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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
冬虫夏草培养子实体 ITS，5. 8S的分析及
系统发育研究
彭慧超1，4 程大志2 王爱珍3 王环1 王海庆1
沈建伟1，4 司庆文1，4 韩发1 周党卫1
(1中国科学院西北高原生物研究所 高原生物进化与适应开放实验室，西宁 810001;
2青海世峰生物科技有限公司，西宁 810003;3青海大学 生命科学系，西宁 810016;
4中国科学院研究生院，北京 100049)
摘 要: 对野生冬虫夏草的人工培养子实体的 ITS1，ITS2 和 5. 8S 间区序列进行了克隆，并结合已有的序列对 ITS1，
ITS2 和 5. 8S进行了系统发育分析。结果表明，人工培养子实体与中华被毛孢(Hirsutella sinensis L95DBM-1)具有 96%的同
源性，在 NJ邻接树上形成明显的一支，与虫草属其它类群种间具有明显差异，表明分离培养的虫草子实体为中华被毛孢。
遗传距离分析结果显示，培养虫草序列与已知虫草在种内也存在一定差异，可能暗示虫草种群在不同区域具有一定的遗传
分化。
关键词: 虫草 ITS-5. 8S 系统发育分析 中华被毛孢
ITS and 5. 8S Analysis and Phylogenetic Relationship of Culture Fruiting
Body of Cordyceps sinensis(Berk．)Sacc．
Peng Huichao1，4 Cheng Dazhi2 Wang Aizhen3 Wang Huan1
Wang Haiqing1 Shen Jianwei1，4 Si Qingwen1，4 Han Fa1 Zhou Dangwei1
(1Key Lab of Adaptation and Evolution of Plateau Biota，Northwest Plateau Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810001;
2Qinghai Shifeng Life Sci＆Tec Company，Xining 810003;3School Life Sciece，Qinghai University，Xining 810016;
4Graduate School of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049)
Abstract: The ITS-5. 8S sequences were cloned on the culture fruiting body of Cordyceps sinensis． Based on some known ITS-
5. 8S sequences in Cordyceps genus，the molecular phylogenetics relationship was performed． The results showed that the ITS-5. 8S se-
quence of the culture asexual fruiting body had 96% identity to that of Hirsutella sinensis(L95DBM-1)and clustered on the obvious lin-
eage． The sequence of culture asexual was different from that of the other species of Cordyceps genus in ITS-5. 8S Neighbor-Join phylo-
genetics tree． This showed that the culture asexual fruiting body was the Hirsutella sinensis． Divergence distance analysis showed that
the ITS-5. 8S sequence of the culture asexual fruiting body also had great difference in inter-species of C． sinensis，which may suggest
that C． sinensis population have certain genetic divergence in different region．
Key words: Cordyceps sinensis ITS-5. 8S Phylogentic analysis Hirsutella sinensis
收稿日期:2010-01-23
基金项目:中科院知识创新项目(KSCX2-SW-106) ，青海省科技厅星火计划项目，中科院西北高原生物研究所知识创新前沿项目
作者简介:彭慧超，女，硕士研究生，主要从事分子生物学方面的研究
通讯作者:周党卫，E-mail:dangweizhou@ sina． com
虫草(Cordyceps sinensis(Berk．)Sacc．) ，又名冬
虫夏草、冬虫草、夏草冬虫。属真菌界(Fungi)真菌
门(Eumycophyta)子囊菌亚门(Ascomycotina)核菌
纲(Pyrenomycetes)麦角菌目(Clavicitales)麦角菌科
