全 文 ：安 徽 大 学 学 报 报 ( 自 然 科 学 版 )
一九八七年 第三期
真 菌 多糖 的 研 究
1
、 亚香棒虫草水溶性多糖的分离和部分性质
陈安平 吴东儒
( 生化徽生物研究所 )
摘要 木文报道安徽产亚香棒虫草 Cr od y e eP sh a w e s i i Gr a y )水溶性多
据 分离、 纯化及单糖组成和部分性质 。 D E A E一纤维素分级洗脱和 S eph r a os e
6B 柱层析 、得到两个级份精糖h C一 1和h C一2 、 凝胶过滤和醋酸纤维薄膜 电泳刚
定 , 证明有良好的均一性 。 纸层析和硅胶薄板层析 ,表明他们均由甘露糖和半乳
糖组成 。 红外尤语分析和高块酸乳化反应表明 , 这两种精格可能是 以 ( l , 4 )
健为主健 , 含有 (1 “ 3) 和 (1 , 2) 健 , 带有 (1 , 6) 健分枝 的日一半乳甘落 聚糖 。
前 .去 .巨
冬虫夏草是我国名贵的传统药材 。 日本东京药学院 T . M iy az a ik 和 歧 阜 药 学 院
S
.
U K a i分别在 10 7 7年和 1 9 5 2年对冬虫夏草 C o r o l y e e p s s r n e n s i S、和蝉生虫草、 C o r d -
y e p s e i e a d a
e ) 的多糖结构作过报道 〔 ’ , 忿〕 、 1 9 5 4年 , 日本N o b o r o K a w a g u e h i又对大
团杀虫草 ( C o r d y e e p s o p h i o g l o s s o ib e s ) 的细胞壁多糖结构进行深入的研究 〔 , 〕 。
安徽产亚香棒虫草 ( C o r d h e e p s h a w e k e s i i )近年安徽大别山区有大量发现 〔 ` 〕由于
传统的冬虫夏草产量低 , 出口量大 , 价格昂贵 , 市场紧缺 , 有些地方 巳将亚香棒虫草用
于临床 。 国内有人研究过亚香棒虫草的化学成份 〔 . , . 〕 , 但至今为止 , 尚未见到国 内 外
有亚香棒虫草多糖的研究报道 。 本文对安徽产亚香棒虫草水溶性多糖的分离 、 纯 化 、
单糖组成和部分性质作一研究初报 。
材料、 仪器和试剂
亚香棒虫草在安徽六安地区药材公司购得。
自动旋光仪 : W 2 2一 l 型上海物理光学仪器厂产 。 红外光谱分析仪 : I R一 4 5 0 5 日
本岛津产
本文 1 9 5 6年9月 1 7 日收到 。
本文参加全国第二次枯的生化学术讨论会 , 并在大* 宜谈 ( 1 0 8 6 ,
紫外 /可见分光光度计: 5 3一 W上海分析仪器厂产
标准糖 : 甘露糖 :
半乳糖 :
F l u k a进 仁 1分装
上海试剂二厂
产
硅胶薄板 ( 5x 1 5c m成品 ): 浙江黄岩人民化工厂
S eph r a o s e6B:h Pr a m a e i a公司产品
S eph ar o s e4 B:h Pr a m a e i a公司产 P a
D E A E一纤维素 ( D E一 2 3 ): S er v a进 口分装
Pr on a s e: E
、
0 0 70 0 P U K / g进 口产品
其它化学试剂均为分析纯或化学纯 。
实验方法和结果
1
、 粗璐分离
取亚香棒虫草子囊果 18 2 9, 用乙醚 : 乙醇 ( 1 : 1 ) 室温下浸泡三次 , 每次一 昼
夜 , 脱去脂溶性和醇溶性物质以及大部分色素 。 用沸水提取水溶性多糖十四次 , 减压
浓缩后 , 加四倍体积工业酒精醇析。 离心 ( 3 0 0 0转 /分 ) 后 , 沉淀物依次用 95 % 乙醇 ,
无水乙醇 , 丙酮 , 乙醚各洗三次 , 抽真空得千粉粗多糖 2 . 5 9 , 产率 17 . 6% 。
2
、 粗掩脱蛋白
( 1 ) 酶法脱 蛋 白 之’ 。 . 〕 ,
取粗糖 x o g , 溶于 1 5o m l蒸馏水中 , 用 N a H C O .调 p H至 7 . 8 , 加入 4 0 0m g链菌蛋 白
酶 ( P r o an s e ) , 加数滴二甲苯防腐 , 37 ℃下培养四天。
培养液倒入透析袋 , 温热蒸馏水透析 12 小时 , 换水三次 , 而后 对 自来 水 透 析一
昼夜 , 再对蒸馏水透析一昼夜 , 换水四次。
( 2 ) S e v a g 法脱蛋 白 〔 . 〕 :
透析后的袋内液按搪液和脱蛋白液 1 · 。 . 2比例 , 加入脱旦白液 ( 氯仿 : 正丁 醇 =
1
:
4 夕, 振荡 , 每小时换一次脱蛋白液 , 反复三次 , 、 在脱蛋白液和下层糖液之间不再
有蛋白层 。 离心后 , 合并糖液 , 水浴蒸发除去正丁醇和氯仿。
脱蛋白后糖液加入五倍工业酒精 , 离心 , 常规干躁 , 得 3 . 7 9脱蛋白粗搪干粉。
3
、 多旅纯化
( 1 ) D E A E一纤维紊 ( D E一 3 2 ) 柱层析 〔 7 , . , “ 〕
