全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
显性核不育亚麻可育、不育花蕾 mRNA
差异表达研究及差异片段分析
斯钦巴特尔 1, 2 　李强 2 　张辉 2 　哈斯阿古拉 1 　贾霄云 2 　高凤云 2
(1 内蒙古大学生命科学学院 ,呼和浩特 010021; 2 内蒙古农牧业科学院胡麻课题组 ,呼和浩特 010031)
　　摘 　要 : 　利用 mRNA差异显示技术 ,以显性雄性核不育亚麻不育系分离出的可育株和不育株为材料 ,对可育、不育花蕾
中基因差异性表达进行了研究。对回收的差异片段进行反向 Northern杂交验证 ,获得了 7个阳性差异表达基因片段 ,并对它
们进行测序和 BLAST分析 ,最后确定了 3个候选基因片段 G2E072100、G2E072830和 G2E072330。序列分析结果表明 : G2E072
100与蓖麻 (R icinus comm unis)的 GTP2结合蛋白基因部分序列高度 (90% )同源 ; G2E072830与梨 ( Pyrus pyrifolia)的β2木糖苷酶
基因高度同源 ( 80% ) ,并且还包含 1个糖基水解酶家族 C2末端的保守结构域 ; G2E072330与亚麻 (L inum usita tissim um )
LuP12025D10 cDNA高度 (89% )同源。进一步的 Northern杂交结果表明 3个候选基因均在不育花蕾中表达。
关键词 : 　亚麻 　显性雄性核不育 　mRNA差异显示 　Northern杂交 　序列分析
Study on mRNA D ifferentia l Expression in Male Ster ile and
Fertile Flower Buds of Dom inant Genom ic Male Ster ile
Flax and Sequence Analysis of D ifferentia l Fragments
Siqin Bateer1, 2 　L i Q iang2 　Zhang Hui2 　Hasi Agula1 　J ia Xiaoyun2 　Gao Fengyun2
(1 College of L ife Sciences, InnerM ongolia University, Huhhot 010021; 2 Research Group of
F lax, InnerM ongolia Academ y of Agricultural and Husbandry Sciences, Huhhot 010031)
　　Abs trac t: 　mRNA differential disp lay was used to analyze differential exp ression of genes in male sterile and fertile flower buds of
dom inant genom ic male sterile flax line. Seven positive differential fragments were confirmed by Reverse Northern hybridization. Three
differential fragments G2E072100, G2E072830 and G2E072330 were selected as candidate genes through the BLAST search in GenBank.
The further homology analysis indicated that G2E072100 was highly homological ( 90% ) to the partial sequence of R icinus comm unis
GTP2binding p rotein gene; G2E072830 had an identity of 80% with Pyrus pyrifolia Beta2D2xylosidase gene and contained a glycosyl
hydrolase fam ily 3 C term inal domain; G + E07 + 330 had an identity of 89% with cDNA clone LuP12025D10 from L inum usita tissi2
m um. The results of further Northern hybridization confirmed that the 3 genes were specifically exp ressed in male sterile flower buds.
