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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
麦冬 OjRCA基因植物表达载体的构建
郭天麒1 李聪1 王英博1 韩烈保1，2
(1北京林业大学草坪研究所暨森林培育与保护省部重点实验室，北京 100083;
2长江大学园艺园林学院，荆州 434025)
摘 要: Rubisco活化酶(RCA)对光合关键酶 Rubisco具有重要的调节作用。以植物表达载体 pBI121 为基础，设计分别
带有酶切位点 SmaⅠ和 SacⅠ的一对特异引物，以麦冬叶片总 RNA反转录得到的第一条 cDNA链为模板，扩增得到目的基因
OjRCA。用 SmaⅠ和 SacⅠ双酶切目的基因及表达载体 pBI121，回收后利用 T4 DNA 连接酶连接，获得植物表达载体 pBI121-
OjRCA。通过冻融法将所获得的植物表达载体导入根癌农杆菌 EHA105 菌株中，为该基因的功能鉴定及通过农杆菌介导法将
OjRCA基因导入植物提高相关抗性提供参考。
关键词: 麦冬 OjRCA基因 植物表达载体
Construction of Plant Expression Vector of the
Lilyturf(Ophiopogon japonicus)OjRCA Gene
Guo Tianqi1 Li Cong1 Wang Yingbo1 Han Liebao1，2
(1 Institute of Turfgrass Science ＆ Key Laboratory of Silviculture and Conservation of Ministry of Education，Beijing Forestry University，Beijing 100083;
2College of Gardening and Horticulture，Yangtze University，Jingzhou 434025)
Abstract: Rubisco activase is a ubiquitous enzyme for the activation of Rubisco in photosynthesis． Lilyturf(Ophiopogon japonicus)
Rubisco activase(OjRCA)was amplified using specific primers containing restriction enzyme site of SmaⅠand SacⅠPCR products and
the plant expression vector pBI121 were digested by the corresponding restricted enzymes respectively，and linked by T4 DNA ligase．
The resulting construction with OjRCA was named pBI121-OjRCA． The pBI121-OjRCA was transferred into Agrobacterium tumefaciens
strain EHA105 with freeze-thaw method for the following-up research such as gene functional identification and gene transformation for
other plants stress tolerance improvement．
Key words: Lilyturf OjRCA gene Plant expression vector
收稿日期:2011-01-20
基金项目:国家“863”计划项目(2009AA10Z109)
作者简介:郭天麒，男，硕士研究生，研究方向:草坪草育种;E-mail:guotianqi03@ yahoo． com． cn
通讯作者:韩烈保，男，教授，研究方向:草坪草育种;E-mail:hanliebao@ 163． com
光合关键酶核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶 /加氧
酶(Ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase /oxygen-
ase，Rubisco)是催化光合代谢中 CO2固定和光呼吸
最初步骤的酶，占植物叶片可溶性蛋白的 50%或
更多，因此，提高 Rubisco 活力是提高光合作用的
重要途径［1］。然而，研究表明，Rubisco 酶在植物
体内存在钝化状态［2］，其起催化作用的赖氨酸残
基位点经常被 RuBP 等多糖物质封闭［3］。因此，
Rubisco酶在植物体内的活化机制一直是光合作用
研究的一个热点问题。直至 Salvucci 等［4］报道发
现了一种新的酶类———Rubisco活化酶(Rubisco ac-
tivase，RCA) ，Rubisco在植物体内的活化过程才逐
渐清晰。钝化状态的 Rubisco 需要经过 RCA 的活
化才能表现出其羧化 /加氧活性。人们用 RCA 抗
