全 文 ：第 31卷第 2期
2004年 3月
浙　江　大　学　学　报 (理学版 )
Journal of Zhe jiang University( Science Edit ion)
http: / /www. journals. zju. edu. cn /sci
V ol. 31 No. 2
Ma r. 2004
瓯柑愈伤组织的玻璃化法超低温保存研究
陈　勇 1 ,陈娴婷 1 ,王君晖 2
( 1.温州师范学院 生物与环境科学系 , 浙江温州 325027; 2.浙江大学 生命科学学院 , 浙江 杭州 310028)
收稿日期: 2002-11-15.
基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( No. 39900012) .
作者简介:陈勇 ( 1970— ) ,男 ,硕士 ,主要从事细胞生物学和遗传学的教学和科研工作 .
摘　要: 采用玻璃化法对瓯柑愈伤组织进行超低温保存研究 . 瓯柑愈伤组织在含 5%二甲亚砜 ( DMSO )的 M S培养
基上预培养 5 d, 室温下 60% PV S2预处理 20 min, 然后用 100% PV S2于 0℃处理 40 min,投入液氮 ( LN )保存 , 24
h后在 40℃水浴中迅速化冻 , 再用 1. 2 mol /L蔗糖培养液洗涤 3次 .用氯化三苯四氮唑 ( TTC)法检测 , 其存活率
可达 85. 62% .冻后的愈伤组织转移到 MS + 6-BA 0. 5 mg /L继代培养基上 , 在黑暗中培养生长 , 存活率可达
76. 32% .分析讨论了瓯柑愈伤组织玻璃化法超低温保存中存在的一些问题及意义 , 并对其前景进行了展望 .
关　键　词: 瓯柑 ; 愈伤组织 ; 玻璃化法 ; 超低温保存
中图分类号: Q943. 1　　　　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1008- 9497( 2004) 02- 197- 05
C HEN Yong1 , CHEN Xian-ting1 , W ANG Jun-hui2 ( 1.Department of Biology and Env ironment Science , Wenzhou
Normal College , W enzhou 325027, China; 2. College of life Sciences, Zhejiang University , Hangzhou 310028,
China)
Studies of cryopreservat ion of callus of Citrus suav issima Hort . et Tanaka by vitrification. Journal o f Zhejiang Uni-
ver sity ( Science Edition) , 2004, 31( 2): 197～ 201
Abstract: A pro cedure w as pr esented on c ryopreseva tion of callus o f Citrus suav issima Hort. et Tanaka by v itrifica-
tion. Calli w er e precultured fo r 5 day s in MS medium supplemented with 5% DM SO. Then, they w ere lo aded
with 60% PV S2 fo r 20 min a t room temperatur e and exposed to 100% PV S2 at 0℃ fo r 40 min. Follow ed by
chang ing the solution with fresh PV S2 , th e calli w ere imm ered into LN directly and keep fo r 24 h. Af ter rapid
thawing in a w ater ba th at 40℃ , the calli w er e washed with 1. 2 mol /L sucro se solution th ree times and trans-
fer red onto MS medium supplemented with BA 0. 5 mg /L . The cultur es were kept in dark fo r one w eek prito r to
expo sure to the ligh t. Surv iv al ra te of callus w as 85. 62 % by T TC examination and their r eg enera tion rates
r eached to 76. 32% . Th e significance o f c ryopreserv ation of Citrus ca llus was summarized.
Key words: Citrus suavissima Hort. et Tanaka; ca llus; v itrification; cry opr ese rv a tion
　　自 1973年 Nag和 Street首次成功地用液氮超
低温保存了胡萝卜悬浮细胞后 [1 ] ,迄今进行超低温
保存的植物材料已达两百余种 .两步法和预冻法等
多种超低温保存技术也逐步发展起来 .但这些传统
的超低温保存方法操作繁琐耗时 ,并且需要程序降
温仪等设备 ,所以对这些方法的普遍推广使用还存
在不少困难 [2 ] .近年来 ,发展较快的玻璃化冻存法克
服了这些困难 ,该法具有设备简单、程序简化和冻存
效果好等优点 ,并在保存器官和组织水平的结构完
整性方面有独到之处 [3 ] .尽管已有许多植物材料用
玻璃化法冻存都获得了成功 ,但是关于温州瓯柑的
玻璃化法超低温保存仍未见报道 .
