全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
人锰超氧化物歧化酶基因剪接异构体的表达分析
王峰 1, 2 黄璐圆 3
( 1暨南大学药学院,广州 510632; 2暨南大学中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室,广州 510632;
3中国科学院广州生物医药与健康研究院分子医学中心,广州 510633)
摘 要: 对人锰超氧化物歧化酶 ( hum an manganese superox ide d ism utase, hM nSOD )基因剪接异构体进行分析, 并检测异
构体的表达情况。在 GenBank库中检索人锰超氧化物歧化酶基因异构体及编码基因组序列,利用 V ectorNT I 9生物软件进行
核酸及蛋白序列比对 ;利用 RTPCR方法分析锰超氧化物歧化酶基因异构体的表达。结果显示, 在 GenB ank库检索发现有 3
种人锰超氧化物歧化酶基因异构体,剪接异构的类型为可变的 5 剪接位点和外显子盒, 各异构体基因内含子均符合 ! GTAG∀
规则。 3种基因异构体编码两种异构体蛋白, 即 222个氨基酸的人锰超氧化物歧化酶蛋白以及中部缺少 39个氨基酸的截短
型异构蛋白。RTPCR检测结果表明,剪接异构体 hM nSODb在 HEK293T和 H SC细胞中的表达比在 H epG 2细胞中高, 未见
异构体 hM nSODc的表达。
关键词: 锰超氧化物歧化酶 剪接异构 表达
Study on Expression ofHumanM anganese Superoxide
Dismutase Gene Splicing Isoform s
W ang Feng
1, 2 Huang Luyuan3
(
1
Collge of Pharmacy, J inan University, Guangzhou 510632; 2 Guangdong Province Key Laboratory of Pharmacodynam ic
Constituents of TCM and N ew D rugsResearch, Guangzhou 510632;
3
Center of M olecularM edicine, Guangzhou Institute of
B iom edicine and H ealth, ChineseA cademy of Sciences, Guangzhou 510633)
Abstrac:t It w as to analyze the sequence o f human m anganese superox ide d ism utase gene( hM nSOD ) sp lic ing isoform s, and to
detect the express ion of hM nSOD sp licing iso form sThe sequence of hM nSOD transcr ipt splic ing isofo rm s and its genom ic sequence
w ere obta ined by searching GenBank, and a lignm ent o f hM nSOD transcr ipt isoform s nuc leo tide sequences and coded am ino acid se
quences w ere carried out by Vecto r NT I 9 softw areRTPCR w as em ployed to ana lyze expression o f the hMnSOD transcr ipt iso
form sResults ind ica te tha t there are three hMnSOD splic ing isofo rm s in G enbankThe types o f a lternative sp lic ing are a lternative 5
splic ing sites and cassette exonsA ll sequences a t the exonintron junctions in a ll isoforms of hMnSOD mRNA are consistent w ith the
GTAG ruleThree iso fo rm s o f hM nSOD mRNA encode tw o hMnSOD iso form s, a 222 am ino ac id pro tein and a 39am ino ac id trun
ca ted pro teinRTPCR results show ed that the lev el o f hMnSODb in HEK293T and HSC w as h igher than in H epG 2 ce ll and hM n
SODc iso form was no t detec ted in HEK293T, H epG 2 and H SC cellThere are th ree hM nSOD splic ing iso form s in GenBankThe types