体作标记，发现 RCA 普遍存在于高等植物(包括
C3 和 C4 植物)、绿藻、部分蓝细菌和古细菌之中，
这说明依赖于 RCA 的 Rubisco 活性调节机制广泛
存在于光合生物中［5］。随后，各国科学家在拟南
芥、菠菜、大麦、水稻、棉花、小麦和甘薯等十几种
植物当中都分离出 RCA 基因［6 － 12］，并通过对这些
2011 年第 4 期 郭天麒等:麦冬 OjRCA基因植物表达载体的构建
基因及其蛋白质的比较分析发现 RCA的结构主要
包括 3 部分:信号肽区、Rubisco 识别区以及 AT-
Pase功能区。随着近年来对 RCA 不断深入研究，
人们发现与 Rubisco 相比 RCA 更易受到环境因子
的调控。如植物在高温胁迫条件下，体内所含
RCA的特性直接影响其自身光合作用的稳定
性［13］。Pelloux等［14］发现氧化胁迫可使松树中 RCA
mRNA表达量明显降低。植物体内 RCA 含量多少
还可能与其抗虫性高低有着密切联系［15］。因此，进
一步研究植物体内 RCA 的结构和功能对提高植物
抗性具有重要意义［16］。
麦冬(Ophiopogon japonicus) ，是百合科沿街草
属多年生常绿草本，原产中国，具有极强的抗逆性
(抗旱、抗寒和耐高温等) ，可以为园林植物的改良
提供优良的抗性基因资源［17］。本课题组在建立乙
烯诱导的麦冬全长 cDNA 文库的基础上［18］，利用
PCR技术，已从麦冬当中分离得出 RCA 基因，并命
名为 OjRCA。本研究旨在构建该基因的植物表达
载体，并通过冻融法将其导入根癌农杆菌 EHA105
中，以用于下一步的遗传型转化及 OjRCA 基因的功
能验证。
1 材料和方法
1． 1 材料
1． 1． 1 植物材料 麦冬(Ophiopogon japonicus)为
栽培种，种植于北京林业大学草坪研究所实验站。
采摘生长 3 个月的新鲜麦冬叶片，于液氮速冻，
－80℃保存备用。
1． 1． 2 菌株和载体 根癌农杆菌 EHA105、植物表
达载体 pBI121 由本实验室保存。大肠杆菌(E． co-
li)DH5α 感受态细胞、克隆载体 pEASY-T1 Simple
Cloning Kit购自全式金生物技术有限公司。
1． 1． 3 酶和试剂 反转录试剂盒、限制性内切酶、
T4 DNA连接酶均购自 Promega 公司，Trizol 总 RNA
提取试剂、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、
PCR产物纯化试剂盒购自 TIANGEN 公司，卡那霉
素、氨苄青霉素、利福平均为国产试剂，其余试剂为
进口或国产分析纯。
1． 1． 4 培养基 LB培养基(胰蛋白胨 10 g /L、酵母
提取物 5 g /L、NaCl 10 g /L，pH7． 0)、YEB 培养基
(胰蛋白胨 5 g /L、酵母提取物 1 g /L、牛肉膏 5 g /L、
MgSO4 0． 5 g /L、蔗糖 5 g /L，pH7． 0) ，固体培养基另
加琼脂粉(Agar)7 g /L。
1． 2 方法
1． 2． 1 PCR 引物设计与合成 根据本课题组克
隆的麦冬 OjRCA 基因序列，应用 Primer Premier
5． 0软件分析设计一对特异引物。上游引物 ORL 序
列:CCCGGGGTTATCACTTATCAGATGGC;下游引物
ORR 序列:GAGCTCGGCAGCTTTCCCTTAGAACTTT，
划线部分为上、下游引物引入的 Sma Ⅰ和 Sac Ⅰ酶
切位点。引物合成委托北京奥科生物技术有限公司
完成。
1． 2． 2 麦冬叶片总 RNA 的提取 采用 Trizol 法提
取麦冬新鲜叶片中总 RNA。通过紫外分光光度计
测 260 nm和 280 nm处的吸收值，检测 RNA的产量
和纯度。
1． 2． 3 OjRCA 基因的扩增 取 5 μg 总 RNA 做模
板，加入 50 μmol /L Oligo(dT)20 引物 1 μL，加
10 mmol /L dNTP 2 μL，灭菌无 RNase 水 5 μL，70℃
变性 5 min，迅速放在冰上 5 min。然后依次加入5 ×
cDNA buffer 4 μL、0． 1 mol /L dTT 1 μL、15 U /μL反
转录酶 M-MLV 1 μL、40 U /μL RNase-out 1 μL，反应
程序:42℃，50 min;60℃，10 min;70℃，10 min;
85℃，5 min;4℃，5 min。反应结束后，加 RNase H 1
μL，37℃反应 30 min，－ 20℃保存备用。
以合成的 cDNA 第一条链为模板，ORL和 ORR
为引物，进行 PCR 扩增。PCR 扩增反应体系:cDNA
1． 0 μL，Taq Mix 12． 5 μL，上下游引物各 1． 0 μL，加
ddH2O 至 25 μL。PCR扩增反应程序:94℃预变性 5
min;94℃变性 30 s，56℃复性 30 s，72℃延伸60 s，35
个循环;72℃延伸 10 min，4℃保存。
1． 2． 4 植物表达载体构建 用 SmaⅠ和 SacⅠ双
酶切所扩增的 OjRCA 基因和表达载体 pBI121，回
收目的片段并用 T4 DNA 连接酶连接，得到重组质
粒 pBI121-OjRCA(图 1)。转化大肠杆菌 DH5α，