(Chavicipitaceae)虫草属(Cordyceps(Er．)Link．) ，藏
语称为“雅杂滚卜”，是分布在我国青藏高原地区的
2010 年第 7 期 彭慧超等:冬虫夏草培养子实体 ITS，5. 8S的分析及系统发育研究
珍贵中藏药材。传统中医认为虫草具有补肾、镇
静、平喘、祛痰、提神、强心、壮血等功效。同样，
《藏医千万舍利》中就载有冬虫夏草并称其具有
“祛风、利胆、益精”之功效，其以明显的医疗保健
效果，驰誉国内外，特别在东南亚地区影响
广泛［1，2］。
由于冬虫夏草资源稀少，且过度采挖又会严重
破坏生态环境，而人工栽培冬虫夏草难度很大，因
此，人们企图从冬虫夏草分离出菌种，即无性型菌
株，开发冬虫夏草的替代品来满足市场的需求。
1983 年，沈南英等首次分离获得冬虫夏草的无性
型。至今，我国已经先后报道分离自虫草或相关真
菌属已经多达 10 个属和 11 个种，并对其中的一些
菌进行了发酵培养或人工培养，取得了一定的经济
和社会效益［3］。但由于虫草属系统的复杂性和分
离、培养的困难性，冬虫夏草开发中的无性型的确
定，一直为人们所争论［4］，无性型的分离与鉴定虫
草作为一类可再生的生物资源来研究和利用的关
键［3］。传统的微循环产孢判定等方法操作困难，随
着分子技术的发展，用核酸序列分析在菌种鉴定和
分型中得到了广泛的应用［5 － 8］。本研究对采集于青
海果洛地区的虫草子实体培养物的 ITS1，ITS2 和
5. 8S的基因序列进行了克隆测定，结合 GenBank 中
已有的虫草属序列，对其序列特征和系统发育关系
进行分析。
1 材料与方法
1. 1 冬虫夏草
青海世峰生物技术公司(简称世峰公司)2007
年采自青海果洛，寄主昆虫为虫草蝙蝠蛾(Hepialus
armoricanus Oberthur)。
1. 2 培养基
用 PPDA培养基(PDA + 1% 蛋白胨)分离菌
种，世峰公司自制培养基进行传代培养。
1. 3 DNA提取、纯化及 PCR扩增
从世峰公司传代培养 3 次后的培养子实体培养
瓶中取样品，液氮研磨后，采用真菌 DNA 提取试剂
盒(Omega Co．)进行 DNA 提取与纯化。采用通用
引 物 对 ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，
ITS5:5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 进 行
ITS1-5. 8S rDNA-ITS2 区域的扩增(简称为 ITS-
5. 8S)。50 μL PCR 扩增反应体系为:模板 DNA 2
ng、10 × PCR buffer(含 Mg2 +)5 μL、Taq DNA聚合酶
5 U /μL(TaKaRa)0. 25 μL、dNTP(2. 5 mmol /L)4
μL、引物各 2 μL，补充无菌去离子水至 50 μL。
94℃预变性 5 min 后，反应程序为 94℃变性 40 s、
52℃退火 40 s、72℃延伸 1 min，共 34 个循环，于
72℃最终延伸 5 min。
1. 4 PCR产物克隆和测序
PCR 产物用 1% 凝胶电泳进行检测后，采用
DNA片段纯化试剂盒(TaKaRa) ，进行割胶纯化，纯
化产物用 pMD18 载体连接试剂盒(TaKaRa)连接，
热激转入 DH5α 中，PCR 鉴定后，送交上海生工生
物工程技术服务有限公司测序。
1. 5 系统发育分析
PCR产物提交至 GenBank 数据库中，序列同源
比较采用 DNAman 软件进行(http:/ /www． lynon．
com /home-new． html)。利用 blastn 搜索已有的虫草
ITS和 5. 8S序列(表 1) ，用 Clustal X 软件包将所选
中的序列初排［9］，用 BioEdit 软件(http:/ /www．
mbio． ncsu． edu /BioEdit /bioedit． html)进行手工校
对。利用 MEGA 4. 2 (http:/ /www． megasoftware．
net)软件包构建邻接系统树［10］，Bootstraping 法进行
检验，重复 2 000 次。用结对距离(Pairwise distant)
分析法建立遗传距离阵［11］。
表 1 所选虫草的序列号及 ITS-5. 8S序列长度
虫草 序列号 ITS-5. 8S长度(bp)
phiocordyceps sinensis
(ZWM002)
AJ507400. 1 488
Ophiocordyceps sinensis
(ZWM002)
AJ507401. 1 488
Ophiocordyceps sinensis
(ZWM001)
AJ507399. 1 488
Ophiocordyceps sinensis
(ZWM004)
AJ507402. 1 488
Ophiocordyceps sinensis
(HMAS 55469)
AJ243980. 1 491
Cordyceps sinensis
(WNS03)
AJ413183. 1 491
921
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
续表
虫草 序列号
ITS-5. 8S
长度(bp)
Cordyceps sinensis
(LCY9903)
AJ413182. 1 491
Cordyceps sinensis
(WNS03)
AJ243775. 1 491
Cordyceps sinensis