o f splicing isoform s are a lterna tive 5 splicing sites and cassette exons hMnSODbmRNA w as de tected in HEK293T, H epG 2 and HSC
ce l,l but hM nSODc isoform w as not detected
Key words: M anganese superox ide d ism utase A lternative splicing Expression
收稿日期: 20091216
基金项目:广东省医学科学技术研究基金项目 ( B2008095) ,国家自然科学基金项目 ( 30700704) ,暨南大学 211项目
作者简介:王峰,男,博士,助理研究员,主要从事基因工程药物研究; Em ai:l novelfunction@ 163 com
超氧化物歧化酶 ( superox ide dismutase, SOD)是
一种广泛存在于动物、植物和微生物中的金属酶,它
能够有效地清除生物体内多余的氧自由基, 使之转
化为分子氧或过氧化氢, 保护细胞的正常生存。超
氧化物歧化酶及其活性变化与衰老、炎症、肿瘤、放
射病、自身免疫性疾病以及某些传染性疾病的发生、
2010年第 3期 王峰等:人锰超氧化物歧化酶基因剪接异构体的表达分析
发展及转归密切相关 [ 1]。 SOD根据其辅基部位结
合的不同金属离子分为 3类: 锰超氧化物歧化酶
(M nSOD) ,铁超氧化物歧化酶 ( FeSOD)和铜锌超
氧化物歧化酶 ( Cu /ZnSOD )。MnSOD主要位于线
粒体, 线粒体是细胞内能量产生和氧代谢的重要场
所,含有大量产生活性氧的酶系统和非酶系统,是自
由基产生的场所,因此线粒体又是氧损伤的主要靶
细胞器,决定了 MnSOD在抗氧化酶中的特殊地位。
MnSOD基因的剂量与酵母、果蝇和小鼠的寿命相
关。MnSOD基因敲除的杂合小鼠衰老时线粒体
DNA因累积过量而受到损伤,完全缺失 MnSOD基因
的小鼠在出生后几个星期死亡,并表现出 (取决于遗
传背景 )包括神经恶化、心脏畸形和广泛的线粒体损
伤 [ 2, 3]。MnSOD在促进细胞分化和癌症发生以及活
性氧过多诱导的肺部毒性中起重要作用 [ 4]。
人 MnSOD基因是一个由核基因编码的线粒体
蛋白, 位于 6号染色体 6q25。本研究在 GenBank库
中查找了人锰超氧化物歧化酶 ( human manganese
superox ide d ismutase, hM nSOD)基因异构体, 对异构
体进行序列比对,分析其基因组结构,并对异构体在
不同细胞中的表达进行了探索,这为进一步研究人
锰超氧化物歧化酶异构体的剪接异构的生物学意义
奠定了基础。
1 材料与方法
11 材料
Trizo lReagent购自奇华盛公司;胎牛血清购自杭
州四季青生物研究所; 1640培养基购自杭州吉诺公
司;焦碳酸二乙酯 ( DEPC)、Taq聚合酶购自鼎国公
司; dNTP购自 TaKaRa公司; EB替代物购自广州威佳
公司; T IAN ScriptM MLV、RNasin购自天根公司; 引
物合成于上海英骏公司;其它试剂均为国产分析纯。
12 引物设计
按照引物设计原则, 采用引物设计软件 Prim
er50,设计引物如表 1。
表 1 引物序列表
引物名称 序列 ( 5 - 3 )
hA ct in FP GGGAAATCGTGCGTGACATT
hA ct in RP CTCGTCATACTCCTGCTTGCTG
hMnSOD FP AAGCACAGCCTCCCCGACCT
hMnSOD RP TTACTTTTTGCAAGCCATGTATCTT
hMnSODE5RP ATAGAAAGCCGAGTGTTTCCCT
13 DNA序列及其编码氨基酸分析
用 VectorNT I 9软件分析核苷酸及其推导的氨
基酸序列,序列 BLAST[ 5]比较分析在 G enB ank数据
库中进行。在 NCB I网站上运行 BLASTN后寻找与
之高度同源的基因组 BAC克隆,记录 cDNA与基因
组 BAC克隆的匹配情况, 同时对其中的可疑部分作
适当的手工校正。用 DNAMAN软件绘制剪接异构
体的基因组结构示意图, 用 DNA sis软件分析 hM n
SOD各异构体的外显子、内含子的 G + C含量。
C lusta lX ( 181) [ 6]和 GeneDoc用来对 hM nSOD异
构体蛋白序列进行多重序列联配分析。
14 人锰超氧化物歧化酶基因异构体的扩增
141 细胞总 RNA的提取 收集培养的的细
胞,用 PBS洗涤两次, 离心收集细胞团并转入 EP
管;每管加入 1 mL T rizo lR eagen,t反复吹打至细胞
完全溶解,室温静置 5 m in; 取 300 L Trizo l液, 加
入氯仿 200 L,剧烈振摇 15 s, 静置 5 m in, 12 000
r/m in 4# 离心 15 m in; 小心吸取上层水相至另一
EP管,加入 200 L异丙醇, 颠倒混匀, 室温静置
