全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
大薯 ISSRPCR反应体系的优化
程文杰 罗欣 周鑫 黄小龙 黄东益
(海南大学农学院,儋州 571737)
摘 要 : 以大薯为材料, 通过试验优化了 ISSRPCR反应体系中的主要成分用量及浓度、退火温度对大薯 ISSR扩增结果
的影响。试验表明: 在 20 L的反应体系中, M g2+的浓度为 1875 mm ol/L, dNTPs浓度为 0 500 mmo l/L, 引物的浓度为 1. 0
mo l/L, Taq DNA聚合酶的用量为 1U,模板 DNA的用量为 60 ng, 在 48 的退火温度下 45个循环, 能得到清晰、多态性高的
ISSR带谱。
关键词: 大薯 ISSR 反应体系 优化
Optim ization of ISSRPCR Reaction System forD ioscorea alata L.
ChengW en jie Luo X in ZhuoX in H uang X iao long Huang Dongyi
(College of Agronomy, H ainan University, D anzhou 571737)
Abstrac:t The fac to rs tha t affecting the ISSR ( inters imp le sequence repeat) resu lt o fD ioscorea a la ta L. w ere stud ied. By ad
justing DNA tem p la te, pr im er, Mg2+ , dNTPs, Taq DNA po lym e rase, annea ling tem perature and cyc le o f PCR reac tion w ere optim ized.
The resu lts show ed that the optim ized content cons ists o f DNA w as 60 ng, pr im erw as 1. 0 m o l/L, M g2+ w as 1 875 mm o l/L, dNTPs
w as 0 500 mm o l/L, Taq DNA po lym erasew as 1U, annea ling temperature w as 48 , 45 cycles o f PCR reaction , in 20 L reac tion
system.
Key words: D ioscorea ala ta L. ISSR ( intersimp le sequence repeat) Ana lysis system Op tim ization
收稿日期: 20100109
基金项目:海南省重点学科建设专项经费 ( xkxm0811 03) ,高等学校博士学科点专项科研基金 ( 200805650004 )
作者简介:程文杰,男,在读硕士,研究方向:植物分子标记; Em ai:l boyailin@ 163. com
通讯作者:黄东益,男,教授,博士,研究方向:从事作物遗传及能源植物; Em ai:l hdongy@i 126. com
大薯 (D ioscorea alata L. ), 又名参薯, 为薯蓣科
薯蓣属藤本植物;产量潜力大, 淀粉含量高, 生育期
短,分布范围广, 在我国湖北及其以南的省份均有种
植。大薯营养丰富,果肉色泽鲜艳,口感俱佳, 是人
们喜爱的一种副食, 目前已用作食品、饲料、中医药
等。国外有学者通过 AFLP分子标记技术对大薯与
薯蓣植物的相关性 [ 1]、基于 AFLP的 QTL分析 [ 2]有
研究报道,而我国尚未有关于大薯分子标记研究工
作的报道。
ISSR分子标记又称为 ISSR ( intersimple se
quence repeat)又称简单重复序列间扩增, 是在 SSR
基础上发展起来的一类新型的分子标记技术, 它
是以微卫星序列为引物, 进行多位点 PCR扩增的
技术 [ 3]。 ISSR技术简易、快捷, 引物设计无需预知
基因组序列, 只要是目标区域的长度在可扩增范
围内, 就能扩增出微卫星重复序列间的 DNA片
段 [ 4]。所以 ISSR标记多广泛应用于品种鉴定、遗
传多样性、系统进化关系、遗传作图等领域 [ 3] , 目
前 ISSR标记已广泛应用于水稻 [ 5 ]、小麦 [ 6]、玉
米 [ 7]等植物的资源分类及遗传图谱的构建, 但国
内外尚未见有大薯的 ISSR反应体系构建的研究报
道。本研究探讨影响大薯 ISSR反应的各种因素,
建立有效稳定的大薯 ISSR反应体系, 为 ISSR分子
标记技术应用于大薯资源分类、遗传育种及遗传
多样性研究奠定基础。
1 材料与方法
11 材料
试验叶片采用海南大学农学院薯蓣资源圃大薯
叶片材料。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
12 试剂和仪器
本试验选用的 ISSR引物是哥伦比亚大学
(UBC )公布的通用引物。由南京金思特科技有限
公司合成, 5 U /L Taq酶, 10 mmo l/L dNTPs, 10 !