取脱蛋白粗糖 g1 , 用D E A E一纤维素柱层析 ( Z x 60 c m ) 分别用 蒸 馏 水 , O。 I N
N a H C O
: 和 o . i N N a O H分级洗脱 , 每一级份洗脱液为 5 0Om l , 流速 i 0 0 m l / h r , 分部 收
集 , 3m l一管 , 取每一级份的单一峰 , 合并 ,浓缩 , 醇析 ,常规干燥 。各级份产率见下表 :…一 - - .硕氛万朴今一{摆一瑞洲
}
一巡些缈竺竺些胜二班竺i望竺 - -一一车少竺兰卫一兰竺些一一 }氢氧化钠级份 ( c h一N a 0 H ) } 1 5m g 1 1 · 5% l
( 2 ) S ePh r a o s e6B 柱层析
取 C五一 N aH C O 3 1. l e g, 经 S e p h a r o s e 6B柱层析 ( 2 x s o e m ) , 流速 g m l / il r ,
分部收集 3 nI l / 管 , 经酚一硫酸法测糖含量 〔” 〕 , 可看出有两个洗脱峰 , 合并每一洗脱
峰 , 浓缩 、 醇析 、 常规干躁 、 得第一峰 ( C h一 1 ) 162 m g干粉 , 第二洗脱峰 《 C h一 2 》
5 2 Om`干粉。 两种精糖对原 1 2 8` 子囊果的分离产率分别为 0 . 1 27 %和。 . 4 06 % 。 (见图 1 )
件 ,
州卜曰
.
` ’州
困 1、 S o Ph . r o s e 6 B柱层析乡抽纯化洗脱峰
4
、 箱抽纯度分析
分别取 C h一 1和 C il一 2各 i o m g , 经 S e p h a r o s e 4B柱层析 ( 2 . s x l o o C m , i Z m l / h r ,
m l/ 管 ) , 可见到单一峰 , 表现为良好的柱层析均一性 。 ( 见图 2 )
奋 ,
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乡挤 `奋 二护为吸 门.、、
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田 2、 C h一 1 (实线 )和C h一 2 (应线 ) S e p h a r o s e 一B往层析目一性
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一~ 一乙么一一该之一孟 _ 、 一 J一 .一二一` - , 一一_二 二 / 口 一 I 一 之 , 当 ` 乙产 , 3 2 / O 一 , 一夕 一 3 ( ` 城
日 3、 C h一 i二纤维腆 电泳目炖度实二 在 . 成扭冲浪中
宜峨 . 在映 . 幼一成胶纽钠粗冲浪中
. ` C h一 2. , 好堆腆电泳一纯度
h C一 1和 h C一2 分别用醋酸纤维膜( 2 x 12 c m )电泳测纯度〔 ’ . , ` . 〕。 分别用O。 i
M
,
p H 4
.
5的醋酸缓 冲液 和 0 . i M 、 p H g . 4的碳酸钠一一碳酸氢钠缓冲液 , 恒流50 m A ,
1 5小时 。
电泳完毕后 , 剪成 cI m 宽小长条 , 温水洗脱 , 酚一一硫酸法测糖含母 , 结果均为
单一峰。 ( 见图 3 、 图 4 )
5
、 理化性质洲定
( 1 ) C h月和C h一 2 与 硫酸一咔哩溶液不显色 , 说明不含有糖醛酸 , 〕 , 与 K I
一 I:不显色 , 说明不含有淀粉〔 ’ “ 〕测得 C h 一 H : O , C h 一 和 C L 一 2 比 旋 度 分 别为 :
C a H : o〕 。 ` . = 一 2 2 . 1 0 ( C = 0 。 1 , H : O ) , 〔a : 〕 ’ ` 。 = + 连8 . 7 ( C 二 0 。 1, H : O ) 和
〔a 〕 p “ = 一 1 1 . 2 0 ( C = 0 . 1 , H : O ) 。 酚一硫酸法 〔 ` 注〕测得 C h 一 1和 C h 一 2 糖含量
分别为” . 2 %和 98 . 6% 。
( 2 ) S e p h a r o s e 4B柱层析 ( 2 . s x i o o e m ) 〔 : ” 。 〕 , 流速 1 2m l /h r , 分 部 收 集
4 nZ I管 , 测得 C h 一 1和 C h 一 2 平均分子量分别为 : 43 万和 4 万 ( 见图 5 ) 。
( 3 ) ` h 一 2 红外光谱分析 : 在 8 1 0 “ m 一 ’处有吸收峰 , 表明含有甘 露 糖〔 ` . 〕 , 在
89 o c m
一 ’ 处有特征吸收 , 表明含有p型糖普键 〔 ` 3〕 , 另外 , 还 存 在 1。。。~ 1 1。。 c m 一 ’ 和
3 20 ~ 3 6。。“ ` 一 ’ 的多糖类吸收。 Ch 一 l 红外光谱基本相同于 C h 一 2 的 红 外 光 l谱 .