10 m in, 12 000 r /m in 4# 离心 10 m in; 弃上清, 用
75%乙醇 1mL小心漂洗沉淀物, 12 000 r/m in 4#
离心 5 m in; 弃上清, RNA沉淀室温风干至透明胶
冻状, 加入 30 L DEPC处理过的去离子水混匀
溶解。
142 反转录 将以下体系 ( 50 L)在离心管中
加入 O ligo( dT) 50 L,细胞的 RNA 23 L, dNTP混
合物 50 L,将以上混合物在 70# 加热 5m in后迅
速在冰上冷却 2m in。再加入 5 ∃F irstBu ffer 10 L,
DTT 25 L, RN asin( 40 U /L) 20 L, TIAN Script
M MLV ( 200U /L) 25 L, 并轻轻用移液器混匀;
42# 反转录 60 m in, 95# 加热 5 m in, - 20# 保存
备用。
143 PCR扩增 以细胞 cDNA为模板, PCR反应
体系为 10 ∃ buffer 2 L, 10 mmo l/L dNTP 2 L,
20 mo l/L上游引物 05 L, 20 mo l/L 下游引物
05 L, Taq聚合酶 05 L,加水至 20 L。PCR反
应条件: 94# 变性 5m in后, 进行 30个循环,程序为
94# 变性 30 s, 55# 退火 30 s和 72# 延伸1 m in。取
8 L PCR扩增产物在含 1% EB替代物的琼脂糖凝
胶上电泳。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
2 结果
21 hM nSOD基因异构体的基因组结构分析
登录 NCBI网站, 查找到 3种不同的 hM nSOD
基因异构体核酸序列, 其中 NM _001024465、NM _
000636、NM _ 001024466 分别为 hM nSODa、hM n
SODb、hM nSODc基因异构体序列, NT _00742213
为 hM nSOD基因的基因组序列。对 3个异构体及
其基因组进行比对分析, 发现 hM nSODa基因有 6
个外显子和 5个内含子, hM nSODb、hM nSODc有 5
个外显子和 4个内含子 (图 1)。内含子和外显子交
接区核苷酸分析如表 2所示,所有内含子和外显子
交接区都符合 ! GTAG∀规则,外显子平均长度为
277 bp, 内含子平均长度为 3 468 bp,内含子中 T的
含量普遍较高, 为 30%左右。 hM nSODb剪接异构
的类型为可变的 5 剪接位点, hM nSODc剪接异构
的类型为外显子盒。
图 1 hM nSOD剪接异构体的的基因组结构示意图
表 2 人锰超氧化物歧化酶基因外显子和内含子交接区核苷酸序列分析
外显子 G+ C含量 (% ) 长度 ( bp) 剪接供体位点 内含子
G+ C
含量 (% )
T含
量 (% ) 长度 ( bp) 剪接受体位点
A1B1C1 7117 177 CAGTGTGCGGgtgagaagaa a1b1 c1 7544 1174 281 tcgtcttcagCACCAGCAGG
A2B2C2 6255 203 TTGGCCAAGGgtaggttcca a2b2 4254 3128 4418 aacttttcagGAGATGTTAC
A3B3 4786 117 GAACCCAAAGgttggtatat c2 4256 3092 7627 tttt taatagGGGAGTTGCT
A4B4C3 4888 180 GGAACAACAGgttagattta a3b3 4239 3069 3092 tttt taatagGGGAGTTGCT
5AC4 4060 165 GTTATGCTGAgtatgttaag a4b4c3 4053 3142 2215 tttctaacagGCCTTATTCC
5B 3722 916 AGGAAAGCAGAAGTT a5 c4 3876 3376 3175 tcactttcagTCATACCCTA
6A5C 3333 183 CTGTCAACCATCAAA
小写字母表示内含子,大写字母表示外显子
22 hM nSOD基因异构体的编码蛋白氨基酸分析
由于外显子的可变剪接,存在 3种 hM nSOD基
因剪接异构体, hM nSODa和 hM nSODb中的外显子
3 ( A3B3 )在 hM nSODc中被当成内含子剪切掉,
A3B3长度为 117 bp, 正好为 3的整数倍, 因此可变
剪接并未造成开放读码框的移码。 hM nSODa和
hM nSODb基因编码由 222个氨基酸组成的正常
hM nSOD,而 hM nSOD c基因编码由 183个氨基酸
组成的缺失第 77- 115个氨基酸的截短型的异构体
蛋白 hM nSODc(图 2)。 hM nSODa和 hM nSODb蛋
白包含 H is50、H is98、Asp183和 H is187四个保守
的与锰离子结合的保守活性位点 [ 7] , 而 hM nSODc
只包含 3个位点,缺少其中的 H is98位点。
%表示保守的锰离子结合位点
图 2 人锰超氧化物歧化酶基因异构体编码蛋白氨基酸序列对比