瓯柑 (Citrus suavissima Hort. et Tanaka )属于
芸香科柑桔属的一个栽培变种 ,是浙江温州传统特
产 ,它的栽培历史有二千多年 ,在宋、元、明、清时都
被朝廷列为贡品 .其果实清甜多汁略带苦味 ,含有丰
富的维生素 C、 D和果糖、柠檬酸及钙、磷、铁等营养
物质 ,其落地果和柑皮是宝贵的中药材 ,味甘性寒 ,
能解热生津 ,化痰止咳 ,对麻疹、肝炎、高热和高血压
等症状也具有一定疗效 .然而 ,瓯柑存在严重病毒病
问题 ,这不仅使产量大幅度下降、品质变劣 ,而且随
着繁殖代数增加病毒病累积 ,使作物退化甚至绝灭 .
因此对瓯柑的种质资源进行保存显得非常必要 .
本文以温州瓯柑的愈伤组织为对象 ,采用玻璃
化法进行超低温保存 ,建立超低温保存体系 ,为温州
瓯柑种质资源保存开辟一条新途径 .
1　材料和方法
1. 1　材　料
温州瓯柑 (Citrus suav issima Hort . et Tanaka ,
优质品种瓯林 ) 12月成熟果实 .
1. 2　方　法
1. 2. 1　瓯柑愈伤组织诱导和继代培养
从成熟瓯柑果实中取出种子 ,接种于 1 /2M S培
养基上培养 30 d.待苗长至 2片叶子时 ,切取茎、根、
叶作为外植体 ,接种于诱导培养基 MS + 6-BA
1 mg /L+ N AA 0. 5 mg /L+ 2, 4-D 0. 25 mg /L,
诱导愈伤组织的生成 , 30 d后再转移到继代培养基
MS+ 6-BA 0. 5 mg /L上 .
1. 2. 2　瓯柑愈伤组织的玻璃化法超低温保存
1. 2. 2. 1　预培养
将愈伤组织转至含 5%二甲亚砜 ( DM SO)和
5%蔗糖的 MS+ 6-BA 1 mg /L+ N AA 0. 5 mg /L
+ 2, 4-D 0. 25 mg /L培养基上 ,预培养不同天数
( 0, 1～ 7, 10 d) ,比较不同预培养时间对超低温保存
后愈伤组织存活率的影响 .
1. 2. 2. 2　预处理
称取愈伤组织块 200 mg ,放入冷冻管 ,并加入
60%玻璃化保护剂 2( PV S2 ) ( 30%甘油 , 15%乙二
醇 , 15% DMSO, 0. 4 mo l /L的蔗糖 ) ,在室温下预处
理不同时间 ( 0、 10、 20、 30、 40 min) .
1. 2. 2. 3　脱水处理
加入预冷至 0℃的 100% PV S2于 0℃处理不
同时间 ( 0、 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70 min) .
1. 2. 2. 4　冷　冻
移去原液 ,装入新鲜的 PV S2 ,然后迅速将冷冻
管投入液氮中 .
1. 2. 2. 5　化　冻
材料在液氮中保存 24 h后 ,取出冷冻管进行迅
速化冻 ,比较 4～ 6℃低温、室温、自来水水流 ( 18. 5
± 2)℃冲洗及 30、 40、 50℃水浴化冻的效果 .
1. 2. 2. 6　洗　涤
用含 1. 2 mo l /L蔗糖的 M S+ 6-BA 1 mg /L
+ N AA 0. 5 mg /L+ 2, 4-D 0. 25 mg /L基本培养
液 ,在室温下洗涤 3次 ,每次 10 min.
