增出相应大小片段 ,
说明这条带是从病毒基因组特异扩增得来的 。
2
.
2 C a d 渡V P C R 产物的克隆和序列分析
cP R 扩增片段与克隆载体 pGE M 一手 e as y 连接并
转化大肠杆菌 MJ l o , 经电泳筛选 、 及口 R l 酶切鉴
定 ,获得了一个含有插入片段的克隆 , 将其命名为
PGMJ lo
。
pG EM
一
-T e asy 载体在外源片段插人位置两
DOI : 10. 13926 /j . cnki . apps . 2003. 02. 019
1 8 8 植物病理学报 33 卷
端均有 及。 Rl 酶切位点 , 酶切后 出现了 1 。以〕 b p 的
外源片段 , 同样 , CP R 产物酶切后也出现了与 1 (X刃
帅接近的片段 。 从而可以推断 cP R 产物已插人质粒
片段中。
对重组质粒 pG JM 109 序列分析表明 , Car MV 云南
分离物 CP 基因全长为 1以 6 nt (包括人工合成引物 ) ,
基 因序列 在 C e n B al 永 中 , 登 录号为 幻 4 8 9 4 7 9。 用
DNA M涛N 软件分析 Car MV 云南分离物 C P 基因序列
与美国 uG il ey ,张爱平 ,及 B u , Y 等报道的 c ax M v c P
基因序列结果表明 , 4 个病毒分离物的 C P 基因序列
核昔 酸 同源 性 高 达 % . 04 % , 氨基 酸 同源 性 达
98
.
8%
。 该 C P 基因与美国 uG il k y ,张爱平及 B u , Y 报
道的 C ar M V 的 CP 基 因序列核昔酸同源性分别为
96
.
4 %
、
97
.
7% 和 95 . 6% 。 氨基酸 同源性 分别 为
9 8
.
0 %
、
97
.
7 % 和 97 . 1% 。 该 C P 基因核昔酸同源性
与张爱平报道的 C ar M V C P 基因同源性最高 , 氨基酸
同源性与美国 G itr n ey 等报道的氨基酸序列同源性最
高 。 该实验结果为研究该病毒的不同株系和深人进
行该病毒云南分离物的 C P 基因的表达和转基因研
究打下基础 。
致谢 : 浙江大 学周雪平教授 , 北京 大学生命科学院
毛 自朝博士 ,本实验室何月秋教授 、 陈舒云同志
在研究工作中给予很多帮助和指导 , 在此表示
衷心感谢 。
枯草芽抱杆菌 B 501 在草苟根际的定殖及其动态变化
王 占武` , 李晓芝 ` , 刘彦利 ` , 田 洪涛 2
(
’河北省农林科学院农业物理生理生化研究所 , 石家庄 05 X() 5 1 ; 2河北农业大学食品科技学院 , 保定 07 10 1)
C o lo 妞吮a it o n an d op Pul a it o n d yn 班in cs of 刀恤c动触5 s ub 功鹿 B 5 0 1 in ht e r恤 o s Ph e re of s t ar 训be r ry
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人c a d曰 l l y of A gh 耐加 王司 adn F’ox 邢 t ics en ces , S h ij iahz u agn 05 05 1 , Ch的 a ; Z ln s t iut et of F仪妇 isc en c e an d ecT hn o肠罗 , H e l〕 e i A幼cul tur al un ive o iyt , B a 以五n g
0’7 l X() l , C hin a )
文章编号 : 以1-2 的 14 (以刃3 )02 一 018 一 02
草幕枯萎病 (而 a ur im 以罗沪o~ f . s p .加召r iae )是 B 501 为本研究室从草葛根部分离获得的一株拮
草毒生产上的重要病害 ,在连茬种植地块尤为严重 , 抗菌 。 制成鼓皮固体培养物 ,用于试验 。
常常造成大幅减产或绝收 。 目前 ,除使用成本较高的 1 . 2 供试品种及地块
剧毒农药澳甲烷熏蒸土壤可 以连茬种植以外 , 尚无其 供试草幕品种采用全明星 ,从当年繁育的草葛幼
它有效方法 。 生物防治是有望控制该病发生的有效 苗中 ,选择生长一致的壮苗供试验 。 在河北省满城县
措施 。 笔者从草墓病株根围获得一株对病原菌具有 2 个渔村的草毒塑料大棚内进行 , 试验用地均为连茬
较强拮抗作用的枯草芽抱杆菌 (及况 il 。 : ub ilt is ) B5 01 , 种植草墓 3 年以上的地块 。
田间防效达到 94 % , 具有较大应用潜力 。 本研究进 1 . 3 幼苗处理 、 样品采集及防效调查
一步对该菌株在连茬种植草葛根部的定殖范围 、群体 将 B 501 固体培养物加适量水稀释 , 制成含菌量
数量的动态变化及其对根际其它微生物菌群的影响 s x 105 。解rnL 的菌悬液 。 小心去掉幼苗根上的土 ,
进行了初步探讨 , 为生防菌剂研制 、 防效监测 以及有 于菌液中沾根处理后按常规方法定苗 。 定苗后及时
效调控措施的选择提供依据 。 浇透水 1次 。 同棚设清水处理和嗅甲烷熏蒸土壤处
! 材料和方法 蠢算票敲着鬃瓷髯罗毓翼默
1
.
1 供试菌株 整株挖出后带土于灭菌袋中保存 ,待测 。 于盛果后期
收稿日期 : 2X() 1一 1 一 1;5 修回日期 : 2 X( 犯拐 一 14基金项目 : 河北省农林科学院基金资助