全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
甘蓝型油菜花粉超低温保存及其花粉活力的研究
刘婷婷 1 代其林 2 奉斌 1 田霞 1 龚元亚1 孙英坤1 王劲 1, 2
( 1西南科技大学植物生物技术研究中心,绵阳 621000; 2绵阳师范学院基因研究中心,绵阳 621000)
摘 要: 研究超低温方法保存油菜花粉过程中的预冻和解冻处理方式对油菜花粉的形态、大小及其活力的影响。结果
表明: 采用 0 ( 12 h)! - 4 ( 12 h)! - 20 ( 12 h) ! - 80 ( 12 h)变温预冻处理和用 - 80 ( 1 h) ! - 20 ( 1 h) ! 4
( 1 h)逐步解冻后对油菜花粉形态大小和活力影响最小。而经过 25 室温解冻法和 42 快速解冻法处理后油菜花粉出现破
裂, 破裂率分别达到 7 6%和 9 1%。同时液氮保存油菜花粉的时间长短对花粉的大小及活力影响不大。
关键词: 预冻处理 超低温保存 解冻 花粉活力 油菜
Studies on the Activity of Pollens inBrassica napus L
Cryopreserved Under U ltra Low Temperature
L iu T ingting
1 DaiQ ilin2 Feng B in1 T ian X ia1 Gong Yuanya1
Sun Y ingkun
1 W ang J in1, 2
(
1
P lant B io technology Research Centre, Southw est University of Science and T echnology, M ianyang 621000;
2
P lant Genom icsR esearch Center,M ianyang N ormal College, M ianyang 621000)
Abstrac:t E ffect o f prefreezing and un freezing treatment on the size and ac tiv ity o f rapes po llens w as studied under ultra lowtem
pera ture cond ition. The results show ed that the low est effect on w ere those by prefreezing treatm ent w ith g radually fallingtemperature
[ 0 ( 12 h)! 4 ( 12 h)! - 20 ( 12 h)! - 80 ( 12 h) ] and un freezing treatm ent w ith gradually increasingtem perature [ - 80
( 1 h) ! - 20 ( 1 h)! 4 ( 1 h) ]. The po llens unfrozen at room tem perature( 25 ) and at 42 w ere partly broken w ith the rates o f 9.
1% and 7. 6% , respective ly. Moreove r, storage tim e in liqu id n itrogen w as no t significant to the size and activ ity of the po llens.
Key words: P refree zing treatment U ltra low temperature cond ition Unfreezing Po llens activ ity B rassica napus L
收稿日期: 20091130
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 30871555) ,四川省青年科技基金项目 ( 07ZQ026002 ),四川省教育厅青年科技基金项目 ( 09SJ011012)
