全 文 ：峨物杖术通报
编 述 与 专论 刀了口T E C 月四刃见口 G Y B U L L E TJ W 2 O( )9 年 增 刊
卵母细胞冷冻保存损伤机制的研究进展
包华琼
(重庆市人口和计划生育科学技术研究院 ,重庆 粼x幻20)
摘 要: 卵母细胞冷冻保存后不易成活的主要由于冷冻对细胞造成损伤所致冷冻对卵母细胞造成的损伤主要表现在
徽管徽丝透明带变化和皮质顺拉外排超徽结构变化及染色体崎变
关扭词: 卵母细胞 冷冻损伤 超微结构
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Bao H uaqi ong
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自矶 it in gh an 采用冷冻小鼠卵母细胞获得活
仔以来l] ,卵母细胞冷冻保存技术在人 家畜 实验
动物作 了广泛的探索 , Chen 也获得人卵母细胞冷
冻保存成功12 但由于卵母细胞体积大 水分多 ,胞
质成分复杂 ,对冷冻保护剂和冷冻 解冻过程敏感 ,
冷冻后不易成活 ,这使卵母细胞冷冻保存技术进展
缓慢 特别是人卵母细胞的冷冻保存技术始终处于
实验探索阶段
卵母细胞冷冻保存后不易成活主要原因是保
护剂和冷冻 解冻过程对卵母细胞造成损伤引起
冷冻过程中细胞内冰晶形成造成的机械损伤和高
浓度的保护液对细胞产生的渗透损伤引起卵母细
胞透明带破裂 硬化 ,皮质颗粒排放 ,微管 微丝解
聚后难以从组装 ,染色体畸变等 ,这直接影响到解
冻卵母细胞的成活率 体外受精率 早期胚胎成活
率和妊娠率 ,甚至影响到后代的健康
1 微管方面
微管骨架对温度很敏感 .25 有利于微管的聚
合组装 , 0一4 环境可引起微管解聚 细胞分裂期的
纺锤体主要由微管组成 ,冷却和保护剂作用造成微
管结构破坏使冻卵多出现纺锤体退化 分散和多畸
形 ,复温后不能恢复常态 ,染色体难以重排 ,造成染
色体异位 牛卵母细胞冷冻后 , 70 % 的纺锤体消失 ,
复温后三小时还不能恢复 暴露于乙二醇(EG )的
牛卵母细胞 ,异常染色体增多川但动物间存在差
异 ,小鼠卵母细胞由于中心粒微管蛋白库的物质含
量多 ,复温后微管易于聚合 ,温度变化对其影响不
大I4] 这也解释了冷冻保存小鼠卵母细胞比其它动
物卵母细胞效果好的原因
2 微丝
肌动蛋白微丝与胞质分裂密切相关 ,直接影响
卵母细胞的成熟和受精 ; 微丝活性对纺锤体旋转
极体排出 原核迁移 胞质分裂是必需的 降温冷却
本身对微丝影响较小 ,但冷却时纺锤体和微管解聚
可引起邻近微丝骨架局部变化 冷冻保护剂又州版丝
的稳定性影响极大 ,但受温度 保护剂类型和卵母
收稿 日期
作者简介
:21洲为一0 3一31
:包华琼(197 4一) ,女 ,重庆人 ,助理研究员 ,主要从事哺乳动物生殖技术研究;E 一 mail :b aoh uaq ion 夕 16 3.co m
生物技术通根丑勿tec hn川句口 2 (X 拍 年增 刊
细胞种类影响 20 时 , l , 2一丙二醇(PRO H )处理兔
卵母细胞 , 可引起皮质部聚合肌动蛋白完全消失 ;
二甲基亚矾 (DM SO )处理 ,则微丝分布只有轻微改
变 37 时 , PR OH 处理小鼠卵母细胞 ,可见皮质部
微丝网孔遭到破坏 ,并且破坏肌动蛋白网络l5] 说
明温度越高保护剂对卵母细胞毒性作用越强 冷冻
对徽丝的损伤严重 牛卵母细胞冷冻后 61 % 的肌动
蛋白解聚 , 23 % 的卵母细胞才具有正常的肌动蛋白
结合点 ; 解冻后膜渗透性从 83 % 一92% 降到 36 -
47% 由于皮质部微丝肌动蛋白遭到破坏引起原生
质膜损伤,这逻冷却时对原生质膜的损伤更甚皮
质部微丝与卵质膜结构密切相关 ,从而影响卵质膜
的渗透性16
3 透明带变化和皮质颗粒外排
保护剂和冷冻对细胞骨架系统的损伤 ,引起细
胞皱缩和变形 皮质颗粒提前排放和透明带变硬
皮质颖粒提前释放 透明带变硬使卵母细胞受精率
下降 多精受精增多 ,使卵裂率降低 冷却小鼠卵母
细胞表明 , 卵母细胞在 4 可诱发透明带反应 ,而
10 却不能 ,这种变化是不可逆的 ,将导致皮质含