Key wo rds: 　Flax　Dom inant genom ic male sterile　mRNA differential disp lay　Northern hybridization　Sequence analysis
收稿日期 : 2009204230
基金项目 :国家自然科学基金 (30460069) ,国家自然科学基金 (30860148) ,内蒙古自治区自然科学基金 (200508010301)
作者简介 :斯钦巴特尔 (19652) ,男 ,博士生 ,副研究员 ,主要从事亚麻分子生物学研究 ; Tel: 047125902957, E2mail: sqbaater@ yahoo. com. cn　　植物雄性不育是作物杂种优势利用的重要遗传工具 ,具有十分重要的利用价值。植物花粉发育及雄性不育成为植物遗传学和分子生物学研究的一大热点。近年来 ,随着分子生物学理论及各项技术的不断改进和发展 ,花药、花粉相关的特异基因和启动子的克隆、表达和功能等方面的研究为植物雄性不育研究的主要的方向。 显性雄性核不育亚麻是内蒙古农牧业科学院胡麻课题组发现的显性核不育突变体 ,属国内外首次发现的珍贵的遗传材料。它具有花粉败育彻底、不育株标记性状明显、不育性稳定等特点 [ 1 ]。不育株花粉退化的原因是由于绒毡层过早解体 ,即在减数分裂中期 Ⅰ开始解体 ,到了四分体时期 ,绒毡层基本解体 ,小孢子自四分体释放出来后 ,得不到供养而退
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
化败育 [ 2 ]。
mRNA差异显示可以用来研究不同细胞、不同
组织器官或不同环境条件下基因差异表达 ,是一种
灵敏、简便和高通量的生物技术方法 [ 3 ] ,对于显性
雄性核不育亚麻不育花蕾和可育花蕾在同一个发育
时期基因差异表达的研究具有特殊的优越性。
本研究以亚麻显性雄性核不育系分离出的不育
株和可育株为供试材料 ,利用 mRNA 差异显示和
Northern杂交技术 ,筛选不育花蕾、可育花蕾中与雄
性不育相关的差异表达基因片段 ,并进行了序列分
析和生物信息学功能预测 ,为阐明亚麻雄性不育的
分子机理提供理论依据。
1　材料与方法
111　植物材料
以显性雄性核不育亚麻不育系 ( H919)分离出
的遗传背景相似的雄性可育亚麻和雄性不育亚麻为
材料。将杂种 F1亚麻种子播种 ,在开花期 ,根据标
记性状辨别可育株和不育株。可育花呈深蓝色 ,正
常开花 ,有花粉 ;不育花呈浅蓝色 ,形态有两种 :花瓣
展开或不展开 ,花药瘦小光滑无花粉。收集处于减
数分裂中期 Ⅰ (根据花蕾大小 )的单株可育小花蕾
和单株不育小花蕾 ,保证花蕾大小一致 ,液氮中速冻
后于 - 70℃保存。
112　主要试剂
TRNzol Total RNA Reagent、Quant Reverse Tran2
scrip tase、pGM 2T克隆试剂盒、2 ×Taq PCR Marster2
M ix为 TIANGEN 公司产品。D IG H igh Prime DNA
Labeling and Detection Starter Kit为 Roche公司产
品。TotalBLOTTM尼龙膜为 Am resco公司产品。参照
文献 [ 4 ] 设计锚定引 物 : 5′2AAGCT10 G23′, 5′2
AAGCT10 C23′, 5′2AAGCT10 A23′。10碱基的随机引
物共 60种 ( S61～S80、S261～S280和 E01～E20)。
113　总 RNA的提取及 RT2PCR
总 RNA的提取和 cDNA第一链的合成均按照
TRNzol Total RNA Reagent 和 Quant Reverse Tran2
scrip tase说明书进行。
RT2PCR扩增反应体系为 25 μl: 2 ×Taq PCR
MarsterM ix 12. 5μl,锚定引物 (10μM ) 2. 5μl,随
机引物 (10μM ) 2. 5μl, cDNA 1. 5μl,灭菌超纯水 6
μl反应程序如下 : 94℃预变性 1 m in后 , 94℃变性
30 s, 42℃复性 1 m in, 72℃延伸 30 s, 5 个循环。
94℃变性 30 s, 55℃复性 1 m in, 72℃延伸 30 s, 35个
循环。最后 72℃延伸 10 m in。
114　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染及差异片段的
回收及二次扩增
取 10μl RT2PCR产物 , 95℃加热变性 15 m in,