作者简介:刘婷婷,女,硕士研究生,主要从事植物遗传学方面的研究; Em ai:l tingt ingl iu 1985@ yahoo com cn
通讯作者:王劲, Em ai:l w jdsz@ vip s ina com
在作物杂交育种过程中,常因亲本之间花期不
遇,致使结实率很低, 因而必须进行人工授粉和选配
不同开花期的品种进行杂交,这通常需要提早一次
性采集花粉和储藏花粉; 有时由于气候条件和地区
隔离而不能及时进行授粉时,也需要在不丧失花粉
活力的前提下储藏花粉 [ 1]。因此, 保存花粉的生活
力是解决亲本花期不遇和远距离杂交的一个重要手
段。一般低温保存可适当延长花粉寿命, 但生活力
仍会明显下降,而置于超低温条件下则能较长时间
保持花粉的生活力 [ 2]。Know lton( 1992)最早报道了
经 - 180 贮存的金鱼草花粉仍具有生活力,而经液
氮超低温 ( - 196 )保存后的花粉经授粉后能结
实, 因此利用超低温技术是进行种质资源保存的一
条新途径,它可以在不破坏植株体的前提下, 实现植
物种质的长期保存 [ 3]。应用超低温保存花粉,不仅可
以大大延长花粉的存活时间,还可以避免病虫害的引
入,为地区间、国际间的种质交换提供方便 [ 4 ]。因此,
用液氮 ( - 196 )超低温中贮藏花粉被认为是目前最
经济方便,又能长期保持花粉活力的有效方法。迄今
为止,已有很多植物的花粉用液氮贮藏成功的报道,
如玉米、黑麦、大豆、甜菜、马铃薯、木瓜、西瓜、番茄、
红车轴草、苹果、梨、李、桃、柿和水稻等 [ 1, 5- 9]。
在花粉含水量适宜的情况下,预冻和解冻的方
法是影响保持花粉活力成败的关键 [ 7]。近年来, 许
2010年第 3期 刘婷婷等:甘蓝型油菜花粉超低温保存及其花粉活力的研究
多学者探索了超低温保存花粉的多种影响因素,其
中多数侧重于对花粉的含水量 [ 2, 10- 12]和保护性酶
活性方面的研究 [ 13]。目前还很少人研究冷冻和解
冻的方法对植物花粉的形态大小及其生活力的影
响。本试验以甘蓝型油菜花粉为材料, 探讨了不同
预冻处理、不同解冻方法和不同超低温储存时间对
花粉细胞大小及其生活力的影响, 以便找到一种最
佳的超低温保存花粉高活力的预冻和解冻方法。
1 材料和方法
11 供试材料
甘蓝型油菜种子 (B rassica napus L ) ( 84100
18)由四川大学生命科学学院遗传学实验室提供,
该油菜系秦油 2号与 86Y17杂交并多代回交育成
的双低细胞雄性不育恢复系。将甘蓝型油菜种植于
试验大田,至油菜开花时期,采集油菜花粉。
12 油菜花粉的采集
于 2009年 3月油菜开花时节,选择晴天采集即
将开放的花蕾,盛于 15 mL离心管中, 并将离心管
置于放有硅胶的干燥器中干燥脱水处理 18 h[ 14]。
13 对干燥脱水处理的花粉进行预冻处理
将干燥后的花粉, 分别采用 4种不同的降温方
式进行预冻:不经预冻; 0 恒温预冻 ( 12 h); - 20
恒温预冻 ( 12 h)和逐级变温预冻: 0 ( 12 h) ! -
4 ( 12 h) ! - 20 ( 12 h) ! - 80 ( 12 h),然后立
即投入液氮里储存。
14 超低温储存的花粉进行解冻处理
预冻的油菜花粉在液氮中保存 30 d后,取出花
粉解冻。以新鲜的油菜花粉为对照, 将保存花粉分
别采用 4种解冻方式: 42 水浴快速解冻; 25 室温
解冻法; 4 缓慢解冻和逐步解冻法: - 80 ( 1 h)
! - 20 ( 1 h) ! 4 ( 1 h)。
15 超低温储藏时间对花粉的影响
干燥后的花粉采用 0 ( 12 h) ! - 4 ( 12 h)
! - 20 ( 12 h) ! - 80 ( 12 h)变温预冻处理后,
在液氮中分别保存 30、60、90、120 d后用逐步解冻
法进行解冻,同时以新鲜的油菜花粉为对照。
16 花粉细胞大小观察及活力测定
花粉细胞大小的变化用带有测微尺的光学显微
镜 ( 100 ∀ )进行观察。每个处理重复 3张装片, 每
张装片选取 3个视野,每个视野随机测定 15个花粉
细胞的极轴 ( m )、纵轴 ( m )和形状, 并用奥林巴
斯显微镜 ( Omp lus, Japan)拍照。花粉活力的测定是