t 和受精率降低 中等温度 (室温一37 )用 D M SO
处理人和小鼠卵母细胞可引起皮质颗粒释放和透
明带反应 ,降低受精率 ;在 0一4 处理 ,则可极大地
弱化这种变化17 玻璃化冷冻牛体外成熟卵母细胞
的透明带溶解实验里发现冷冻 解冻过程增加了卵
母细胞透明带对蛋白酶溶解的抵抗力[8] 冷冻卵母
细胞皮质区皮质颗粒减少及皮质颗粒胞吐现象 ,可
推断出透明带抗力增强是由于皮质颗粒内容物排
到卵周隙 ,作用于透明带引起的l0] 在冷冻保护液
中添加血清可减弱成熟前皮质颗粒释放l01
4 超徽结构方面的变化
孙青原 (19 4 )研 究了用不同冷冻方法对牛生
发泡 (ge rm in al ves icl e, G v )期和体外成熟卵母细胞
超徽结构的损伤l川结果表明程序化和玻璃化冷冻
对牛 G V 期卵母细胞的超微结构都有不同程度的
损伤 ,主要表现为细胞膜破坏 ,微绒毛减少或消失 ,
各种细胞器及内容物如线粒体 微管 高尔基体 内
质网及囊泡损伤 与 G V 期卵母细胞相比 ,体外成
熟卵母细胞冷冻损伤较轻 , 主要表现为细胞膜完
整 ,微绒毛减少不多 ,囊泡不发生融合 ,线粒体和囊
泡损伤较轻 Fuk u( 19 5) 也发现玻璃化冷冻牛未成
熟卵母细胞的微绒毛 线粒体 囊泡受到破坏 , GV
期卵母细胞对冷冻的敏感性比 IV M 卵母细胞更高
2H oc hi (19 6) 对马的未成熟卵母细胞玻璃化冷
冻后的超微结构观察 ,发现在卵周隙有大量的空泡
存在 ,线粒体肿胀 ,基质电子密度低 ,卵母细胞一卵
丘细胞的连接破坏 刘海军对山羊卵母细胞开放式
拉管 (ope n pul led straw , OPS )冷冻后超微结构观察
也得到类似结果l]H yttel(2(X旧)对 O PS 冷冻牛的
成熟卵母细胞超微结构观察发现 ,解冻后卵母细胞
出现膜囊泡 ,皮质颗粒成团 ,缺乏单独排在质膜下
的皮质颗粒 , 并且呈现不同程度的退化 受精后
24 h ,囊泡消失 ,多精受精情况增多 ,空泡内有退化
的皮质颗粒 受精 72h ,卵裂率低 ,卵裂球内有空
泡 ,呈现退化 ,核仁异常 41这说明冷冻所致的超徽
结构变化影响了其后发育的能力
5 染色体畸变
卵母细胞冷冻后骨架系统和超微结构的改变 ,
致使染色体分布异常 ,导致染色体畸变 ,可引起遗
传缺陷的可能 l1f 用 D M SO 慢速冷冻小鼠卵母细
胞 ,随后受精和第一次卵裂阶段的卵母细胞多倍体
增加I61 也有报道玻璃化冷冻小鼠卵母细胞受精后
非整倍体增加 研究证明:老化卵母细胞冷冻后 受
精后畸形率增加 ;卵母细胞反复冷冻后可导致非整
倍体增加f7j 冷冻造成的染色体畸变可能可通过改
进冷冻方法来避免 研究发现采用开放式毛细玻管
法 (gl as s m iero pipe*te , G M p ) 开放式拉管法 (o伴n-
puled一straw , O PS ) 电镜铜纱网法(Eleetro n一而ero -
seo伴一gh d ) 细管玻璃化法 (Stra w V itrificat ion)四种
方法冷冻小鼠成熟卵母细胞 ,虽然解冻后纺锤体和
染色体的异常率远比对照高 ,但随着解冻后培养时
间增长 , 绝大多数纺锤体和染色体能恢复正常形
态 ,但 st ~ 玻璃化效果较差IlsJ
卵母细胞冷冻的损伤机制研究目前绝大多数
还局限在动物卵母细胞上 ,人卵母细胞这方面的研
究还很少 随着社会的工业化发展 ,科学技术对人
类带来福音的同时 , 它的负面效应一 环境问题和
特殊工种导致的人类不育不孕及致癌 致晴 致突
变等问题出现 ,使为保证人类繁衍的生殖保险被提
上 日程 卵母细胞冷冻保存是建立生殖保险的必备
2 (X 为 年 增 刊 包华琼 :卵母细胞冷冻保存损伤机制的研究进展 29
技术之一 但是采用冷冻卵母细胞生育后代的安全
性问题并没解决 加强这方面的研究有助于探索出
高效无毒的冷冻方法保存人卵母细胞 , 建立卵子
库 ,促进冷冻人卵技术实用化运用 ,从而解决因卵
巢早衰 癌症病人 特殊工种的妇女的生育问题 这
具有重大的社会意义
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