在 6%变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳和银染。将
含有有 /无差异条带的凝胶块切下放入 1. 5 m l的离
心管中 ,用 400μl灭菌水清洗凝胶块一次 ,再加 30
μl灭菌水 ,室温放置 20 m in,煮沸 20 m in, 10 000 r/
m in离心 5 m in,取 5μl上清液作为模板进行第二次
PCR扩增 ,反应条件同上。PCR产物经 1. 5%琼脂
糖凝胶电泳检测 ,扩增产物应与原来片段大小一致。
回收纯化。
115　反向 Northern杂交验证
取 10μl差异片段二次 PCR扩增产物 ,加热变
性后 ,按顺序点于尼龙膜上 ,一式两份 ,每个样品要
重复 5次 ,每次 1μl。室温干燥 30 m in。取可育和
不育花蕾的总 RNA,进行反转录。 cDNA的标记、杂
交和免疫检测均按照 D IG H igh Prime DNA Labeling
and Detection Starter Kit产品说明书进行。以亚麻
A ctin基因 [ 5 ]作为对照。
116　阳性 cDNA差异片段的克隆、测序及序列分析
将经过反向 Northern杂交获得的阳性差异片段
克隆到 pGM 2T载体上 ,然后进行测序。由上海生工
生物工程公司完成测序。NCB I数据库中利用
BLAST查找同源序列 ,进行序列分析和功能预测。
117　Northern杂交表达分析
取 12μg花蕾总 RNA在 1. 3%琼脂糖甲醛变性
凝胶上电泳 ,用毛细法将 RNA 转移到尼龙膜上。
RNA的电泳和转膜主要参照萨姆布鲁克 J主编的
《分子克隆实验指南 》(第 2版 )所述方法进行 [ 6 ]。
对阳性差异片段 cDNA进行标记 ,用作 Northern杂
交探针。以亚麻 Actin基因作为对照。探针的标记、
杂交和免疫检测均同上。
2　结果与分析
211　mRNA差异条带的显示、回收及二次扩增
利用 3种锚定引物与 60种随机引物组成 180
个引物组合 ,对显性雄性核不育亚麻不育花蕾和可
育花蕾 mRNA进行 DDRT2PCR扩增 ,经 6%变性聚
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2009年第 7期 　斯钦巴特尔等 :显性核不育亚麻可育、不育花蕾 mRNA差异表达研究及差异片段分析
丙烯酰胺凝胶电泳 ,挑取有 /无差异带 ,共获得 52
条。其中 36条差异带为不育花蕾中所特有的 ,其余
的 16条为可育花蕾所特有的。这些 cDNA差异片
段大多在 150～1 000 bp之间 (图 1)。将差异片段
回收后 ,作为模板进行 RCR 扩增 ,扩增产物用 1.
5%琼脂糖凝胶电泳检测 (图 2)。
- . 可育泳道 ; +. 不育泳道
图 1　部分 RT2PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
M. 100 bp marker; 1, 2. 二次扩增产物
图 2　部分二次扩增结果
212　反向 Northern杂交验证
将回收的差异表达片段点于尼龙膜上 ,用不育花
蕾和可育花蕾总 RNA作为探针进行杂交 ,杂交信号
的有或无共筛选出 7个阳性差异片段 :其中 5个片段
与不育花蕾 RNA具有杂交信号 : G2E072100、G2E072
330、G2E072830、G2S2732500、A2S2672300; 2个差异片
断与可育花蕾 RNA具有杂交信号 : G2S2742250b、G2
S2742450。其余的差异片段中 ,有些片段与可育、不
育花蕾 RNA均有杂交信号 ;而有些片段没有明显的
杂交信号 (阳性差异片段 cDNA用箭头所示 ,图 3)。
A. 与不育花蕾 cDNA杂交 ; B. 与可育花蕾 cDNA杂交
图 3　反向 Northern斑点杂交结果
213　阳性差异片段的测序
将经过反向 Northern杂交验证的 7个阳性差异
cDNA片段克隆并测序。将序列提交到 GenBank的
公共数据库中进行注册登记 ,获准的登录号分别为
GO042151 ( G2E072100 )、GO042152 ( G2E072330 )、
GO042153 ( G2E072850 )、GO042154 ( G2S2742250 )、
GO065777 (A2S2672300)、GO065778 ( G2S2742450)、
GO065779 ( G2S2732500)。
214　Northern杂交
经过序列和 BLAST分析后 ,确定了 3个候选基
因 ,即 G2E072100、G2E072850和 G2E072330。为了进