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2010年第 3期 王峰等:人锰超氧化物歧化酶基因剪接异构体的表达分析
23 hM nSOD基因异构体的表达分析
以各种细胞 cDNA为模板, 以 hM nSOD FP、RP
和 hM nSOD FP、E5RP引物组合 (表 1)进行 PCR分
析,以检测 HEK293T、H epG 2、HSC 3种细胞中 hM n
SOD剪接异构体的表达情况。结果如图 3所示,经凝
胶电泳显示用 hM nSOD FP、RP引物在 HEK293T、
HepG 2、HSC 3种细胞中仅可以扩增出 597 bp大小的
片段,没有扩增出 476 bp大小的片段,表明 3种细胞
中存在 hM nSODa或 hM nSODb基因的表达, 不存
在 hM nSODc基因的表达。用 hM nSOD FP、E5RP
引物在 HEK293T、H epG 2、HSC 3种细胞中均可扩
增出 1 017 bp大小的片段, 这表明 3种细胞中均存
在 hM nSODb基因的表达, 其中 H epG 2细胞中
hM nSODb基因的表达较其它两种细胞弱。
1HEK293T; 2H epG 2; 3HSC
图 3 RTPCR分析 hM nSOD剪接异构体的表达
3 讨论
可变剪接 (又称选择性剪接 )是指从一个 mR
NA前体中通过不同的剪接方式 (选择不同的剪接
位点组合 )产生不同的 mRNA剪接异构体的过程。
可变剪接是一种在转录后 RNA水平调控基因表达
和产生蛋白质组多样性的重要机制。通过不同的生
物信息学的方法,从基因组的水平进行分析,结果一
致显示约 40%以上的人基因有可变剪接形式 [ 8]。
本研究分析了 GenBank中存在的 3种 hM n
SOD基因剪接异构体及其基因组序列, 找出各异构
体所对应的外显子,推导出可变剪接的模式。可变
剪接首先造成了 mRNA长度的差异,虽然 hM nSO
Da基因和 hM nSODb基因剪接异构体编码蛋白是
一致的,但是 hM nSODb多一个 751 bp的 3 非翻译
区 ( 3 untranslated reg ion, 3 UTR)调控区, 3 UTR具
转录本特异性,它在 mRNA转录后修饰、细胞内定
位及转运、维持 mRNA稳定性及保证翻译的效率方
面都具重要的调控功能 [ 9]。 hM nSODb基因多出的
751 bp的 3 UTR的调控功能有待于进一步的确证。
其次可变剪接造成了编码蛋白氨基酸的差异, 即产
生了一种中部缺少 39个氨基酸的截短型的 hM n
SODc, 此截短型异构体蛋白缺少保守的 H is98位
点, 而此位点是与金属活性中心锰离子形成金属键
的 4个保守位点中的其中一个, 因此截短型异构体
蛋白可能活性会有所降低。
本试验采用两对不同的引物分别去观察 hM n
SOD基因剪接异构体的表达情况, 结果显示 3种细
胞中均不存在 hM nSODc的表达,均存在 hM nSODb
的表达, 而 HepG 2细胞中 hM nSODb的表达较
HEK293T和 HSC细胞弱。结果充分暗示不同细胞
中存在不同的可变剪接行为, hM nSOD基因可能通
过可变剪接在不同的细胞中产生不同浓度的转录
本,对不同细胞中的 hM nSOD蛋白表达水平进行调
控,控制细胞中的氧化还原状态。本研究为进一步
研究 hM nSOD基因异构体的功能和表达调控奠定
了基础。
参 考 文 献
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(下转第 172页 )
167
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
定结果分析本试验中融合表达的重组 hIL10蛋白
分子量约为 420 kD,考虑可能为二聚体形式, 该形
式是 hIL10发挥生物学活性的自然状态。当然,仅
从分子量大小上分析,不能排除目的蛋白被糖基化
的可能,但通过 ELISA检测可证实表达的重组蛋白具
有较好的抗原性。重组 hIL10蛋白的纯化应用了镍
琼脂糖凝胶 FF柱,其原理是离子亲和层析,纯化柱填
材中螯合的镍离子可与重组蛋白中融合表达的 6 ∃
H istag结合,镍琼脂糖凝胶 FF的配基是 IDA,镍离子
有 6个螯合价数, N iIDA螯合了 3价,剩余 3价可结
合 3个组氨酸残基, 结合较稳定,所需洗脱液中咪唑
浓度较高, 本试验中 300 mM咪唑洗脱效果较理想,
融合重组蛋白的纯度初步纯化后可达 670%。
外源基因的特性是决定表达成败的首要因素,
其次, 外源蛋白的理化特点、转化子的表型、包内表
达或分泌表达方式以及诱导表达的条件等都会影响
目的蛋白的表达效率。总之,影响外源基因在毕赤
酵母中高效表达的因素复杂而多样, 目前, 实现了
hIL10在毕赤酵母 SMD1168中的成功表达, 下一步
要通过探索最佳的优化表达条件, 进而作小规模的
发酵尝试, 使 hIL10在毕赤酵母中实现高效表达,
为 hIL10的基础研究和临床应用打下基础, 加速重
组 hIL10国产生物药品的开发。
参 考 文 献
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