1. 2. 2. 7　细胞存活率检测
氯化三苯四氮唑 ( T TC)法来检测细胞存活率 ,
采用改良的 Towil l和 Mazur的方法 [4 ] .
细胞存活率= 处理后细胞的 TTC值未处理细胞的 TTC值× 100% .
1. 2. 2. 8　再培养
经化冻洗涤后的愈伤组织立即转移到继代培养
基上 ,分为两组 ,一组置于光照 ( 2 000 lx )下培养 ,另
一组在黑暗中培养 ,温度均为 ( 25± 2)℃ ,在培养过
程中 ,观察愈伤组织 6周后的恢复生长情况 ,统计其
存活率 .
2　结果和分析
2. 1　预培养时间对瓯柑愈伤组织存活率的影响
预培养的目的是提高愈伤组织抗冻力 ,减少或
避免冷冻伤害 [5 ] .常用的预培养的方法有高渗处理、
冷驯化等 .本文采用高渗处理 ,愈伤组织通过在 5%
蔗糖和 5% 二甲亚砜的 MS基本培养基上培养一至
数天 ,以减少愈伤组织细胞的自由水和增加可溶性
糖等保护剂 .从表 1可以看出 ,未经预培养的愈伤组
织 ,细胞活性较低 ,抗冻能力较弱 , T TC还原法测得
的相对存活率只有 30. 25% ,而经过 5% DMSO处
理后 ,愈伤组织的存活率随着预培养时间的延长有
升高的趋势 .至预培养 5 d时 ,瓯柑愈伤组织存活率
达到 83. 10% ,但预培养超过 5 d后 ,愈伤组织有褐
表 1　不同预培养时间对瓯柑愈伤组织
玻璃化冻存后存活率的影响
Table 1　 Effects of differ ent time o f precultur e on the
surv iv al rate o f Citrus suavissima Hort. et Tanaka
callus cr yopr ese rv ed by vitrifica tion
处理号
the number o f
tr ea tment
预培养时间
preculture time /d
存活率
surviv a l /(%± S. E. )
Ⅰ 0 30. 25± 7. 13* *
Ⅱ 1 41. 17± 1. 93* *
Ⅲ 2 45. 38± 5. 78* *
Ⅳ 3 54. 83± 3. 67*
Ⅴ 4 65. 54± 3. 56
Ⅵ 5 83. 10± 8. 73
Ⅶ 6 67. 22± 1. 92
Ⅷ 7 56. 30± 3. 17*
Ⅸ 10 38. 65± 1. 45* *
　注　表中所列的存活率为 TT C法检测结果 ; * 表示与Ⅵ 号处理差异
显著 (p < 0. 05) ; * * 表示与Ⅵ 号处理差异极显著 (p < 0. 01)
　Note　 Th e resul ts in th e table w ere ob tained f rom T TC examina-
tion; * Signifi cant ly di ff er f rom No.Ⅵ ’ su rvival( p < 0. 05) ;
* * Very obvious ly di f fer f rom No.Ⅵ ’ su rvival( p < 0. 01)
198 浙 江 大 学 学 报 (理学版 ) 第 31卷　
化现象发生 ,其存活率下降 , 6 d后则有部分愈伤组
织开始死亡 ,存活率更低 .这是因为 DMSO对材料
生长有毒害作用 ,一定预培养时间内 ,它能使细胞内
自由水减少 ,保护性物质增多 ;预培养时间过长 ,会
造成细胞伤害甚至死亡 .综合两方面的因素 ,对瓯柑
愈伤组织来说 ,预培养时间以 5 d为最佳 .