一步验证基因的差异表达 ,以 G2E072100、G2E072850
和 G2E072330为探针 ,进行了 Northern杂交分析 ,结
果表明 ,这 3个基因都在不育花蕾中表达 (图 4)。
1. 不育花蕾总 RNA; 2. 可育花蕾总 RNA
A. G2E072100; B. G2E072850; C. G2E072330
图 4　候选基因的 Northern杂交分析结果
215　序列同源性分析
在 GenBank中进行的同源比较结果显示 : G2
E072100与蓖麻的 GTP结合蛋白有较高的同源性 ,
一致性为 90%。还与甜瓜的 ATP /GTP /钙离子结合
蛋白和拟南芥 GTP结合蛋白氨基酸分别有 79%和
78%的相似性。G2E072830与梨的β2D2木糖苷酶的
同源性为 80%。还与桃、茶树和水稻的β2木糖苷酶
氨基酸也有很高的同源性。该片段还含有糖基水解
酶家族 C2末端的保守结构域 (图 5)。G2E072330与
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
LuP12025D10F LuP12亚麻 cDNA clone LuP12025D 10有 89%的同源性 (表 1)。
表 1　3个候选基因片段的 BLAST序列分析表
片段序号 片段大小( bp) 基因库登录号 同源基因
同源基因的基
因库登录号 相似性 ( % ) 分数 可信度 有机体
G2E072100 98 GO042151 GTP结合蛋白 gb | EEF49825. 1 | 90 68. 2 2e210 蓖麻
G2E072830 812 GO042153 β2D2木糖苷酶 dbj |BAF79669. 1 | 80 439 1e2121 梨
G2E072330 232 GO042152 cDNA克隆 gb | EB711216. 1 | 89 161 1e236 亚麻
图 5　G + E + 830糖基水解酶家族 C2末端的保守结构域
3　讨论
试验所用的显性雄性核不育亚麻不育系分离出
的可育株和不育株的遗传背景非常相似 ,只有可育
和不育的差异。所以在材料方面极大地提高了成功
获得与育性差异相关的基因片段的可能性。采用
RT2PCR时提高退火温度和反向 Northern杂交等方
法减少或排除 DDRT2PCR的假阳性带谱。在此基
础上 ,为了增加实验结果的可靠性 ,采用 Northern印
迹杂交法进行了阳性差异片段的表达分析。
经过反向 Northern杂交和 Northern杂交最后确
定了 3个不育花蕾中特异表达的基因片段。不育差
异片段 G2E072100与 ATP /GTP /钙离子结合蛋白同
源性很高。米志勇等 [ 7 ]利用 mRNA差异显示技术
分离到一个与光敏核不育水稻育性转换相关的一个
基因 ,该基因编码低分子量 GTP结合蛋白。GTP结
合蛋白 ( binding regulatory p roteins, GTP) ,简称 G蛋
白 ,是活细胞内一类具有重要生理调节功能的蛋白
质。此类蛋白由于其生理调节功能有赖于与 GTP
的结合与水解 GTP的活性而得名。它是一种重要
的信号传导分子 ,在植物对光的生理效应、植物细胞
离子跨膜运输、植物对激素的生理效应、植物组织和
器官的形态建成等细胞信号转导过程中有调节作
用 [ 8～12 ]。不育差异片段 G + E07 + 830与β2木糖苷
酶高度同源并却含有 1个糖基水解酶家族 C末端
的保守结构域。β2木糖苷酶、阿拉伯糖 (呋喃 )苷
酶、木聚糖酶协同作用 ,可以将木聚糖彻底分解 ,
木聚糖是半纤维素的主要组成成份 ,广泛分布于
高等植物的细胞壁中。它与其它碳水化合物在花
药和花粉发育过程中起着非常关键性的作用。它
不仅为花药的发育提供营养 ,而且还作为信号物
质影响花药和花粉的发育 [ 13, 14 ] 。差异片段 G +
E07 + 330在核不育亚麻不育株花蕾中特异表达。
与 LuP12025D10F LuP12亚麻 LuP12025D10 cDNA
有 89%的同源性。LuP12亚麻 cDNA 是 Cloutier S
等 (2002)用 Sa l I限制酶接头克隆出的亚麻花蕾 cD2
NA,其蛋白质功能尚不清楚。
参 考 文 献
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8　 RodbellM. Nature, 1980, (284) : 17～22.
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