Taq buffer( M g
2+
25 mmo l /L )为 B IOM IGA公司提
供, Go ldv iew 核酸 染料为 BB I公司 产品, DNA
M arkerDL100为博迈德公司产品。 ISSRPCR扩增
反应在 B iometra公司生产的 Tg rad ient型 PCR仪上
进行。
13 基因组 DNA的提取与检测
采用改良 CTAB法提取新鲜大薯叶片基因组
DNA
[ 8- 11]。通过 08%琼脂糖凝胶电泳初步检测其
质量, 用紫外分光光度计检测 DNA质量和浓度,最
后将提取的 DNA原液放置冰箱 - 20 保存。用于
ISSRPCR反应的工作液稀释至 40 ng /L备用。
14 ISSR反应体系和程序
试验采用通用 ISSR引物 ( UBC )对盾叶薯蓣
DNA进行 PCR扩增。初始反应总体积为 20 L, 包
括模板 DNA ( 20 ng /L ) , 引物 ( 5 ng /L ), M g2+
( 15 mmo l/mL ) , Taq酶 ( 5 U /L) 03 L, dNTPs
( 05 mmo l/mL), 加双蒸水到 20 L。其中, 模板
DNA浓度、引物浓度、Mg2 +浓度、Taq酶、dNTPs浓
度、退火温度作为影响因子分别设置不同的处理
加以研究 (表 1)。根据相关文献和预试验确定
PCR反应程序。扩增反应程序: 94 预变性 5
m in;每个循环 94 变性 45 s, 特定温度下退火 45
s, 72 延伸 13 m in, 35个循环; 72 延伸 10 m in。
扩增后 PCR产物在 4 保存。对其中循环数目作
为影响因子设置梯度进行对比确定最佳循环
数目 [ 11 - 14]。
表 1 ISSRPCR体系各影响因素梯度水平
编号 模板 DNA剂量
( ng)
引物浓度
( m ol/L)
M g2+浓度
(mmo l/L )
Taq酶剂量
( U)
dNTPs浓度
(mm ol /L)
退火温度
( ) PCR循环数
1 20 02 0625 1 0125 46 25
2 40 05 1250 15 0250 48 35
3 60 08 1875 3 0375 50 45
4 100 1. 0 2500 5 0500 52
5 150 15 3750 75 0750 54
6 56
2 结果与分析
21 引物退火温度的确定
ISSRPCR反应中的退火温度与引物合成报
告单上的 Tm值紧密相关, 但两者并不一致。该
试验研究中对引物退火温度设 6个温度梯度进
行筛选。以引物 850为例, 分别设置如表 1中所
述的温度进行 ISSRPCR反应, 然后用 2%的琼脂
糖凝胶进行检测 (图 1 )。总的看来低的退火温
度产生的条带较多, 产生的非特异性条带增多。
高的退火温度产生的条带数目较少, 非特异性条
带明显减少。图中可以清晰看到随着退火温度
的提高, 1 500 bp处条带逐渐减弱, 500 bp处条带
则逐渐增强, 当退火温度在 48 时, 对应的 2泳
道条带数量和亮度合适, 弱带较少, 较为适合进
行结果分析。
M. m ark; 1- 6.对应退火温度 ( )依次为 46, 48, 50, 52, 54, 56
图 1 退火温度对 PCR扩增结果的影响 (引物 850)
130
2010年第 9期 程文杰等:大薯 ISSRPCR反应体系的优化
22 ISSRPCR反应中循环数目的确定
ISSRPCR反应中循环数目与底物浓度、Taq酶
耐热活性等有关。一般的 ISSRPCR反应中大多采
用 35个循环,在该试验中设置 3个不同的循环数目
进行优化。图 2中可以清晰看到泳道 1中当反应循
环数为 25个时基本上检测不到产物条带, 泳道 2中
当反应循环数目为 35个时, 出现一些条带但不清
晰,泳道 3中当反应循环数为 45个时,可以检测到
清晰明亮的条带产生。所以确定 ISSRPCR反应的
循环数目为 45个。
M. m ark; 1 - 3.对应表 PCR循环数依次为 25, 35, 45
图 2 反应循环数对 PCR扩增结果的影响 (引物 850)
23 模板 DNA浓度的确定
模板 DNA的浓度对 ISSRPCR反应有一定的影
响。试验采用引物 850, 模板 DNA浓度设 5个梯度
(表 1)。由图 3可以清晰地看出随着模板 DNA浓