2. 2　预处理时间对瓯柑愈伤组织存活率的影响
为了进一步降低组织含水量 , 在 PV S脱水处
理前还往往有一个过渡性的预处理阶段 [5 ] .本实验
用 60% PV S2室温下进行预处理 ,比较不同预处理
时间对瓯柑愈伤组织存活率的影响 .从图 1可以看
出 ,用 60% PV S2进行预处理 ,存活率与对照 (预处
理 0 min)相比有较大提高 ,在 20 min的预处理中获
得最大的存活率 , T TC检测存活率达到 83. 10% ;
低于 20 min,由于预处理时间过短 ,而未能完全达
到缓冲的作用 ,材料不易成活 ;超过 20 min,则由于
60% PV S2溶液对材料的毒害而使存活率又有所下
降 .因此 ,最佳的预处理时间是 20 min.
图 1　 60%玻璃化保护剂 2装载不同时间对瓯柑愈伤组
织玻璃化冻存后存活率的影响
Fig. 1　 Effects of diffe rent time of loading with 60%
PV S2 on the surviva l r ate of Citrus suav issima
Hort. et Tanaka callus cr yopreserv ed by v itrifi-
ca tion
2. 3　 PVS2脱水时间对瓯柑愈伤组织存活率的影响
实验发现 ,由于 PV S2的毒害作用较大 ,在室温
下用 PV S2处理 ,材料易伤害致死 ,故在 0℃用
100% PV S2处理 .本实验比较了不同 PV S2脱水处
理时间对瓯柑愈伤组织存活率的影响 .如图 2所示 ,
未经 PV S2脱水处理其成活率为 10. 92% ,随着
PV S2处理时间的逐渐延长 ,其存活率有所提高 ,
PV S2处理 40 min时瓯柑愈伤组织达到 85. 62%的
最高存活率 ,超过 40 min,存活率呈现下降的趋势 .
这是因为处理时间少于 40 min,由于材料脱水不
够 ,在降温过程中不能迅速达到玻璃化状态 ,因而不
易成活 ;处理时间超过 40 min,材料由于受到 PV S2
的毒害作用 ,存活率反而又有所下降 .所以很明显瓯
柑愈伤组织的玻璃化法超低温保存必须有玻璃化保
护剂的参与 , PV S2处理最适宜时间应为 40 min.
图 2　玻璃化冷冻保护剂 2处理不同时间对瓯柑愈伤组
织玻璃化冻存后存活率的影响
Fig . 2　 Effects of differ ent time o f tr ea tment with PV S2
on the surviva l r ate of Citrus suav issima Hort .et
Tanaka callus cry opr eserv ed by vitrification
2. 4　化冻方式对瓯柑愈伤组织存活率的影响
玻璃化冻存的材料在保存终止后 ,要求快速化
冻 ,以防止由于次生结冰对组织细胞造成的伤害 .本
文比较了 4～ 6℃低温、室温、自来水冲洗及 30、 40、
50℃水浴不同化冻方式对瓯柑愈伤组织玻璃化冻
存后存活率的影响 .不同化冻方式造成瓯柑愈伤组
织存活率相差较大 (见表 2) .在 4～ 6℃冰箱内慢速
表 2　不同化冻方式对瓯柑愈伤组织
玻璃化冻存后存活率的影响
Table 2　 Effec ts o f melting m ethod on the surv iv al ra te of
Cit rus suavissima Hor t. e t Tanaka callus
cry opreserv ed by v itrification
处理号
the number o f
tr ea tment
化冻方式
melting method
存活率
surviv a l /(%± S. E. )
Ⅰ 4～ 6℃冰箱内 29. 23± 6. 26* *
Ⅱ 自来水流水冲洗
( 18. 5± 2)℃ 71. 84± 1. 78
Ⅲ 室温 22. 69± 7. 13* *
Ⅳ 30℃水浴 47. 90± 4. 26* *
Ⅴ 40℃水浴 85. 62± 5. 77
Ⅵ 50℃水浴 63. 02± 1. 78*
　注　表中所列的存活率为 T TC法检测结果 ; * 表示与Ⅴ号处理差
异显著 ( p < 0. 05 ) ; * * 表示与Ⅴ 号处理差异极显著 ( p <
0. 01)
　Note　 Th e resul ts in th e table w ere ob tained f rom T TC examina-
tion; * Sig ni fi cant ly di ff er f rom No. Ⅴ ’ survival ( p <
0. 05) ; * * V ery obvious ly dif f er f rom No.Ⅴ ’ survival( p <
0. 01)
199　第 2期 陈　勇 ,等:瓯柑愈伤组织的玻璃化法超低温保存研究
化冻和室温、 30℃水浴化冻的 TTC值较低 ,细胞生
活力较弱 .自来水流水 ( 18. 5± 2)℃冲洗化冻和
40℃水浴化冻的存活率较高 ,化冻后的愈伤组织保
持了较高的生活力 , TTC值相近 ,分别为 71. 84%、
85. 62% .因此 ,自来水流水 ( 18. 5± 2)℃冲洗化冻
和 40℃水浴化冻是瓯柑愈伤组织玻璃化法超低温
保存较好的化冻方式 .这也说明了愈伤组织复温速
度必须较快 ,应迅速化冻 ,且融冰过程中必须充分振
摇冷冻管 ,尽量使管内愈伤组织和保护剂受热均匀 ,
同步融化 ,减轻对细胞的机械损伤 .