选用氯化三苯基四氮唑染色法 ( TTC法 ) : 取少许油
菜花粉放在干洁的载玻片上, 加 3滴 05% TTC溶
液, 搅匀后盖上盖玻片, 置 35 恒温箱中, 10 - 15
m in后镜检, 凡被染为红色的花粉活力强, 淡红次
之,无色者为没有活力或不育花粉。在光学显微镜
观 ( 100 ∀ )下观察并统计花粉着色率。
2 结果与分析
21 预冻对油菜花粉超低温保存效果的影响
干燥后的油菜花粉分别经 0 预处理、- 20 预
冻处理、不经预处理和逐级预冻处理, 在 - 196 超低
温保存 30 d后,前 3种预处理的花粉形态和大小变
化比较大,极轴 /纵轴 ( P /E )比值变化差异较为显著
(表 1),而采用逐级变温预处理对花粉的形态和大小
的影响较小, P /E比值不显著; 同时在 4种预处理的
花粉 P /E变异系数变化,变温预处理能较好地保持
花粉细胞大小均一性。用 TTC染色法检测预处理对
花粉活力影响的结果表明 (图 1),变温预冻处理花粉
的活性比例高于其它 3个处理。
表 1 预冻处理对液氮保存花粉大小及形态的影响
预冻处理 形状 极轴 ( P, m ) 赤道轴 ( E, m ) P /E P /E变异系数 (% )
对照 长椭圆 1693 # 058 1357 # 056 125 # 0041a 312
不经预冻 长椭圆 1388 # 102 966 # 130 145 # 0142 c 980
0 ( 12 h)预冻 长椭圆 1315 # 118 922 # 093 143 # 0136 c 947
- 20 ( 12 h)预冻 长椭圆 1494 # 084 1068 # 119 141 # 0138 bc 976
逐级变温预冻 长椭圆 1614 # 060 1207 # 094 134 # 0086 ab 639
注:数字后面的字母不同 ( a, b)表示经 DPS分析在 P < 5%水平差异显著,且花粉在 80 ( 1 h) ! - 20 ( 1 h) ! 4 ( 1 h )下逐步解冻
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CK、∃、%、&和∋ 分别表示对照、不经预冻、0 恒温预
冻 ( 12 h)、- 20 恒温预冻 ( 12 h )和逐级变温预冻
图 1 预冻方式对花粉超低温储藏的生活力影响
22 解冻方式对油菜花粉形态及活性的影响
变温预冻处理的花粉经不同的解冻方式进行解
冻,结果表明, 前 3种解冻方法对超低温保存花粉的
影响较大,花粉的形态大小变化也较大,对花粉大小
的影响极显著,而逐步解冻对花粉的形态大小变化
影响较小,花粉的形态近圆形 (表 2,图 2)。对 P /E
变异系数进行分析也表明,逐步解冻方法比其它 3
种解冻方法能更好地保持细胞的大小均一性, 4 缓
慢解冻效果其次, 45 # 2 快速解冻方法对细胞形态
变化影响最大。TTC染色花粉的结果同样表明, 逐
步解冻法花粉的活力比例率明显高于其它 3种解冻
方式,次活性细胞率与对照差异不明显。同时镜检
中还观察到,花粉在 25 室温和 45 # 2 快速解冻
处理后细胞存在破裂现象 (图 4B, C ) ,细胞破裂率
分别占总数的 76%和 91%。
表 2 解冻方式对液氮保存花粉大小及形态的影响
解冻处理 形状 极轴 ( P, m ) 赤道轴 ( E, m ) P /E P /E变异系数 (% )
对照 长椭圆 1693 # 058 1357 # 056 125 # 0041bc 312
42 水浴快速解 长椭圆 1413 # 173 1114 # 185 124 # 0202 c 1671
25 室温解冻 长椭圆 1433 # 079 1080 # 096 131 # 0129 abc 969
4 缓慢解冻 长椭圆 1509 # 066 1121 # 100 135 # 0100 a 802
逐步解冻 长椭圆 1639 # 056 1234 # 088 134 # 0092 ab 643
注:数字后面的字母不同 ( a, b)表示经 DPS分析在 P < 5%水平差异显著
CK、∃、%、&和 ∋分别表示对照、42 水浴解冻、25