( 见图 6 ) 。
j `二 习月 J 脚口
.
’
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抽即 , `目 , 户臼 户a . , /’ 一 户口 ,’ 口
C五~ 2与 K B ,压片红外光谱田
嗒
( 4)新华滤纸纸层析 (展层剂 · A :乙酸乙酸 :毗陡 :水 = 2 : l : 2, B · 正
丁辞 , 赌酸 . 水 二 4 : 1 : 5 , 显色剂 : 苯胺一一邻苯 = 甲酸 ) 和硅胶薄板层析表明 .
·
C h 一 l , C h 一 2 , C h 一 H : O , C h 一 N a O H的单糖组分均为甘露糖和半乳糖。
( 5 ) 高碘酸载化: 取 C h 一 1和 C五一 2 分别为 s o m g和 5 5m g , 与 1 0 0二 1的 1 5二M高
碘酸钠溶液在室温黑暗下反应 , 每 4 ~ 5 小时摇动一次 , 间隔一定时间取 l m l , 稀释 250
倍后 , 用紫外分光光度计于 2 2 3 o m测高碘酸消耗。 同时 , 取 s m L反应液 , 加入 2功 1乙 =
醉 振 荡 10 分 钟后 , 用酚酞作指示剂 ,用 O. OIN N a O H标准碱液滴定 , 测甲酸释放量 。
得结果为 : 7 2小时后 , 高碘酸消耗停止 , C h 一 1和 C h 一 2 分别平均消耗1 . 4 04 M / M己糖
和 1 . 41 M / M己搪 , 甲酸释放量平均为 O . 504 M /M己搪和。 . 491 M /M 己糖。 ( 见图 7 )
、.含分钩要牙堵
困7 。 C h一 1和C卜一 2育拱暇钠消耗曲线 实峨 . 表示 C h一 1渭耗曲线 盛峨 . 表示C h一 2梢耗曲 a
讨 论
l
、 初步实验证明亚香棒虫草多糖与C 、 。 i e o d ae 和 C 、 s i en sn is 多糖的单糖组份完全
相同 、 均由甘露搪和半乳糖组成 〔 ” “ 〕 。 但本文报道的 C 、 h a w k e s在 多 搪级 份 方面 ,
在分子量方面和旋光性方面 , 与他们的报道有明显的差异 。 从现有数据推测 , C h 一 1
和 C h 一 2 是 结 构 上基本相凤 只是分子量即聚合度有区别 , 这两种 糖可 能都是含有
妇糖昔键 , 由 ( 1 ` 4 ) 键为主链 , 带有 ( 1 , 3 )和 ( 1 , 2 ) 键 , 以 ( 1 , 6 )
为分枝点的半乳甘露聚糖。
2
、 在用 D E A E一纤维素进行初步纯化时 , 观察到其对色素有较强的吸附 能 力 ,
在多糖的分离的纯化过程中 , 脱色素效果很好 , 而且糖的损失较低 , 特别是用蒸馏水洗
脱 , C h 一 H : O干粉几乎完全无色随 ,着洗脱液 p H增加 ,少部分色素也随搪一起被洗下来 。
3
、 在用 D E A E一一纤维素和 S e p h a r os e 6B纯化多糖时 , 洗脱级份在一 开 始 用
5 ~ 10 倍无水乙醇 , 都不能使糖沉淀 。 但经过减压蒸馏 , 除去乙醇和部分水后 , 再加入
3 ~ 5 倍无水乙醇 , 就能使糖沉淀下来 。 作者认为 , 可能在起初的洗脱级份中 , 多糖分
子被一层水膜所包围 , 从而使多糖分子不能在乙醇中沉淀下来 。 经过减压蒸馏 , 破坏了
这层水膜 , 因而 , 一定量的乙醉 , 就能使其沉淀下来 , 其确切原因 , 仍在探讨之中。
. .
,
今 考 文 献
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