2. 5　一个完整的玻璃化冷冻程序
为了检测玻璃化完整程序中的每一步对瓯柑愈
伤组织存活率的影响 ,获得一种最优化和最简单的
玻璃化冷冻程序 ,本实验对瓯柑的愈伤组织进行的
处理见表 3.由表 3可见 ,使用完整程序的Ⅶ 号处理
的存活率达到了 85. 62% , 此时冻前存活率为
98. 67% (Ⅳ号处理 ) .当瓯柑愈伤组织不用 PV S2脱
水处理 ,其存活率只有 10. 92% ,这表明了适当的玻
璃化保护剂处理是玻璃化冻存成功的关键 .预培养、
预处理、 PV S2脱水处理、快速化冻对于减少材料的
损伤是非常有帮助的 ,省去以上的任何一步其存活
率都比使用完整程序的Ⅶ 号处理的存活率低 .
表 3　玻璃化冷冻程序的每一步对瓯柑愈伤组织玻璃化冻存后存活率的影响
Table 3　 Effects of each step o f pro toco l on th e surv iv al ra te o f Citrus suav issima Hort. et Tanaka
ca llus cr yopreserv ed by v itrifica tion
处理号
th e number o f tr eatment
预培养
preculture
预处理
loading
脱水处理
dehydra tion
冷冻-化冻
fr eeze-thawing
洗　涤
unlo ading
存活率
surv iv al /(%± S. E. )
Ⅰ - + + + + 31. 51± 2. 47* *
Ⅱ + - + + + 36. 56± 6. 04* *
Ⅲ + + - + + 10. 92± 0. 72* *
Ⅳ + + + - + 98. 67± 0. 73
Ⅴ + + + + - 59. 24± 9. 61*
Ⅵ + - + + - 22. 69± 4. 26* *
Ⅶ + + + + + 85. 62± 5. 77
　注　表中所列的存活率为 T TC法检测结果 ; + 表示处理 ; - 表示省略 ; * 表示与Ⅶ 号处理差异显著 ( p < 0. 05) ; * * 表示与Ⅶ 号处理差异
极显著 (p < 0. 01)
　Note　 The resul t s in th e table were obtained f rom T TC examination; + means using th e step; - m eans omi t ting th e s tep; * Sig ni ficant ly
dif f er f rom No. Ⅶ ’ survival (p < 0. 05) ; * * V ery obviously dif f er f rom No.Ⅶ survival (p < 0. 01)
2. 6　光照对玻璃化法超低温保存后愈伤组织恢复
生长的影响
　　将化冻洗涤后的愈伤组织转至 MS+ 6-BA
0. 5 mg /L的新鲜培养基上 ,在同样的温度 ( 25±
2)℃下 ,分别进行光照 ( 2 000 lx )和黑暗培养 ,结果
愈伤组织生长出现明显差异: 暗培养的愈伤组织恢
复生长和再生长的速度均较快 ,存活率高达
76. 32% ,而光照培养的愈伤恢复生长的速度慢 ,存
活率仅为 25. 60% .实验结果表明 ,植物细胞组织在
遭受冷冻后回复到正常温度生长时 ,黑暗有利于冻
害的恢复 ,而光照对损伤的修复不利 .实验中 ,恢复
生长后的愈伤组织都能再生植株 .