度的增大 1 500 bp处条带逐渐减弱,而 800 bp处条
带逐渐增强,当模板 DNA浓度在 20 ng, 40 ng, 60 ng
之间时,对应的 1, 2, 3泳道扩增出的条带数量亮度
适宜。经过对比在试验中选择 60 ng作为模板 DNA
浓度。
24 引物浓度的确定
ISSRPCR反应的引物是哥伦比亚大学 (UBC )
生物技术实验室开发的一套 (共 100条 ) ISSR引物。
这套引物广泛适用于真核生物类群, 尤其在高等植
物中运用居多 [ 3]。试验结果图 4中表明, 当引物浓
度 02 mo l/L水平时, 对应的 1泳道得不到扩增条
带, 引物浓度在 05 mo l/L和 08 mo l/L时, 对
应的 2, 3泳道得到的引物条带以大片段为主, 而
当引物浓度为 1. 0 mo l/L时, 对应的 4泳道可以
得到较为理想的条带。在该试验中采用引物浓度
为 1. 0 mo l/L。
M. mark; 1 - 5.对应模板 DNA用量 ( ng)依次为 20, 40,
60, 100, 150
图 3 模板 DNA浓度对 PCR扩增结果的
影响 (引物 850)
M. m ark; 1- 5.对应引物浓度 ( m ol /L)依次为 02, 05,
08, 1. 0, 15
图 4 引物浓度对 PCR扩增结果的
影响 (引物 850)
25 Mg2+浓度的确定
Mg
2+浓度与 Taq酶的活性有很大关系,试验中
通过对 Mg2+浓度设置 (表 1)的 5个梯度进行筛选。
从图 5中可以看到当 Mg2+浓度为 1250 mmol /L,
1875 mmo l/L时, 对应的 2, 3泳道中扩增效果较
好。还可以看出当 Mg2+ 浓达到 2500 mmol /L,
3750 mmo l/L时,对应的 4, 5泳道的条带逐渐模糊
不清。所以确定 Mg2+浓度为 1875 mmo l/L。
26 Taq酶浓度的确定
Taq酶是 ISSRPCR反应中最关键的因素。从
图 6中可以清晰地看到随着 Taq酶浓度的提高, IS
SRPCR反应的产物条带逐渐模糊变淡, 原因可能
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
是因为非特异性扩增增多, 导致特异性扩增减少。
当 Taq酶用量在 1U和 15U时,对应的 1, 2泳道扩
增产物条带清晰。当 Taq酶用量在 3U, 5U, 75U
时,对应的 3, 4, 5泳道条带变得模糊不清。经过试
验筛选, Taq酶用量确定在 1U。
M. m ark; 1 - 5.对应 Mg2+浓度 (mmo l/L )依次为 0625,
1250, 1875, 2500, 3750
图 5 M g2+浓度对 PCR扩增结果的影响 (引物 850)
M. m ark; 1 - 5.对应 Taq酶用量 (U ) 1, 15, 3, 5, 75
图 6 Taq DNA酶用量对 PCR
扩增结果的影响 (引物 850)
27 dNTPs浓度的确定
dNTPs是 ISSRPCR反应中扩增合成新核苷酸
链的原料, 所以 dNTPs浓度对 ISSRPCR反应结果
影响很大。从图 7可以看出, 当 dNTPs浓度为
0125mmol /L和 0250 mmol /L时, 对应的 1, 2泳
道扩增条带很淡,不能进行读带分析。当 dNTPs浓
度为 0375 mmo l/L和 0500 mmo l/L时,对应的 3,
4泳道条带清晰,亮度适宜。经过筛选, 确定 dNTPs
浓度为 0500mmol /L。
M. mark; 1- 5.对应 dNTPs浓度 ( mm ol /L) 0125, 0250,
0375, 0500, 0750
图 7 dNTPs浓度对 PCR扩增结果的
影响 (引物 850)
28 ISSRPCR反应体系的验证
通过对以上 ISSRPCR反应体系各因素的优化
试验,确定 ISSRPCR反应体系为: 20 L大薯 ISSR
PCR反应体系中包括: 60 ng模板 DNA, 1. 0 mo l/L
的引物, 1U 的 Taq 酶, 1875 mmo l/L 的 Mg2+ ,
0500mmo l/L的 dNTPs, 2 L的 10 ! Bu ffer, 加水至
20 L。反应程序: 94 预变性 5 m in; 每个循环 94