(LiT9704)
AJ245559. 1 491
Cordyceps sinensis
(CYQ011)
AJ507403. 1 492
Cordyceps sinensis
(ascospore)
AJ243776. 1 491
Cordyceps sinensis
(ZHY021)
AJ507405. 1 492
Cordyceps sinensis
(L95DBM-1)
AJ309355 494
Cordyceps sinensis
(Nyaramu-1)
AB067739 491
Ophiocordyceps cochlidiicola AB027377. 1 472
Verticillium balanoides
(CBS 522. 80)
AJ292413. 1 516
Stachybotrys dichroa AF081472. 2 492
Cordyceps military
(IFO 30377)
AB070375. 1 478
Beauveria caledonica Z54104. 1 525
Cephalosporium maydis
(isolate 222)
AJ010026. 1 487
Paecilomyces sinensis AJ243771. 1 459
Pochonia bulbillosa AF048741. 1 514
2 结果与分析
2. 1 ITS序列分析
利用双脱氧法获得了冬虫夏草培养物 CS5-1 和
CS5-2 的 ITS1，5. 8S rDNA 和 ITS2 基因的序列。序
列分析发现，ITS1-5. 8S rDNA-ITS2 结构排列并未发
生改变，其中 ITS1 为 147 bp，5. 8S rDNA为 177 bp，
ITS2 为 170 bp，其中 C5-1 与 C5-2 的序列完全相同，
其序列长度为 604 bp，G + C 含量为 49. 5%。利用
DNAman软件包将 C5-1，C5-2 序列与虫草(C． sinen-
sis 序列号:AB067739)和中华被毛孢(H． Sinensis
序列号:AJ309355)序列对排结果如图 1 所示，C5-
1 和 C5-2 分别与戴氏虫草和中国被毛孢的相似度
达 97%和 96%。说明在分子水平上，虫草培养子
实体与野生虫草中分离的中华被毛孢和虫草株极
为相似，在分子水平具有一致性。
2. 2 系统发育分析
为对虫草培养物的基因系统发育位置进行进一
步确认，从 GenBank 中选取了 23 种虫草属的 ITS，
5. 8S的基因序列，Clustal X 软件进行初步排列后，
用 BioEdit软件进行了手工校对。用 NJ法构建了基
因 ITS和 5. 8S的 NJ 系统关系树，并用鞋带法进行
2000 检验。系统发育分析结果(图 2)显示，CS-1 和
CS-5 与中华被毛孢序列 AJ309355 和虫草序列
AB067739 的序列在系统树上聚为一支，支持率为
100%，但 CS-1 与 AJ309355 序列并未呈现出平行关
系，而具有一定差异。同样，CS-1 所在支系与已知
AJ507400 的虫草序列所在支系处于明显不同的两
个不同的谱系支上。
2. 3 虫草相关类群 ITS-5. 8S区的距离矩阵
已有研究表明，虫草 ITS序列极为相似，有些序
列甚至完全相同［7，8］。因此，选取虫草属已知的
ITS-5. 8S序列，并对其遗传变异的差异进行了分析。
结果(表 2)表明，CS-1 与冬虫夏草中(AJ243979. 1
和 AJ507405. 1)ITS-5. 8S序列的差异分别为 0． 098
和 0. 087，而与中华被毛孢序列(AJ309355)和
AB070375. 1 的差异分别为 0. 011 和 0. 011，均远
远小于 2%，该结果也与图 2 系统聚类的结果一
致。而果洛虫草培养无性型中的序列 CS-1 与其真
菌序列的差异则均大于 13%，有的甚至达到
31. 5%。其中与刺娥虫草(Cordyceps cochlidiicola)
ITS-5. 8S 序列差异为 13. 9%，与中国拟青霉
(Paecilomyces sinensis)ITS-5. 8S 序列差异的差异
为 28. 9%。
031
2010 年第 7 期 彭慧超等:冬虫夏草培养子实体 ITS，5. 8S的分析及系统发育研究
图 1 CS-1、CS-2、虫草和中华被毛孢核酸序列的对排
131
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
图 2 基于 5. 8S rDNA、ITS1 和 ITS2 的邻接系统树(2 000 次鞋带检验)
表 2 虫草相关类群的变异矩阵
ChengCS-1
AJ243979. 1 0. 098
AJ507405. 1 0. 087 0. 010
AB027377. 1 0. 142 0. 073 0. 068
AJ292413. 1 0. 139 0. 078 0. 071 0. 069
AJ010026. 1 0. 263 0. 211 0. 205 0. 198 0. 190
AF081472. 2 0. 200 0. 146 0. 134 0. 140 0. 107 0. 189
AB070375. 1 0. 265 0. 203 0. 189 0. 186 0. 156 0. 231 0. 163
AJ309355 0. 011 0. 096 0. 085 0. 140 0. 138 0. 261 0. 198 0. 263