3　讨　论
3. 1　在玻璃化冻存生物材料后 ,通常采用 TTC法
或 FDA来测定细胞生活力 .但其检测的都只是细
胞内某种酶的活性 .因此真正能正确鉴定植物材料
生活力的较有效测试方法就是保证经玻璃化冻存后
的组织或细胞恢复生长并再生植株 .如本实验中虽
然经 TTC染色检测其存活率达 85. 62% ,但冻存
后愈伤组织经再培养后存活率却比 T TC检测结果
低 ,只有 76. 32% .这可能是 T TC检测只是以脱氢
酶的活力为标准 ,而材料的损伤程度不能仅以此为
标准 ;另一方面 ,也可能是在进行超低温保存后培养
时 ,愈伤组织未达到超低温保存后恢复生长的要求 .
3. 2　过去 ,柑桔类的愈伤组织的超低温保存大多数
采用两步法 ,其存活率不高 ,而且需要程序控温仪 .
而采用玻璃化法对柑桔类进行超低温保存 ,减轻了
两步法等传统技术保存中的机械损伤和溶液效
应 [7 ] ,而且不需要程序控温仪、方法简便、易于操作、
并且存活率较高 .王子成、邓秀新 [8 ]用玻璃化超低温
200 浙 江 大 学 学 报 (理学版 ) 第 31卷　
保存柑桔茎尖 ,其中枳壳茎尖冻存后经 T TC法检
测 ,存活率为 100% ,培养再生达到 90% ,其它品种
的存活率也较高 .本实验用玻璃化法超低温保存温
州瓯柑的愈伤组织 ,经 T TC检测后 ,其存活率可达
85. 62% .因此玻璃化法是超低温保存瓯柑在方法选
择上的一个发展方向 .
3. 3　瓯柑属于芸香科柑桔属的一个栽培变种 ,柑桔
类品种的种子长期保存的效果不好 ,并且会出现种
子败育 ,成年柑桔芽的离体培养又存在着再生难的
问题 ,这就要求找到一种合适离体培养材料来进行
保存 .而愈伤组织是植物细胞在组织培养过程中形
成的无一定结构的组织团块 ,在适宜的条件下 ,愈伤
组织能再分化 ,形成芽、根 ,再生成植株 ,是保存种质
资源的良好选择材料 .因此 ,现在关于柑桔类离体材
料的超低温保存的研究也多数集中在胚性愈伤组织
的保存上 .但是有些研究也表明愈伤组织存在变异 ,
不是种质保存的最理想的材料 ,而通过茎尖培养再
生植株 ,不需要经过愈伤组织阶段 ,可减少发生变异
的几率 ,因此茎尖可作为种质保存的理想材料 [7 ] .所
以关于瓯柑茎尖的超低温保存是今后实验研究和摸
索的一个方向 ,它可为瓯柑资源再生和种质保存开
辟另一条途径 .
3. 4　目前国内有关柑桔的超低温保存研究较多 ,但
关于温州瓯柑的超低温保存的研究甚少 .瓯柑主要
生长在温州一带 ,由于瓯柑病毒病严重 ,所以近年来
瓯柑的市场效益欠佳 ,瓯柑的种质受到了影响 .因此
对瓯柑的超低温保存不但可以用现代生物技术为保
存瓯柑种质做些基础的工作 ,还可以为瓯柑的优质
资源保存提供理论依据 .
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(责任编辑　寿彩丽 )
201　第 2期 陈　勇 ,等:瓯柑愈伤组织的玻璃化法超低温保存研究