变性 45 s,特定温度下退火 45 s, 72 延伸 13m in, 45
个循环; 72 延伸 10m in。扩增后 PCR产物在 4 保
存。图 8中反应的是同一引物对不同材料在该体系
下的扩增结果;图 9中是不同引物对同一材料在该体
系下进行扩增的结果。从两张图中可以清晰地看出,
该体系对于不同大薯材料和不同引物的扩增稳定,条
带清晰,适合进行 ISSRPCR反应。
M. m ark; 1- 10.对应为 Da1- Da10材料在 ISSRPCR体
系的扩增结果
图 8 不同材料在 ISSRPCR
体系下的扩增效果 (引物 850)
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2010年第 9期 程文杰等:大薯 ISSRPCR反应体系的优化
M. m ark; 17. 对应为引物 815, 823, 827, 836, 841, 850,
864对材料 4的扩增结果
图 9 不同引物在 ISSRPCR体系下的
扩增效果 (材料 D a1)
3 讨论与结论
PCR反应是 ISSR检测过程中一个重要环节,建
立稳定的 PCR反应体系是筛选 ISSR引物和进行
ISSR多态性研究的基础。试验表明, 模板 DNA用
量,引物浓度, Taq酶的量, dNTPs浓度, M g2+浓度,
PCR反应循环数对 ISSRPCR反应都有不同程度的
影响。其中 Taq酶的量, dNTPs浓度, M g2+ 浓度对
ISSRPCR反应结果影响较大,其浓度过高会产生过
多的非特异性条带, 导致主带不亮, 弱带增多, 不利
于进行结果分析。对于不同的引物, 要单独进行退
火温度的筛选, 此外,引物的退火温度对 PCR扩增
影响较大,温度过低导致不完全配对的位点得到扩
增,产生部分非特异性片段, 相反温度过高, 则引物
与模板难结合,扩增反应受抑制,扩增片段减少。考
虑到提高退火温度可增强反应的特异性, 所以在适
宜的范围内, 可适当提高退火温度, 以保证 PCR的
稳定性。PCR反应循环数对于 ISSRPCR结果也有
显著影响。循环数目较少时,扩增不够完全,得到的
条带不够清晰,当适当增加循环数目时,可以得到更
为明亮清晰的条带。
本研究以大薯 1号材料为试验材料, 采用 850
引物 (UBC )对 ISSRPCR反应体系中的引物退火温
度, ISSRPCR 循环数, 模板 DNA 用量, dNTPs、
M g
2 +、引物浓度和 Taq DNA聚合酶用量进行了分
析,确定出 20 L大薯 ISSRPCR反应体系中包括:
60 ng模板 DNA, 1. 0 mo l/L的引物, 1U的 Taq酶,
1875mmo l/L 的 Mg2+ , 0500 mmo l/L的 dNTPs, 2
L的 10 !Buffer,加水至 20 L。反应程序: 94 预
变性 5m in;每个循环 94 变性 45 s, 特定温度下退
火 45 s, 72 延伸 13m in, 45个循环; 72 延伸 10
m in。扩增后 PCR产物在 4 保存。该体系经过不
同引物以及不同材料重复试验,稳定性可靠。
此外,在试验过程中,其它因素如试验人员操作
技术水平、试验材料和试剂的来源、PCR仪的类型
都可能对扩增效果产生一定的影响 [ 15]。因此,在试
验中,尽量由单独试验人员, 选用同一厂家, 同一批
次的试剂,相对固定的试验器材进行试验研究,以减
少试验误差。
参 考 文 献
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(下转第 153页 )
133
2010年第 9期 帖卫芳等:甘草内生真菌的分离及鉴定
可以得出结论: 甘草内生白色真菌属于 Fusarium
属;甘草褐色真菌属于 G ibberella属。内生菌和寄主
之间存在着代谢相关的基因信号交流, 这对于植物
的生长与发育关系十分密切 [ 5, 9 ] , 我们将在现有工
作的基础上做进一步研究。且内生真菌资源的有效
利用对于植物资源的保护有重要的意义, 需要我们
更加深入的研究。
致谢: 本研究在获得甘草材料的过程中得到了新疆农科
院微生物研究所杨新平先生的帮助,在此表示诚挚的感谢。
参 考 文 献
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