AB067739 0. 011 0. 096 0. 085 0. 140 0. 138 0. 261 0. 198 0. 263 0. 000
Z54104. 1 0. 231 0. 181 0. 168 0. 166 0. 153 0. 235 0. 141 0. 122 0. 229 0. 229
AF048741. 1 0. 315 0. 247 0. 245 0. 256 0. 257 0. 268 0. 273 0. 289 0. 317 0. 317 0. 306
AJ243771. 1 0. 289 0. 227 0. 222 0. 234 0. 229 0. 266 0. 246 0. 266 0. 292 0. 292 0. 285 0. 069
231
2010 年第 7 期 彭慧超等:冬虫夏草培养子实体 ITS，5. 8S的分析及系统发育研究
3 讨论
自 20 世纪 80 年代，沈南英等从冬虫草中分离
获得了中华束丝孢(Cephalosporrium sp. ) ，先后有多
种霉类真菌获得分离［12 － 18］。但关于虫草无性型的
确认一直争议颇多［4］。梁宗琦等［3］通过形态学分
析后认为，冬虫夏草的真正无性型为中华被毛孢
(H． sinesis) ，这一研究结果为 RAPD分析佐证［19，20］。
然而虫草属是一个复杂的类群，系统学上还存在一
些问题没有澄清，加之虫草在人工培养基上不易生
长，或生长极为缓慢［4］。因此，目前国内对冬虫夏
草培养子实体还缺乏研究与确认。本研究对培养冬
虫夏草子实体的序列 CS-1 和 CS-2(GU233806)分析
发现，其在序列上与已知梁宗琦分离的中华被毛孢
(H． sinesis AJ309355. 1)和日本学者 Kinjo分离的虫草
(C． sinesis AB067739)ITS-5. 8S的序列极为相似，相似
性达 96% － 97%(图 1) ，进一步分子系统学分析发
现，CS-1 和 CS-2 的序列(GU233806)与 AJ309355. 1
和 AB067739 形成一个系统支，并且具有 100%的支
持率，该分支与虫草 AJ243979. 1 和 AJ507405. 1 类
群形成明显的两个支系，并且具有 99%的支持率，
而且遗传距离分析也表明，CS-1 与 CS-2 所在支系
与虫草 AJ243979. 1 所在的支系，变异性分别只有
0. 098 和 0. 011，远远小于 2%。而与其它真菌属如
中华拟青霉(AJ243771)、白僵菌属(Z54104)的序列
等差异较大(表 2) ，并且位于不同的系统支上。这
与前人对虫草的研究结果一致［5，6，8，19］。因此，这些
分子试验证据表明，CS-1 与 CS-2 为中华被毛孢的
一种无性型。
张运武等［21］对云南滇西北地区冬虫夏草和阔
孢虫草的遗传分化进行了研究，结果发现，不同地区
虫草序列存在较大的遗传变异。Chen 等［22］对青藏
高原不同地区产野生虫草的分子研究结果表明，不
同地区虫草遗传多样性存在很大差异。而赵泽孝
等［8］对虫草的研究结果表明，不同地区虫草 ITS 基
因序列差异很小，而种间差异较大。本研究结果表
明，CS-1 与 CS-2 的 ITS-5. 8S 序列与其它真菌序列
不但在种间存在很大差异(表 2) ，而且，尽管与
AJ243979. 1 的虫草支系具有 90%的相似性，但在
ITS-5. 8S 邻接系统树上形成明显的两个支系，并且
两个分支的长度存在差异(图 2)。由于 CS-1 和 CS-
2 虫草无性型培养的母株来自青海果洛地区，该地
区地处青藏高原腹地，气候极为恶劣，平均海拔在
4 000 m以上，气候寒冷，降水较多。这些环境因素
可能造成该地区冬虫夏草在地区之间由于基因流传
播的阻隔，而产生较大的遗传变异［22］。这种差异分
化的原因尚待进一步深入研究。
参 考 文 献
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(下转第 141 页)
331
2010 年第 7 期 刘天亮等:橄榄 ISSR-PCR反应体系的优化
3 讨论
目前 ISSR标记技术已应用于玉米、小麦、马铃
薯、柑橘、羽扇豆、水稻和葡萄等种质资源的鉴
定［14］。聂珍素［15］对橄榄进行 RAPD 了鉴定，但是
还没有相关的 ISSR标记研究报道，有必要加快确立
ISSR反应体系，为利用 ISSR 分子标记技术，合理开
发、利用橄榄种质资源提供理论参考。
ISSR扩增步骤与 RAPD 技术相似，但不同引
物，不同材料的扩增条件有差异。所以，对一种新植
物材料进行 ISSR标记分析前，要先建立相应的优化
体系，特别是对扩增效果影响较大的因素的优化，以
获得清晰、可重复、易统计的条带。采用单因素试验
进行优化，可以设置较多的水平梯度，以得到比较精
确的单因素最优水平。同时，进行正交试验设计，可
以排除各因素之间互作对最终体系的影响。
4 小结
本试验通过单因素和正交试验对 ISSR-PCR 扩
增橄榄基因组 DNA 的主要影响因子进行筛选和分
析，优化了适宜于橄榄 ISSR-PCR 分析的扩增体系:
20 μL的反应体系中含 40 ng 的模板 DNA、1 U Taq
DNA 聚合酶、0. 25 μmol /L引物、0. 2 mmol /L dNTPs
以及引物 BDB(CA)7 的最佳退火温度为 51. 6℃ －
53℃。试验结果为今后利用 ISSR-PCR 技术对橄榄
种质资源的研究与利用提供了可靠的依据。
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