在含有 50 μg /mL的卡那霉素的 LB 培养基上筛选
重组子。提取重组质粒，进行 PCR 检测和酶切
鉴定［19］。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
图 1 pBI121-OjRCA植物表达载体的构建
1． 2． 5 农杆菌的转化及 PCR 鉴定 采用冻融
法［20］将植物表达载体 pBI121-OjRCA转化至根癌农
杆菌 EHA105 感受态细胞中，将菌液涂布于含有卡
那霉素、利福平的 YEB 固体培养基上，于 28℃条件
下培养 2 － 3 d，挑取单菌落摇菌，提取质粒并进行
PCR检测。
2 结果与分析
2. 1 目的基因 OjRCA克隆
以麦冬总 RNA反转录合成的 cDNA 第一条链为
模板，利用所设计的引物 ORL和 ORR进行目的基因
的 PCR扩增产物，经 1． 0%琼脂糖凝胶电泳，获得大
小约为 1 350 bp 的扩增条带(图 2) ，与预期大小相
一致。
M． DL2000 DNA Marker;1－ 3． OjRCA基因的 cDNA
图 2 OjRCA PCR 扩增
2． 2 目的基因 OjRCA基因表达载体的构建
同时对扩增的 PCR产物及表达载体 pBI121 进
行 SmaⅠ和 SacⅠ双酶切，然后利用 T4DNA 连接酶
进行连接，再将连接产物转入大肠杆菌中。对重组
质粒进行 PCR检测获得约 1 350 bp 的片段(图 3) ，
进行双酶切得到片段长度约为 10 000 bp 的 pBI121
载体片段和 1 350 bp的 OjRCA片段(图 4)。另外，
测序结果也表明，重组质粒插入的外源片段与目标
基因序列一致。上述结果证实，OjRCA 基因已经成
功构建到表达载体 pBI121 中，命名为 pBI121-OjR-
CA。
1，2． 重组质粒 pBI121-OjRCA 的 PCR;M． DL2000 plus
DNA Marker
图 3 重组质粒 pBI121-OjRCA的 PCR检测
1－ 3． SmaⅠ和 SacⅠ双酶切重组质粒 pBI121-OjR-
CA;M． 1 kb DNA Ladder
图 4 重组质粒 pBI121-OjRCA的酶切鉴定
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2011 年第 4 期 郭天麒等:麦冬 OjRCA基因植物表达载体的构建
2． 3 植物表达载体 pBI121-OjRCA转化农杆菌 EHA105
采用冻融法将构建的表达载体 pBI121-OjRCA
转入农杆菌 EHA105，PCR检测重组质粒，经琼脂糖
电泳检测，获得与克隆载体一样的大小约 1 350 bp
的目的条带(图 5) ，证明含有目的基因 OjRCA 的表
达载体已成功转入农杆菌中。
M． DL2000 plus DNA Marker;1－ 3．农杆菌中
pBI121-OjRCA质粒的 PCR鉴定
图 5 pBI121-OjRCA表达载体转化农杆菌
EHA105 重组质粒的 PCR检测
3 讨论
在构建植物表达载体的研究中，组成型启动子
被广泛应用，绝大多数双子叶转基因植物均使用
CaMV35S启动子，在组成型表达启动子的控制下，
外源基因在转基因植株的所有部位和所有发育阶段
都有表达。pBI121 是一种常用的植物表达载体，含
有 CaMV35S启动子和 Nost终止子。从 pBI121 物理
图谱可知，pBI121 多克隆位点含有限制性内切酶
SmaⅠ和 SacⅠ位点，说明载体 pBI121 能被 SmaⅠ
和 SacⅠ酶切成粘性末端。利用 DNAMAN 软件分
析 OjRCA基因，可知该光合基因不含限制性内切酶
SmaⅠ和 SacⅠ的位点，因此，用 PCR的方法在 OjR-
CA基因两端加上 SmaⅠ和 SacⅠ位点，酶切后形成
粘性末端，能成功地与 pBI121 连接。在 pBI121 启
动子和终止子之间含有 GUS 报告基因，由于 GUS
基因上下游分别含有 SmaⅠ和 SacⅠ酶切位点，因
此，在构建植物表达载体时，OjRCA 基因被定向插
入到 CaMV35S启动子下游，同时 GUS 基因被切除，
避免了融合蛋白的形成。
农杆菌介导的植物表达系统是一种高效的外源
蛋白表达系统，广泛用于转基因烟草的研究中。为
了利用农杆菌介导在烟草中表达 OjRCA 基因，该试
验将重组质粒 pBI121-OjRCA 转入农杆菌 EHA105
中，为下一步农杆菌侵染烟草并在烟草中表达 OjR-
CA基因做好充分的准备。为了检测植物表达载体
是否导入农杆菌中，该试验采用菌液 PCR检测的方
法，鉴定结果与酶切后结果完全一致，所以在 PCR
条件控制严格的情况下，简易的 PCR可以作为植物
表达载体是否成功导入农杆菌的依据［21］。
光合作用稳定性是衡量植物抗逆性的重要指标
之一，提高植物的光合作用稳定性一直是转基因植
物研究的一个热点问题。重组质粒 pBI121-OjRCA
的成功构建为进一步通过转基因技术培育光合稳定
性高的植物品种奠定基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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