全 文 ：武汉植物学研究 , 一
阴 月
韭菜线粒体锰超氧化物歧化酶
纯化及性质研究
’
杨 雄“ 翟颐华 邹国林
武汉大学生物化学与生物物理学系 武汉 。。
提 要 经硫酸按沉淀
、 一 叩 层析和 一 凝胶过滤 , 将韭 菜线粒体
纯化到均一程度 。 从 韭菜叶片线粒体中纯化得到 酶 , 酶 比活力达
蛋白 。 该酶对 和 都不敏感 , 热稳定性弱 , 紫外光区吸收峰在 , 凝胶过
滤法测得其分子量为 , 一 法测得其亚基分子量为 , 法测得其
一末端氨基酸为撷氨酸 。 上述结果表明该酶是 由 个相同亚基组成的 一
。
关链词 锰超氧化物歧化酶 , 纯化 , 性质 , 韭菜线粒体
超氧化物歧化酶 催化 子 一 反应
, 在体内清除 歹中起重
要作用 。 线粒体 的研究 , 以及对其与胞质 和叶绿体 进行 比较研究 , 对解释
线粒体自身防护氧 自由基的损伤及线粒体的起源等均有重要意义 。
国内外尚未见韭菜 的研究报道 。 作者对韭菜胞质 和叶绿体 进行过研
究 〔,
, 。 现报道对韭菜线粒体 的研究结果
。
材料与方法
材料和试剂
材料为韭菜 “ 品种一一 青格子
。 一 产品 、
一 产品 、 标准蛋 白质
、 标准氨基酸均 为层析纯 , 其它试齐均为
国产分析纯或生化试剂 。
方法
蛋 白质浓度测定 采用考马斯亮蓝 一 染色法 〔 〕
。
酶活力测定 采用氧化硝基氮蓝四哇光还原法 法 〔”〕, 以抑制 光还原
收稿 日 , 修回 。 第
一
作者 男
,
岁
,
讲师 , 从 事生物化学教学与科研 作
湖北省科委重点科技项 日 。
” 武汉教育学院工作 , 在武汉大学酶学 实脸室进修
。
武 汉 位 物 学 研 究 第 卷
率达 的酶量定义为 个酶单位
。
分离线粒体 韭菜叶片 加 缓冲液
·
, 磷酸
钠缓冲液 , 含 , 蔗糖 , 琉基 乙醇 匀浆 , 纱布过滤 。 滤液
经 离心 , 取上清液 , 上清液经 离心 除去叶绿体 , 再
经 离心 得到线粒体
。
线粒体用缓冲液 洗 遍 , 洗净的线粒体加
缓冲液 , 磷酸钠缓冲液 , 含 。 琉基乙醇 置冰箱保存 。
制备粗酶液 线粒体经 冻融 处理 后 用研钵 研磨 , 再 经超声波 处理 , 最 后经过
离心 取上清液 , 此即为粗酶液 。
确定盐析条件 取相同体积的粗酶液 份 , 分别加硫酸按至饱和度为 、
、
、 、 写 , 静置 后经 离心 取沉淀 。 沉淀溶解于缓冲液 ,
并对缓冲液 透析过夜 。 将透析后的溶液调整到相同体积
,
分别测酶活力和蛋 白质浓度 。
分别以 , 。 。 值和 光还原抑制率为纵坐标 , 硫酸钱饱和度为横坐标绘制盐析曲线 ,
确定盐析的硫酸按饱和度为 。
酶的纯化 粗酶液经饱和度为 的硫酸按盐析 , 取沉淀并经缓冲液 溶解和
透析后上 一 柱 又 。 。 用缓冲液 淋洗至 。 。 为 后 , 再
用 , 一 磷 酸 钠 缓 冲液 , 进行 线性 梯 度 洗脱 , 流速
, 每管 部分收集 。 经活力测定合并酶活力峰 , 并浓缩至 后上
一 柱
·
火 , 流速 , 每管 部分收集 。 经活力测定合并酶活力
峰 , 置冰箱保存
。
聚丙烯酞胺凝胶 电泳 采用不连续垂直板状电泳‘ 〕。 电泳后胶板从中间切开 , 分
别进行蛋 白染色和酶活性染色〔 , 。
抑制剂敏感性实验 用 和 为抑制剂 , 测定酶对这两种抑制剂的敏感性 。
热稳定性研究 酶样品分别在 、
、 、 、 保温 , 、 、
、 后测定酶活力 。
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一
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分子量和亚基分子量测定 分别采
用 一 凝 胶 过 滤 法 〔, 〕和
〕 法 〔 〕测定 。
一末 端 氨 基 酸 测 定 采 用
法 〔 , 。
结果与讨论
盐析曲线
结果 见图 , 根据 图 选 择 饱和度
硫酸铰一次性盐析
。
酶纯化结果
结果见表
。 从 叶片的线粒体中
纯化得到 酶 。 酶样品电泳后进行蛋白
一 火
硫酸 按饱和 度
’
光还原抑制率 ,
飞
飞
图 韭菜线粒体粗酶液硫酸按分级盐析曲线
飞
染色和酶活性染色 , 蛋 白带与酶活性带相对应 图 , 表明酶 已纯化到均一程度
。

武 汉 植 物 学 研 究 第 卷
分子量和亚基分子 量
凝胶过滤法测得该酶分子量为 。 一 法测其亚基分子量为
图 。 表明该酶 由 个相同亚基组成 。 一般 · 一 由 个相同亚基组成 〔‘
, , , 〕
而线粒体 一 由 个相同亚基组成 〔‘。〕
。
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认一曰无乙气︵次︶只定架蒸
牛
保温时间
、
图 韭菜线粒体 的热稳定性
溶菌酶 , 。 碳酸醉酶
飞 卵 清 蛋 亡
牛血清蛋白氏 、 磷酸化
酶 飞
图 法测韭菜线粒体 的亚基分子工
、 一
一 末端氛基酸
法测得酶 一 末端氨基酸为颗氨酸 。 它与小 白菜线粒体 一 的 一末端氨基
酸相同〔‘。〕。 实验中 , 聚酞胺薄膜层析只出现 一 荧光斑点 , 未出现其它 一 氨基酸
荧光斑点
。
这也为该酶 已达均一程度提供了旁证
。
参 考 文 献
协
翟颐华 邹国林
,
杨雄 韭菜饱质铜锌超氧化物歧化酶的纯化及性质研究 武汉植物学研究 ,
, 一
翟颐华 韭菜的三 种 研究 及 电泳多带现象初步探讨 〔武汉大学硕士学 位论文 〕武汉 武汉 大学 ,
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一 注 , , , 。 ‘几尸 , , 一
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赵永芳 生物化学技 术原理 及 续应用 第 版 武汉 武汉大学 出版社 引 一
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邹国林 , 罗时文 荣俊等
,
小白菜叶绿体铜锌超社化物歧化酶的纯化 和某些性质研究 生物化学与生物物理学报
,
邹国林 , 罗时文一种小 菜叶细饱 容质铜锌超 城化物歧化酶的纯化和性质研 究 生物化学 杂志
,
第 期 杨雄等 韭菜线粒休锰超氧化物歧化酶纯化及性质研究
邹国林 , 罗时文 , 裘名宜等 小白菜线粒体锰超氧化物歧化酶的纯化和性质研究 生物化学与生物物理学报 , ,
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