室温解冻、4 缓慢解冻和逐步解冻法
图 2 解冻方式对花粉超低温储藏的生活力影响
23 贮藏时间对油菜花粉活力的影响
花粉采用 0 ( 12 h) ! - 4 ( 12 h ) ! - 20
( 12 h)! - 80 ( 12 h)变温预冻处理后,在液氮中
分别保存 30、60、90和 120 d后,用逐步解冻的方法
进行解冻。检测结果表明, 贮藏时间对贮藏后花粉
的形态大小和活力都无明显差异 (表 3,图 3)。
3 讨论
在冷冻过程中, 低温对细胞造成的伤害是由多
种依存因素引起的, 包括细胞过度脱水、胞内冻结、
机械压力以及细胞膜的破损等 (殷晓辉和舒理慧,
1996)。预冻处理可以增加细胞分裂和分化的同步
性, 使细胞内的水分脱出, 减少胞内自由水的含量,
形成对细胞结构损伤不大的细胞外结冰,这样不仅
避免细胞内结冰对原生质的损害, 同时还可以使花
粉受到抗寒锻炼,激活植物体内的抗寒机制 [ 15]。本
研究比较了 4种不同预冻方式发现, 不经预冻对花
粉细胞大小变化较大, 0 预冻和 - 20 预冻处理对
花粉细胞大小变化次之, 而 0 ( 12 h ) ! - 4
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2010年第 3期 刘婷婷等:甘蓝型油菜花粉超低温保存及其花粉活力的研究
( 12 h) ! - 20 ( 12 h)! - 80 ( 12 h)变温预冻处
理,不仅显著地保持花粉形态大小,同时得到的花粉
活细胞率明显地高于其它 3种处理方法。这表明变
温预冻处理有利于花粉的保护性脱水、避免冰晶的
产生,增加了超低温保存效果。
表 3 贮藏方式对液氮保存花粉大小及形态的影响
贮藏时间 ( d) 形状 极轴 ( P, m ) 赤道轴 ( E, m ) P /E P /E变异系数 (% )
对照 长椭圆 1693 # 058 1357 # 056 125 # 0041 a 312
30 长椭圆 1612 # 056 1210 # 084 133 # 0150 b 641
60 长椭圆 1609 # 041 1199 # 081 134 # 0214 b 642
90 长椭圆 1594 # 052 1188 # 086 134 # 0244 b 643
120 长椭圆 1588 # 055 1183 # 091 134 # 0197 b 643
注:数字后面的字母不同 ( a, b)表示经 DPS分析在 P < 5%水平差异显著
图 3 贮藏时间对花粉超低温储藏的生活力影响
超低温保存材料在化冻时, 再次结冰的危险温
度区大约是 - 5至 - 10 [ 16]。选择合适的化冻方
法是非常重要的,以避免在化冻过程中产生细胞内
的次生结冰,并防止化冻吸水过程中水的渗透冲击对
细胞膜体系的破坏 [ 17 ]。本研究用逐步解冻法,即 -
80 ( 1 h) ! - 20 ( 1 h)! 4 ( 1 h)对花粉的形态
和活力的保持效果最佳, 该处理能使花粉含水量增
加, 使保存过程中损伤的质膜得到缓慢的修复,明显
地保持了花粉的活力。25 室温解冻和 42 快速
解冻出现了花粉细胞破裂现象 (图 4) ,同时花粉活
性也大幅度降低。
石思信等 [ 18]观察了超低温长期保存玉米花粉
后产生的后代染色体正常, 认为经超低温保存的花
粉基本上可以保证其遗传的稳定性。本研究通过对
在液氮贮藏 30、60、90、120 d的花粉研究发现,贮藏
时间对花粉活力及大小的影响不显著。
总之,超低温保存油菜花粉时,经过变温预冻处
理后投入液氮,保存花粉活性效果较好;经变温预冻
处理后液氮保存的花粉用逐步解冻的方法使花粉活
力保持最高,效果最佳。
A.对照; B. 42 快速解冻法; C. B图中破裂细胞 (箭头所示 )的放大图; D. 25 室温解冻法; E. 4 缓慢解冻法; F.逐步解冻法
图 4 解冻方式对甘蓝型油菜花粉形态的影响
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
参 考 文 献
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